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Domesticar microorganismos

en un biorreactor: los retos


del bioingeniero
Enrique Galindo, Carlos Peña y Leobardo Serrano-Carreón

Los microorganismos (bacterias, levaduras y fuera de su ambiente natural, como es el caso de


hongos principalmente) crecen en el suelo, so- los cultivos en biorreactores (o fermentadores),
bre nuestra piel, en nuestro intestino, en el mar implica conocer y proveer las condiciones favo-
y hasta en los volcanes submarinos y en los gla- rables para su crecimiento y para la generación
ciares. Los microbios (y en particular las bacte- de productos celulares de interés. Es decir, el
rias) están en prácticamente todos lados y son desarrollo de un proceso fermentativo requiere
necesarios sobre todo para la descomposición necesariamente del aprendizaje de cómo pro-

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de la materia orgánica en la tierra. Los microbios veer los estímulos necesarios para que las célu-
en general tienen una vida muy dura, ya que la las trabajen en nuestro beneficio, lo que podría
comida (los nutrientes o sustratos) casi siempre denominarse una “domesticación” de ellas.
escasea en la naturaleza. Los biotecnólogos (y En nuestro laboratorio1 nos ha interesa-
en particular los bioingenieros) han hecho po- do cultivar microbios (para sacarles el mayor
sible hacer crecer a los microbios en recipientes “jugo” posible) en fermentadores, tanto pe-
en donde es posible proporcionarles todo lo que queños de laboratorio, como industriales de
necesitan, o bien darles sólo los nutrientes ne- gran tamaño. Nos interesa lo que pasa dentro
cesarios (o no darles otros) de tal manera que del fermentador, porque al saberlo podemos
produzcan lo que nosotros queremos que pro- intentar controlar el ambiente inmediato que
duzcan (y casi siempre en cantidades y veloci- experimentan los microorganismos y, así, hacer
dades que son mucho más grandes que las que que rindan lo que esperamos de ellos. Una re-
ocurren en la naturaleza). De eso se trata funda- gla básica de la tecnología de fermentaciones
mentalmente la llamada tecnología de fermen- indica que si uno cuida a sus microbios (procu-
tación: cultivar artificialmente a los microbios rándoles su ambiente óptimo), ellos cuidarán
bajo condiciones controladas y casi siempre en de uno (produciendo compuestos o biomasa de
grandes cantidades. Cultivar células microbianas utilidad para los humanos).

1
Página del Grupo de Investigación: http://pbr322.ceingebi.unam.mx/∼Geg/

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Hemos domesticado microbios con varios tuación es muy diferente. Estos hongos crecen
propósitos. En un caso, nos interesa producir en largos filamentos (llamados hifas), que pue-
los propios microbios vivos en altas cantidades den aglomerarse en colonias densas llamadas
para usarlos como enemigos naturales de otros pellets y, por lo tanto, afectan dramáticamente
microbios que causan enfermedades en las las condiciones de mezclado del sistema. Para
plantas. Más adelante contaremos la historia entender estos sistemas de fermentación de
de cómo hemos cultivado bacterias, levaduras alta complejidad, hemos usado como modelo
y hongos que son útiles para controlar enfer- de estudio la producción de aromas frutales (o
medades del mango y del jitomate. En otros ca- fungicidas) por el hongo Trichoderma harzia-
sos, nos ha interesado cultivar microbios bajo num. Este hongo es también un potente agen-
condiciones particularmente difíciles desde el te biológico para controlar enfermedades de
punto de vista de suministro de nutrientes. Se plantas ocasionadas por otros hongos, de los
trata de bacterias que producen polímeros, los cuales Trichoderma es enemigo natural. Otra
cuales se usan como viscosificantes en varia- vez, como al microbio sólo le importa lo que
das aplicaciones (por ejemplo, en los aderezos pasa cerca de él, nos hemos concentrado en es-
para ensaladas). Estos polímeros, tan útiles en tudiar este proceso en el nivel microscópico. Así
sus aplicaciones, complican el cultivo de los mi- que nos las ingeniamos para ver y fotografiar lo
crobios, ya que elevan la viscosidad del caldo de que está pasando dentro del fermentador; esto
cultivo, dificultando el suministro necesario de es, establecer cómo interactúa el hongo con las
oxígeno. Un microbio rodeado de una solución burbujas de aire y con las gotas de aceite que
viscosa, se comporta en forma muy diferente se forman, uno de los nutrientes principales del
a uno que se encuentra suspendido en un lí- hongo.
quido de baja viscosidad, como el agua pura. Y En síntesis, en las páginas que siguen se
ya que al microbio sólo le importa su ambiente mostrará, a través de algunos ejemplos de
inmediato, el reto del bioingeniero es domesti- nuestro laboratorio, la búsqueda y los retos que
car al microbio usando todo tipo de estratage- enfrenta un bioingeniero al desarrollar mejores
mas para lograr que el microbio esté “cómodo” y más eficientes procesos de fermentación.
o “incómodo” en el biorreactor, dependiendo
si la comodidad o la incomodidad es lo que
hace que produzca eficientemente lo que se Los retos del bioingeniero
requiere (más adelante relataremos lo hecho La producción industrial de los derivados de la
para lograrlo). Si esta complejidad debida a la biotecnología ha sido posible en buena medida
viscosidad del caldo no fuera suficientemente gracias al desarrollo de las técnicas de cultivo
retadora, hemos estudiado además procesos celular en gran escala: tecnología de fermenta-
de cultivo en donde la situación es aún mas ción. Dichas técnicas han permitido el estable-
complicada: donde hay más de una fase líquida cimiento de las condiciones para el cultivo de
(la acuosa y además un aceite), y en donde tam- células microbianas, vegetales y animales, para
bién hay una fase sólida que tiene un tamaño la síntesis de toda una gama de metabolitos de
suficientemente grande como para complicar interés en los diferentes sectores de la indus-
los fenómenos de suministro de oxígeno (y de tria (química, farmacéutica, textil, de alimen-
otros nutrientes) dentro del biorreactor. Cuan- tos, etc.). El corazón de estas técnicas de cultivo
do las células microbianas son muy pequeñas es el fermentador o biorreactor, que es el reci-
(como en el caso de las bacterias y las levadu- piente en donde se promueve el crecimiento de
ras), su tamaño no causa problemas para dis- organismos para la síntesis de diversos produc-
persarse o para homogenizar el sistema y pro- tos biotecnológicos. La función principal de un
veer oxígeno suficiente al cultivo. Sin embargo, fermentador es la de proveer un ambiente con-
cuando se trata de hongos filamentosos, la si- trolado para alcanzar el crecimiento y la forma-

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ción óptima de productos, o ambos. Además, geno al cultivo (en procesos aerobios) y el otro
el fermentador tiene como objetivo garantizar mantiene cierta homogeneidad en los pará-
una condición estéril, que permita únicamente metros fisicoquímicos.2 En los fermentadores
el cultivo de la especie biológica de interés. de laboratorio, la satisfacción de la demanda
Los fermentadores pueden variar en tama- de oxígeno y un mezclado eficiente pueden lo-
ño, desde 0.1-10 L (laboratrio) hasta 400,000 grarse sin mayor dificultad. Pero a mayor escala
L (industrial). Las dimensiones del fermenta- el proceso se complica. A medida que se incre-
dor dependen de su proceso y operación. Por menta el tamaño del equipo, se incrementan
ejemplo, los cultivos celulares operados en lote las diferencias de los parámetros de cultivo y la
(sistemas de cultivo en donde sólo se adicionan presión hidrostática cambia drásticamente. Lo
nutrientes al principio de la fermentación y el anterior puede llevar a graves consecuencias en
volumen se mantiene constante), requieren el rendimiento y calidad del producto o meta-
fermentadores mayores a los que se usan en bolito de interés. La problemática se complica
los cultivos continuos o semi-continuos (sis- cuando la viscosidad del cultivo aumenta signi-
temas con adición continua de nutrientes y ficativamente como resultado de la producción
volumen variable). A nivel de investigación, el de polímeros o por el incremento en la masa
fermentador más empleado, tanto en la acade- celular (cultivos de hongos filamentosos).
mia como en la industria, es el matraz. Se usa La viscosidad es una medida de la capacidad
ampliamente para la evaluación y desarrollo de que un material tiene para fluir. El agua, que es
diversos cultivos celulares. Una ventaja de los el componente mayoritario de los medios en
matraces agitados, es que se pueden llevar a donde se cultivan los microorganismos, tiene
cabo un gran número de experimentos para es- baja viscosidad. Muchos productos que usamos
tablecer el efecto de los diferentes componen- en la vida cotidiana tienen alta viscosidad (la
tes del medio de cultivo sobre el crecimiento salsa catsup, algunos aderezos, la mayonesa).
y rendimiento de los microorganismos. Por su De hecho, la alta viscosidad de estos productos
parte, los fermentadores industriales presen- se debe a que se les ha agregado un polímero (o
tan un alto grado de equipamiento, incluyendo goma) que produce un microorganismo por fer-
sistemas de agitación y dispersión de aire para mentación. Otros productos, como los refrescos
garantizar una buena oxigenación del medio y que contienen pulpa de alguna fruta, también
un eficiente mezclado, así como sensores para son viscosos. Sin embargo, en este caso, la vis-
conocer el cambio de las variables del cultivo cosidad se debe a la presencia de sólidos (de la
tales como: la temperatura, el oxígeno disuelto, fruta) suspendidos en una solución acuosa. Lo
el pH, la concentración celular, entre otros. mismo sucede cuando un microorganismo fila-
En los últimos años se han logrado avances mentoso (que es una partícula sólida suspendi-
significativos en el diseño de los fermentadores, da) se cultiva en fermentadores y se reproduce
así como en el grado de control que se ejerce al grado de aumentar su concentración en el
durante el proceso de fermentación, abriendo medio de cultivo y tornarlo viscoso.
la posibilidad del cultivo de toda una variedad Los cultivos microbianos, ya sea que pro-
de organismos, particularmente aquellos que duzcan polímeros o que desarrollen altas con-
han sido modificados genéticamente. centraciones de biomasa miceliar, tienen una
La aireación y el mezclado son las operacio- característica peculiar: su viscosidad depende
nes más importantes que se busca satisfacer de cómo se agita o se pone en movimiento el
en el fermentador pues una proporciona oxí- fluido. Usualmente, mientras más se agite un

2
Galindo, E., “Aspectos de Ingeniería en fermentaciones: cómo mezclar gases, líquidos y sólidos”, en Descubrimientos y
aportaciones científicas y humanísticas mexicanas en el siglo veinte, Academia Mexicana de Ciencias, 2007.

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caldo de fermentación conteniendo polímeros xantana por una bacteria llamada Xanthomo-
o biomasa miceliar, menor será su viscosidad. nas campestris (la cual produce enfermedades
Por ello, se dice que se trata de una viscosidad en ciertas plantas precisamente por su capaci-
“aparente”, ya que no se puede definir un valor dad de generar alta viscosidad de sus solucio-
específico de ella si no se conocen exactamen- nes, pero es inocua para el hombre). La xantana
te las condiciones bajo las que se está agitan- se usa ampliamente en varias industrias, inclu-
do el fluido, lo que se conoce como velocidad yendo la alimentaria, farmacéutica y petrolera,
de deformación, y la cual depende de la veloci- en donde se emplea como aditivo viscosifican-
dad de rotación del sistema de agitación y de te (pero adelgazante). Entre los aspectos que
su geometría. Esta propiedad adelgazante de hemos estudiado se encuentra el uso de varias
los fluidos explica en parte porqué son muy geometrías de elementos de agitación (llama-
útiles ciertas soluciones de polímeros. Cuando dos impulsores) para lograr mezclar eficiente-
la salsa catsup, por ejemplo, está en la botella mente, y al menor consumo energético posible,
(en reposo y sin deformación alguna) su vis- el caldo viscoso (el cual incrementa su viscosi-
cosidad es muy alta y no sale fácilmente. Para dad aparente hasta en 10 000 veces en el trans-
que fluya, habitualmente golpeamos la botella curso de un cultivo).3 Hemos encontrado, por
(aumentamos la velocidad de deformación) ejemplo, que son más eficientes los impulsores
y entonces logramos que la salsa salga. Espe- de diámetro grande (aunque de giro lento) que
ramos de una buena catsup que tenga consis- los pequeños (de giro rápido), que son lo que se
tencia (viscosidad) para que no se desparrame usan en la mayor parte de los procesos de fer-
por todo el plato. Esta propiedad, que se llama mentación industrial. También hemos encon-
técnicamente pseudoplasticidad, es muy útil en trado que impulsores de diseños en forma de
muchas otras aplicaciones (en los fluidos de “ventilador” son más eficientes para mezclar
perforación de pozos petroleros, en la aplica- el fluido y lograr dispersar el aire (que contie-
ción de agroquímicos por medio de avionetas, ne oxígeno, necesario para la respiración de la
en los lápices labiales, etc.). bacteria).
La alta viscosidad y el hecho de que su com- Las células dentro de un biorreactor pueden
portamiento sea pseudoplástico es una ventaja tener diferentes comportamientos, tanto en su
en varias de las aplicaciones; sin embargo cons- morfología como en su fisiología, dependiendo
tituye una dificultad técnica importante cuan- de las condiciones hidrodinámicas en las cuales
do lo que se torna viscoso es un caldo de cultivo se cultiven. Así, por ejemplo, en el caso de Azo-
en un fermentador. En estos casos, el trabajo tobacter vinelandii (una bacteria productora de
del bioingeniero es lograr que todo (o la ma- polisacáridos), nuestro grupo ha reportado que
yoría) del volumen del caldo de fermentación en cultivos mal mezclados, tanto en matraces
se encuentre bien mezclado. Si no mezclamos como en fermentadores, la bacteria tiende a
bien el líquido existirán zonas “muertas” (de formar agregados multicelulares, los cuales
poca o nula agitación), lo que conducirá a un incrementan en tamaño conforme el cultivo
menor rendimiento. progresa (figura 1). Durante las etapas finales
de cultivo se han observado agregados de más
de 100 micras, los cuales representan hasta 5%
Microbios en un ambiente viscoso de la población total de bacterias. En contraste,
En nuestro grupo de investigación hemos estu- bajo condiciones de un mezclado más eficiente
diado estos aspectos usando un proceso de fer- (alta velocidad de agitación), la bacteria se de-
mentación que genera muy altas viscosidades sarrolla de manera individual y no se detecta la
del caldo de cultivo: la producción de la goma formación de agregados multicelulares.

3
Galindo, E., “Aspects of the process for xanthan production”, en Food and Bioproducts Processing, núm. 72, 227-237, 1994.

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Figura 1.
Agregados multicelulares de Azotobacter vinelandii.

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Por otra parte, cuando hemos cultivado de 8 mg por cada litro de medio acuoso. En con-
hongos en fermentadores, hemos encontrado secuencia, hay que suministrar continuamente
que la viscosidad del caldo es una función de aire para satisfacer la demanda de oxígeno del
la forma del hongo (generalmente en forma microorganismo. Este proceso se hace más
de agregados, constituidos por largas células complejo e ineficiente cuando la viscosidad del
llamadas hifas) y que estas estructuras pueden caldo se incrementa.
ser dañadas por la acción de los elementos de Por otra parte, hay ciertos cultivos donde es
agitación. En consecuencia, nuestras investiga- necesario incorporar una segunda fase líquida
ciones han permitido establecer, por ejemplo, (además de la fase acuosa). Éste es el caso, por
los valores máximos a los que se puede agitar ejemplo, cuando la fuente de carbono para el
un sistema, sin dañar las células del hongo, microorganismo proviene de un aceite. En vis-
pero manteniendo una alta productividad del ta de que el aceite es insoluble en agua, debe
producto que nos interese (por ejemplo un an- dispersarse, en forma similar a lo que se tiene
tibiótico o un aroma frutal). que hacer con el aire. El reto del bioingeniero
es entonces lograr que el aceite se disperse en
el mayor número de gotas del menor tama-
El biorreactor bajo la lupa ño posible, con el fin de maximizar el área de
El fermentador (o biorreactor) tiene dos objeti- transferencia. Así, el microorganismo podrá
vos primordiales: a) proporcionar oxígeno a las asimilar los componentes del aceite de una
células que se están cultivando en suspensión y forma más eficiente. En nuestro laboratorio
b) mantener las condiciones ambientales bási- hemos usado, como modelo de estudio de es-
cas (como temperatura, oxígeno disuelto y pH) tos sistemas, el proceso de fermentación para
en los niveles que sean óptimos para la produc- la producción de aromas frutales por el hongo
ción del metabolito de interés. Para lograr esto, Trichoderma harzianum. En este caso, la fuen-
un fermentador típico tiene, en primer lugar, te de carbono es aceite de ricino, el cual hay
que dispersar un gas (aire, que contiene oxíge- que dispersar, junto con el aire y la biomasa,
no) en un líquido (normalmente agua, en la que en la fase acuosa.
se disuelven otros nutrientes esenciales, como Si bien la dispersión del aire y el aceite es un
azúcares y proteínas). Esto se logra burbujean- proceso que se lleva a cabo macroscópicamen-
do aire (que ha sido previamente filtrado para te por los impulsores, al microorganismo lo
evitar introducir contaminaciones al cultivo) único que verdaderamente le importa es su mi-
dentro del tanque fermentador y dispersan- crocosmos inmediato. Es por ello que una par-
do el gas dentro del medio acuoso, mediante te de nuestros esfuerzos de investigación los
el uso de impulsores que rompen las burbujas hemos dedicado a estudiar cómo se comporta
de gas (que se está inyectando al tanque) en un sistema multifásico en el nivel microscópi-
burbujas lo más pequeñas posibles. Lo anterior co. Para ello, lo primero que hemos hecho es
tiene el propósito de maximizar el área super- desarrollar instrumentos que nos permitieran
ficial que el gas tiene en contacto con el líqui- ver lo que estaba pasando dentro del tanque.
do (para una misma cantidad total de gas, un El principal problema técnico reside en el he-
conjunto de burbujas pequeñas tienen mucho cho de que las dispersiones suceden a veloci-
más área que una burbuja grande). Esto es muy dades muy altas. Para resolver este problema,
importante, ya que mientras el área disponible hemos empleado dos estrategias: usar una luz
sea mayor, más fácil y eficiente será transferir estroboscópica (esto es, un flash que centellea
el oxígeno de las burbujas de gas al seno del lí- en una forma muy rápida) o bien usando una
quido. Hay que tener en cuenta que el oxígeno cámara que es capaz de tomar hasta 5000 fo-
es un gas muy poco soluble, ya que sólo se pue- tos en un segundo. En ambos casos, ello nos
den disolver, a temperatura ambiente, no más permite congelar los eventos que suceden a

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Figura 2.
Burbujas de gas atrapadas en gotas de aceite.

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muy alta velocidad y, por lo tanto, fotografiar- Producción de alginatos bacterianos:


los y luego analizarlos. Para ver los elemen- ingeniería de calidad
tos de la dispersión (esto es, burbujas de gas Desde un punto de vista biotecnológico, los po-
y gotas de aceite), empleamos microscopios lisacáridos (compuestos formados de la unión
acoplados a cámaras de video. Usando estos de azúcares simples), son productos de valor
equipos, además de técnicas que nos permi- agregado relativamente alto cuyo rango de
ten analizar las imágenes obtenidas en forma aplicaciones se extiende cada vez más. En los
automática, hemos podido estudiar y empezar últimos años se ha intensificado el interés en
a entender varios de los fenómenos que ocu- el uso de polisacáridos microbianos, principal-
rren en estos sistemas altamente complejos mente propiciado por las propiedades únicas
de las fermentaciones multifásicas. Por ejem- de estas moléculas (principalmente aquella re-
plo, hemos visto y documentado fenómenos lacionada con su capacidad como agente visco-
muy interesantes que no se habían reportado sificante y formador de geles) y la posibilidad de
antes. Uno de ellos es el hecho de que, bajo obtener un producto con altos rendimientos y
ciertas condiciones —por ejemplo la presencia una calidad constante. Dentro de este contex-
de micelio disperso o pequeñas cantidades de to, nuestro grupo de trabajo se ha enfocado al
proteínas—, una alta proporción de las burbu- estudio de diversos aspectos de la producción
jas de gas se encuentran atrapadas en las go- de polisacáridos microbianos, incluyendo a la
tas de aceite (figura 2). Esto es muy relevante xantana, cuyo ejemplo discutimos anterior-
en términos de la transferencia de oxígeno, ya mente y los alginatos, cuya historia contare-
que el oxígeno contenido en una burbuja de- mos a continuación.
berá primero transferirse al aceite (que es 800 Los alginatos son una familia de exopolisa-
veces más viscoso que el agua) para luego mi- cáridos biológicos constituidos por dos tipos
grar a la fase acuosa, que es de donde el micro- de azúcares: el ácido manurónico (M) y el ácido
organismo lo puede aprovechar. Descubrimos gulurónico (G). Se obtienen de forma natural
también que mientras más biomasa haya, el de algas marinas y también son producidos por
diámetro promedio de las burbujas disminuye, algunas bacterias como Azotobacter vinelan-
lo que hace que el área para la transferencia de dii, la cual se desarrolla de forma natural en el
oxígeno se incremente. Otro fenómeno intere- suelo y tiene la capacidad de fijar el nitrógeno
sante que observamos es que el agua también de la atmósfera. Los alginatos producidos por
se introduce en forma de pequeñas gotitas- en bacterias difieren de los de origen algal en que
las gotas de aceite, lo que hace particularmen- los primeros presentan moléculas de acetilo en
te complejo el fenómeno de dispersión y de los residuos del ácido manurónico.
transferencia de oxígeno. Para entender mejor La importancia de los alginatos radica en su
estos fenómenos, hemos usado dos cámaras capacidad para formar soluciones viscosas y en
en forma simultánea (para obtener visión es- la formación de geles, propiedades que en bue-
tereoscópica, como la de nuestros ojos), lo que na medida determinan la calidad del producto.
nos ha permitido ver en tercera dimensión es- Se puede decir que un producto de buena ca-
tas estructuras y sobre todo determinar sus lidad es aquel que se caracteriza por la forma-
coordenadas en el espacio (véanse detalles en ción de geles flexibles y resistentes. Además, en
el capítulo de Gabriel Corkidi), lo que a su vez la medida que el tamaño de la molécula (medi-
contribuirá a entender y explicar los fenóme- do como el peso molecular) y la proporción de
nos en la forma como realmente suceden en grupos acetilo se incrementan, las soluciones
tres dimensiones, y no sobre lo que se puede en las cuales se resuspende serán más visco-
inferir del fenómeno de su proyección en dos sas. Más recientemente, se ha reportado que
dimensiones, procedimiento que usan las téc- alginatos de bajo peso molecular (oligómeros)
nicas fotográficas convencionales. presentan propiedades inmunológicas impor-

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tantes, por lo que ha despertado el interés de cular impacta directamente en la viscosidad de


la industria bioquímica en desarrollar procesos las soluciones y, por lo tanto, en la calidad del
de optimización en su producción. producto. Hemos encontrado también que la
Una de las desventajas de los alginatos que manipulación de los componentes del caldo de
se obtienen de las algas es su alta heterogenei- cultivo, particularmente aquellos que se usan
dad, ya que presentan un amplio rango de pe- como reguladores del pH del medio, influyen
sos moleculares y distribución de sus azúcares en el porcentaje de grupos acetilos presentes
(G-M). Estas características son prácticamente en la molécula, impactando directamente en
imposibles de controlar en los procesos actua- las propiedades viscosificantes de las solucio-
les, los cuales son altamente dependientes nes de alginato. El conocimiento generado en
de las condiciones ambientales en las cuales nuestro grupo abre nuevas posibilidades en el
crecen las algas, que a su vez definen las ca- diseño de procesos para producir alginatos he-
racterísticas químicas de estos polímeros. En chos a la medida, y por lo tanto de alta calidad
este sentido, los alginatos que se obtienen por y valor agregado, los cuales puedan ser usados
fermentación bacteriana representan una op- en aplicaciones específicas en diversos secto-
ción atractiva para la síntesis de productos con res industriales.
características moleculares específicas, que
puedan ser orientados para su uso en el área
químico-farmacéutica. El estrés y los hongos: el lado positivo
Nuestro grupo de investigación ha estado Todo organismo vivo colocado fuera de su
interesado en el entendimiento de los factores hábitat natural experimenta condiciones am-
del cultivo de Azotobacter vinelandii que deter- bientales que limitan su crecimiento. Un caso
minan la cantidad y sobre todo la calidad del particular es el cultivo de células en biorreac-
alginato producido por la bacteria con el pro- tores, donde las condiciones de cultivo no son
pósito de mejorar el proceso biotecnológico y necesariamente homogéneas (dentro del bio-
lograr eventualmente hacerlo competitivo en rreactor) ni constantes (a través del tiempo).
términos industriales. Principalmente, hemos Durante el cultivo de células en biorreactores
estudiado los efectos de parámetros de cul- se producen cambios en el medio ambiente
tivo, como el oxígeno disuelto, el bióxido de en cuanto a la temperatura, daños mecánicos
carbono, el mezclado, componentes de medio debidos a la agitación, pH, concentración de
de cultivo, así como la evaluación de diferentes oxígeno y nutrientes, etc. Todos estos cambios
cepas mutantes con mejores características dentro del biorreactor “estresan” a las células
para producir alginato. Además, hemos estu- que necesitan adaptarse a dichos cambios para
diado diferentes estrategias para poder llevar poder reproducirse. De manera general, se pue-
el proceso de una escala de laboratorio a un ni- de decir que todo factor que influye negativa-
vel de producción mayor. Una de las aportacio- mente en la capacidad de reproducción de las
nes más relevantes de nuestro grupo es haber células puede considerarse como estrés. Du-
demostrado cómo la concentración de oxígeno rante un cultivo, las células consumen nutrien-
en el medio de cultivo, así como la velocidad a tes para poder reproducirse. Cuando la concen-
la que crecen los microorganismos, determi- tración de alguno o varios nutrientes disminuye
nan de manera importante el tamaño y dis- de tal forma que la velocidad de reproducción
tribución de las moléculas de alginato que se de las células también disminuye, hablamos
producen.4 Hay que recordar que el peso mole- de un estrés de tipo nutricional. Dependiendo

4
Galindo, E., et al., “Molecular and bioengineering strategies to improve alginate and polyhydroxyalkanoate production
by Azotobacter vinelandii”, en Microbial cell factories, 6,7:1-16, 2007.

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de la magnitud y la duración del estrés, éste antibiótico. En este caso se aprovechó la ca-
puede considerarse como subletal, cuando las racterística de Trichoderma harzianum de ser
células son capaces de reproducirse, aunque a un hongo depredador de otros hongos. Debido
una menor velocidad, o letal, cuando el daño es a que la producción de la 6PP por Trichoderma
tan importante que las células mueren. La gran es uno de sus mecanismos de ataque hacia
mayoría de los metabolitos de origen fúngico otros hongos, llevamos a cabo cultivos donde
de uso industrial son metabolitos secundarios; Trichoderma es confrontado con Rhizoctonia
es decir, se producen una vez que el crecimien- solani (hongo fitopatógeno del tomate). En
to celular disminuye o cesa. Así, los factores este caso demostramos que, en presencia de
de estrés son herramientas muy importantes células muertas de Rhizoctonia solani, Tricho-
para el bioingeniero ya que le permiten contro- derma incrementa hasta cinco veces su pro-
lar tanto el crecimiento como la producción de ducción de 6PP.
metabolitos secundarios y, en consecuencia, la El crecimiento de los hongos se lleva a cabo
productividad de los cultivos de hongos fila- en forma de largas cadenas celulares que for-
mentosos. Entre los metabolitos secundarios man una red tridimensional compleja llamada
más importantes producidos industrialmente micelio (similar a la que podemos observar en
por los hongos están los antibióticos (como la las raíces de plantas). Por esta razón los hongos
penicilina) y las enzimas (catalizadores biológi- cultivados en medio líquido, donde se utiliza
cos muy utilizados en la industria). agitación mecánica, pueden sufrir ruptura ce-
El cultivo del hongo filamentoso Trichoder- lular si la energía introducida por la agitación es
ma harzianum (figura 3), para la producción mayor que la resistencia del micelio. A este tipo
de la 6-pentil-a-pirona (6PP), un fungicida de de estrés se le conoce como hidrodinámico. En
amplio espectro, es nuestro modelo de estu- vista de que las condiciones hidrodinámicas
dio para comprender el efecto de los factores (es decir la velocidad y la dirección con que el
del estrés sobre la producción de metabolitos medio de cultivo es mezclado) dentro del bio-
secundarios en cultivos fúngicos.5 El princi- rreactor juegan un papel muy importante en
pal problema tecnológico para desarrollar un el crecimiento y el metabolismo de los cultivos
proceso económicamente viable para la pro- de hongos, hemos estudiado el efecto de este
ducción de 6PP ha sido la toxicidad de la mo- estrés (generado por la agitación) sobre el cre-
lécula hacia el hongo productor (Trichoderma cimiento y la producción de 6PP por Trichoder-
harzianum), hablamos entonces de un estrés ma harzianum. Nuestro grupo demostró que el
químico. Para solucionar este problema adi- estrés hidrodinámico permite modular el creci-
cionamos un aceite (n-hexadecano) al medio miento y metabolismo secundario del hongo.
de cultivo para extraer de manera continua la En condiciones de bajo estrés (baja agitación)
molécula que es poco soluble en el medio de el hongo crece pero produce muy poca 6PP. Al
cultivo (donde crece el hongo) y muy soluble incrementar el estrés (agitación moderada) se
en el aceite. Esto nos permitió incrementar obtuvo un menor crecimiento pero una ma-
la producción de la 6PP por arriba de su con- yor producción de la 6PP. En este contexto, la
centración tóxica, indicando que la adición producción de la 6PP es estimulada cuando el
de hexadecano permitió “liberar” al hongo de microorganismo se encuentra en una situación
este estrés químico. Con este sistema de ex- de estrés (limitación del crecimiento) hidrodi-
tracción se inició el estudio de un factor de es- námico moderado, pero evitando un estrés le-
trés de tipo biológico sobre la producción del tal a altas velocidades de agitación.

5
Serrano-Carreón, L. “Improving biogeneration of aroma compounds by in situ product removal”, en Food Science and
Food Biotechnology, EUA, CRC Press, pp. 219-232, 2003.

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Domesticar microorganismos en un biorreactor: los retos del bioingeniero | 141

Figura 3.
Hongo filamentoso Trichoderma harzianum.

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Estamos estudiando también la interac- biológico de plagas y enfermedades que sean


ción de Trichoderma con Agaricus bisporus y amigables con el medio ambiente y sin ries-
Pleurotus ostreatus, como una estrategia para gos para la salud humana. El control biológico
incrementar la producción de lacasas por éstos es el uso de organismos (y/o sus metabolitos
últimos. Las lacasas son enzimas que degradan o subproductos), que son enemigos naturales
la lignina de los tejidos vegetales, lo que permi- de una plaga o patógeno, con el fin de reducir
te el crecimiento de estos hongos comestibles o eliminar sus efectos dañinos en las plantas
sobre residuos agrícolas. Estas enzimas son úti- y/o sus productos. Es decir, se hace uso de la
les en la degradación de compuestos tóxicos, existencia de los depredadores naturales de
como son los residuos petroleros, pesticidas las plagas o patógenos. Así, la lucha biológica
y colorantes. En este caso, Agaricus bisporus o entre los organismos nocivos para los culti-
Pleurotus ostreatus al ser atacados por Tricho- vos agrícolas y sus depredadores naturales es
derma producen lacasas como un mecanismo el principio básico del control biológico. El de-
de defensa. Hemos demostrado que los co- sarrollo y la aplicación de este potencial de la
cultivos de Trichoderma con Agaricus bisporus naturaleza cobran cada vez mayor importancia
y Pleurotus ostreatus no sólo incrementan la y seguramente tendrán un gran impacto en la
producción de lacasas, también generan la pro- agricultura en el futuro cercano. Hemos traba-
ducción de otros tipos de lacasas no obtenidas jado, desde hace varios años, en el desarrollo de
en los cultivos de Agaricus bisporus o Pleurotus procesos de producción, formulación y secado
ostreatus. de microorganismos antagonistas de hongos
fitopatógenos que atacan algunos de los culti-
vos agrícolas de mayor relevancia en México: el
Guerra biológica a favor del ser humano mango y el jitomate.
En la agricultura comercial contemporánea México es uno de los principales producto-
el combate de plagas y enfermedades es un res y el primer exportador de mango del mun-
problema muy importante; esta actividad lle- do. Una de las enfermedades postcosecha más
ga a representar hasta 20% del costo de pro- importantes que afectan al mango es la an-
ducción o más, dependiendo de la severidad tracnosis, causada por el hongo Colletotrichum
del daño ocasionado a los cultivos. Si bien el gloeosporioides, el cual daña la calidad (produ-
control químico ha sido durante muchas déca- ce manchas negras) y disminuye significativa-
das el método más utilizado para combatir las mente la vida de anaquel (tiempo de comer-
plagas (depredadores, i.e. insectos) y enferme- cialización) del producto. En colaboración con
dades (i.e. hongos) en la agricultura; el empleo investigadores del CIAD-Culiacán se aislaron, se-
intensivo (y a veces desmedido) de productos leccionaron e identificaron diferentes microor-
químicos ha tenido efectos negativos sobre el ganismos (bacterias y levaduras) con actividad
ambiente y la calidad de vida de las poblacio- antagónica contra la antracnosis en mango.6 Se
nes humanas. Además, su eficacia puede ser diseñaron medios de cultivo con componentes
de corta duración, ya que las plagas y los pató- de bajo costo que permitieron lograr cultivos de
genos pueden desarrollar resistencia; es decir, los antagonistas con un alto rendimiento, via-
evolucionan para sobrevivir en presencia de es- bilidad y productividad. Se desarrollaron pro-
tos compuestos. En las últimas dos décadas, se cesos de fermentación sumergida, formulación
ha dedicado un gran esfuerzo de investigación y secado para la producción masiva de células
en la implementación de sistemas de control viables de cada una de las cepas. Los resultados

6
Galindo, E., et al., “Tecnologías para el control biológico de la principal enfermedad del mango (antracnosis) y el efecto
en su calidad poscosecha”, en Claridades Agropecuarias, núm. 148, pp. 56-59, 2005.

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de las pruebas de campo mostraron que los an- da por el hongo Fusarium oxysporum. Nuestro
tagonistas utilizados lograron disminuir la gra- grupo ha desarrollado procesos para la pro-
vedad de la enfermedad (antracnosis) a niveles ducción, formulación y secado de Trichoderma
inferiores a los logrados con el uso de un fungi- harzianum, un hongo depredador de Fusarium
cida químico. Otro aspecto de gran importancia oxysporum, para la obtención de un produc-
radica en el hecho de que los formulados bioló- to con alta concentración de células viables
gicos retrasan la maduración del fruto, alargan- de Trichoderma. La evaluación en campo del
do su vida de anaquel hasta en 25%, sin afectar producto demostró que el producto biológico
sus propiedades organolépticas. Esto ofrece la es capaz de competir con fungicidas químicos
posibilidad al productor de exportar sus frutos para el control de la fusariosis del jitomate. Sin
a mercados más lejanos y con mayor precio de embargo, el resultado más importante de esta
comercialización. evaluación de formulaciones es que el producto
Otra de las enfermedades agrícolas que biológico permite obtener frutos de mejor cali-
genera pérdidas económicas importantes en dad (tamaño), los cuales son particularmente
México es la fusariosis del jitomate, produci- atractivos para el mercado de exportación. 

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