Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
PROGRAMA
Unidad 1
Presentación del curso - El laboratorio de Microbiología
El nacimiento de la Microbiología: el legado de Semmelweiss; la obra de Pasteur; la teoría de los gérmenes.
Normas de bioseguridad. Buenas prácticas de laboratorio.
A1. La distribución de los microorganismos en el ambiente
A2. El lavado de las manos
A3. Trabajar en condiciones asépticas
Unidad 2
El cuidado del material básico en el laboratorio microbiológico.
La composición de los medios de cultivo, técnicas bacteriológicas; condiciones de incubación, esterilización;
descarte del material utilizado.
A4. EL pH del medio y el crecimiento microbiano
Unidad 3
Microscopía (revisión)
Características morfológicas de bacterias, hongos y algas. Ultraestructura, formas latentes.
A5. Observación y cultivo de hongos y algas
A6. Observaciones microscópicas de bacterias – métodos de coloración
Unidad 4
Características bioquímicas de los microorganismos: exigencias nutricionales, producción de enzimas. Los
sistemas miniaturizados de diagnóstico.
Cultivo y crecimiento de microorganismos. Curva de crecimiento típica.
Las colecciones de cultivos (investigación)
A7. Obtención de un cultivo bacteriano puro
A8. Caracterización bioquímica de microorganismos
A9. El número de microorganismos de un cultivo
Unidad 5
Fundamentos del control de los microorganismos: agentes físicos (revisión) y agentes químicos. Valoración del
poder antimicrobiano de desinfectantes y antisépticos. Modo de acción de los antibióticos. Resistencia a los
agentes químicos. El control de los microorganismos en lo cotidiano.
A10. Acción de la luz ultravioleta
A11. Acción de los desinfectantes
A12. Acción de los productos cosméticos (desodorantes)
A13. Acción de los productos cosméticos (dentífricos)
A14. Antibióticos y antifúngicos
EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PRECAUCIONES BÁSICAS
El lugar de trabajo debe ser desinfectado con alcohol antes del inicio de cada clase de trabajos prácticos, así
como al final de las manipulaciones.
Antes y después de cualquier manipulación, pasarse alcohol por las manos.
Tener cuidado con los cabellos.
En caso de herida accidental con material séptico, desinfectarse inmediatamente con alcohol 70ºC.
No olvidar que toda picadura o ingestión accidental ofrece riesgo.
PIPETEADORES (PERAS)
Las peras son de goma y tienen 3 “bolitas” con las letras “A”, “S” y “E”. La primera sirve para retirar todo el
aire antes de ser acoplada a la pipeta; la segunda sirve para que el líquido suba y la última para expulsar el
líquido. Además, para expulsar la última gota, cuando se trabaja con pipetas totales, basta con solo apretar
el orificio en la extremidad lateral de la pera (al lado de la “bolita” E).
Procedimiento
1. Apriete simultáneamente la letra “A” y la pera al mismo tiempo para retirar
todo el aire.
2. Introduzca la pera en la parte superior de la pipeta.
3. Lleve la pipeta hasta el fondo del recipiente, con cuidado de no tocar la parte
inferior en el fondo.
4. Aspire el agua contenida en el vaso de precipitados apretando la letra “S”.
5. Observar elevando la pipeta a la altura de los ojos, verificando cual es la
cantidad aspirada.
6. Llevar la pipeta hasta el recipiente destino y dejar caer (se aprieta la letra “E”)
por la pared lateral.
7. Para expulsar la última gota, cuando se está trabajando con pipetas totales, apretar el orifico de la
extremidad lateral, al lado de la “bolita” E.
NORMAS DE SEGURIDAD
Segundo Pedro Teixeira y Silvio Valle, en el libro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", Rio de
Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.
UN POCO DE HISTORIA
Luego de cierto tiempo, un caldo de carne expuesto al aire se pudre. La observación microscópica muestra
muchos tipos de microorganismos. Ya que no son observados en el caldo recién cocido, podemos
preguntarnos: ¿de dónde vienen?
Hasta 1850-1860 se admitía la teoría de la generación espontánea, es decir que los microorganismos
podían surgir espontáneamente como consecuencia de alteraciones en los alimentos.
En base a sus estudios sobre fermentación, Louis Pasteur consideró inadecuada esta explicación. Para él la
alteración de los alimentos era una consecuencia de la presencia de microorganismos. Pero, para
convencer a sus contemporáneos, Pasteur tuvo que demostrar de manera inequívoca su teoría.
TERCER EXPERIMENTO:
Crítica de los defensores de la generación espontánea a los experimentos tercero y cuarto: los resultados
obtenidos se deben al hecho de haber utilizado hasta ahora líquidos hervidos largamente.
QUINTO EXPERIMENTO: la sangre y orina extraídas de un organismo sano no se alteran cuando son
conservados al resguardo del aire.
Las evidencias experimentales presentadas por Pasteur llevaron a sus contemporáneos a sustituir la teoría
de la generación espontánea por la teoría de los gérmenes. Se admite que los gérmenes presentes en el
medio ambiente son los responsables de las alteraciones de los medios orgánicos (fermentaciones,
putrefacción, enfermedades).
La teoría de los gérmenes abrió nuevos caminos en la utilización industrial de los procesos fermentativos,
en la conservación de alimentos y en la lucha contra las enfermedades infecciosas.
“Probablemente, las primeras formas de microorganismos habitaban en el agua. Con el paso del tiempo, el
suelo resultó infectado y, ahora, se encuentra allí la mayor parte de ellos. Del suelo pasaron al aire por el
viento, que levanta partículas de polvo en las cuales están presentes los microorganismos. Desde que
vivimos en contacto con el aire, aspiramos enormes cantidades de microorganismos cada vez que
respiramos. El aire se deposita en nuestro cabello, ropa y piel. Del aire pasan a nuestro alimento o bebida.
Estamos completamente rodeados por microorganismos y debemos aprender a vivir con ellos. Felizmente,
la mayor parte no causa daño. Son relativamente pocos los que causan perjuicios. Es contra los que causan
enfermedades o estropean nuestros alimentos que debemos prevenirnos” (Neder R.N. Microbiologia, Sao
Paulo, Ed. Nobel, 1992).
MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri con medio nutritivo estéril, 1 rotulador.
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS
1. ¿Cuántas colonias se desarrollaron en la placa?
2. Complete la tabla con los datos de la clase.
Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8
Lugar de exposición
N0 de colonias
¿Dónde estuvo expuesta la placa que presentó el mayor número de colonias? ¿Dónde fue expuesta la
placa que presentó el menor números de colonias?
1. Anotar en la parte superior de la placa de Petri con medio nutritivo el nombre del alumno. En la parte
inferior, delimitar con el rotulador cuatro regiones: A, B, C y D.
2. Con mucho cuidado abrir la placa de Petri para que el alumno apoye el dedo pulgar de la mano
dominante sobre la superficie del agar en el sector A. Cerrar la placa.
3. Lavarse las manos con agua. Dejar secar sin tocar absolutamente nada.
4. Con la ayuda del compañero, abrir la placa y apoyar el dedo pulgar de la mano dominante en el sector
B. Cerrar la placa.
5. Repetir los puntos 3 y 4, lavándose las manos con agua y jabón y apoyar el pulgar de la mano
dominante en el sector C.
6. Repetir los puntos 3 y 4, fregando las manos con alcohol y apoyando el pulgar de la mano dominante
en el sector D. Siempre con la ayuda del compañero/a, abrir la placa y apoyar el pulgar de la mano
dominante en el sector D. Cerrar la placa.
7. En otra placa, el compañero repetirá el procedimiento, invirtiendo los roles.
Resultados
Comparar esos resultados con los obtenidos por las otras parejas.
¿Cuál es el tratamiento más eficiente? ¿El alcohol es suficiente para desinfectar las manos?
Investigación
No todos los gérmenes son peligrosos. ¿Cuál es la diferencia entre la flora microbiana local y la flora
transitoria? ¿Cuál es peligrosa?3. TRABAJAR EN CONDICIONES ASÉPTICAS
Como los microorganismos se encuentran en todas partes, resulta complicado conservar la esterilidad del
material y de los medios de cultivo durante las manipulaciones que se realizan en el laboratorio. Por tanto,
debemos aprender a trabajar en condiciones de esterilidad ya que esta es la única forma de garantizar que
el único microorganismo que crece sea aquel que ha sido inoculado.
Material
Por alumno: 1 tubo con caldo de carne (10%) estéril, 1 pipeta esterilizada, 3 tubos estériles.
Procedimiento
1. Con la pipeta, distribuir 2 ml de caldo de carne estéril en cada uno de los tres tubos.
Resultados
Discusión
1. ¿Podría decir en qué momento hubo contaminación del material? Justifique su respuesta
Textos extraídos del libro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", de Pedro Teixeira y Silvio Valle,
Río de Janeiro, Editorial Fiocruz, 1996.
“Los agentes biológicos presentan un riesgo real o potencial para el hombre y el medio ambiente. Por esta
razón, es fundamental crear una estructura que permita la prevención de los riesgos encontrados en los
laboratorios de investigación.
Los agentes biológicos se dividen en cuatro grupos, donde son considerados como criterios: la
patogenicidad para el hombre; la virulencia; el modo de transmisión, la endemicidad y la existencia o no de
profilaxis y de terapias eficaces.
Según la resolución nº1 de 1988 del Consejo Nacional de Salud, Cap. X art. 64, actualizada en el decreto nº
1914 de 2011 del Ministerio de Salud de Brasil, los microorganismos que afectan al hombre, a los animales
y a las plantas pueden ser clasificados en grupos de riesgo de 1 a 4 en orden creciente.
Clase de riesgo 1 (bajo riesgo individual y para la comunidad): incluye los agentes biológicos conocidos que
no causan enfermedades en el hombre o en los animales adultos sanos. Ejemplos: Lactobacillus sp. y
Bacillus subtilis.
Clase de riesgo 2 (moderado riesgo individual y limitado riesgo para la comunidad): incluye los agentes
biológicos que provocan infecciones en el hombre o en los animales, cuyo potencial de propagación en la
comunidad y de diseminación en el medio ambiente es limitado, y para los cuales existen medidas
terapéuticas y profilácticas eficaces. Ejemplos: Schistosoma mansoni y el virus de la rubeola.
Clase de riesgo 3 (alto riesgo individual y moderado riesgo para la comunidad): incluye los agentes
biológicos que poseen capacidad de transmisión por vía respiratoria y que causan patologías humanas o
animales, potencialmente letales, para los cuales usualmente existen medidas de tratamiento y/o de
prevención. Representan un riesgo si se diseminan en la comunidad y en el medio ambiente, pudiendo
propagarse de persona a persona. Ejemplos: Bacillus anthracis y el virus de inmunodeficiencia humana
(HIV).
Clase de riesgo 4 (alto riesgo individual y para la comunidad): incluye los agentes biológicos con gran poder
de transmisibilidad por vía respiratoria o de transmisión desconocida. Hasta el momento no hay ninguna
medida profiláctica o terapéutica eficaz contra las infecciones ocasionadas por estos. Causan enfermedades
en el hombre y en los animales de gran gravedad, con alta capacidad de diseminación en la comunidad y en
el medio ambiente. Esta clase incluye principalmente los virus. Ejemplos: virus del Ébola o virus Lassa.”
Investigar: ¿En qué grupo de riesgo se clasifica al agente de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis)?
El nivel de seguridad (Biosafety Level) de los laboratorios depende de los microorganismos con los cuales se
trabaje. La estructura y los métodos de trabajo son diferentes en cada nivel. Vea la presentación de la
película OUTBREAK (1996).
EN EL LABORATORIO DE ENSEÑANZA SÓLO SE TRABAJARÁ CON MICROORGANISMOS CLASIFICADOS DENTRO DEL NIVEL DE
RIESGO 1
Tomando todas las precauciones de esterilidad, como el flameado de las bocas de los tubos, ansas de
platino, etc., se introduce una ansada del material a ser sembrado en el tubo. Dejar este material en la
pared interna del tubo, justo encima del líquido. Recolocar el tapón, luego flamear la boca del tubo y
mezclar por rotación para permitir la mezcla completa del medio con el material sembrado.
El ansa y el hilo de platino deben ser flameados antes y después de cualquier operación de sembrado. Para
lo cual deben ser calentados hasta su incandescencia y la parte inferior debe ser pasada por la llama dos a
tres veces.
El material no debe ser tomado con el ansa caliente; esta debe ser enfriada en la pared interna del tubo de
ensayo. La posición exacta para flamear el ansa es en ángulo de 45º, en relación con la mesa de trabajo.
Debe utilizarse el cono interno de la llama del mechero Bunsen.
Toda vez que se realicen sembrados, utilizando tubos de ensayo, se debe flamear la boca de los mismos
inmediatamente después de quitar e inmediatamente antes de colocar el tapón de algodón. Este no debe
nunca ser dejado sobre la mesa de trabajo; debe ser asegurado con el dedo meñique de la mano derecha.
Objetivo: Observar cómo el pH afecta el crecimiento microbiano y cómo el crecimiento microbiano afecta
el pH.
Material
o Test con E.coli: 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 4, 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 6, 1 tubo
con caldo nutritivo estéril pH = 8, 1 tubo con caldo nutritivo estéril pH = 10. Un estante, 1 frasco con
desinfectante, indicador universal, 1 ansa, mechero Bunsen, rotulador, cultivo de E. Coli.
o Test con S. Cerevisiae: Los mismos elementos, con medio nutritivo con sacarosa y un cultivo de S.
Cerevisiae.
o Controles: Preveer dos series de tubos como controles del cambio de color.
Procedimiento
Resultados:
2. ¿Cómo se sabe que los microorganismos crecieron? ¿Cómo se sabe que hubo algún cambio de pH?
Discusión
1. En función de los resultados de la clase, ¿cuál de los dos microorganismos crece entre valores más
amplios de pH?
2. Para un microorganismo, ¿cuál sería la ventaja de crecer en una franja de pH más amplia?
1. Encienda el microscopio.
3. Baje la platina y coloque el portaobjetos en el chariot, con el cubreobjetos colocado por encima.
4. Acomode la distancia entre las lentes oculares, de manera de trabajar en una posición confortable. A
menos que trabaje individualmente, evite ajustar las lentes oculares a sus ojos.
5. Gire el tornillo macrométrico hasta que quede bien próximo al portaobjetos. (ATENCIÓN: esta
operación deberá ser realizada por el lado de afuera y no por el ocular, de este modo evitará quebrar el
portaobjetos, dañando el material y perdiendo tiempo).
6. Mirando por el ocular y girando el tornillo macrométrico en sentido contrario, aproxime lentamente el
cañón hasta ver algo. Si no aparece nada, es porque no centralizó el corte. Use los tornillos del charriot
para mover el portaobjetos y coloque la parte coloreada justo en el paso de la luz.
7. La focalización final deberá hacerse con el tornillo micrométrico, moviéndolo hacia adelante y hacia
atrás hasta conseguir el punto donde la imagen tenga la mayor nitidez, o foco. No gire el tornillo
micrométrico indefinidamente para mover el cañón, ya que podrá dañar su delicado mecanismo. Úselo
solamente para ajustar el foco y para las observaciones de profundidad.
8. Certifique que la región que quiere observar se encuentra en el medio del campo antes de girar el
revólver y pasar al objetivo de medio aumento (10x). Mejore el foco si fuera necesario. Los objetivos
secos son parafocales, es decir que si la estructura está enfocada con uno, estará muy cerca de serlo
con otros.
9. Repita el mismo procedimiento para usar el mayor aumento (40x). Si no logra enfocar, no fuerce el
microscopio. Vuelva al menor aumento, mire si el portaobjetos está levantado e inténtelo otra vez. Si
no lo consigue llame al profesor.
10. Cuando termine el trabajo con el microscopio, retire de la platina lo que estuviera observando, coloque
el objetivo de menor aumento y eleve la platina. Coloque la intensidad de luz al mínimo, verifique que
el condensador se encuentra elevado y el diafragma abierto. Apague el microscopio.
Observación: La finalidad del condensador es la de reunir toda la luz en un haz estrecho, de mayor
intensidad luminosa. Junto al condensador está el diafragma, que funciona del mismo modo que el
diafragma de las máquinas fotográficas, o mejor dicho, que funciona como su iris, aumentando o
disminuyendo el tamaño de la pupila, regulando de este modo la entrada de luz. Sólo mueva el
condensador y el diafragma en condiciones especiales. Normalmente el condensador funciona elevado y el
diafragma abierto.
RECUERDE QUE
o El aumento de una imagen vista al microscopio óptico es siempre el producto de los aumentos
proporcionados por el ocular, multiplicado por los aumentos proporcionados por la lente objetivo
utilizada. Por lo tanto, si estuviera utilizando un ocular de 10x y un objetivo de 45x, ¿cuántas veces
estará aumentada la imagen observada? _____________________
o Toda vez que vaya a usar el microscopio, use siempre el objetivo de menor aumento en primer lugar, ya
que le dará mayor visión del material. En seguida, use el segundo aumento. Tenga en cuenta que
cuanto mayor sea el aumento, menor será el área observada.
o El objetivo 100x deberá ser usado en microscopía de inmersión, es decir, colocando sobre el
portaobjetos una gota de aceite de cedro y sobre esta gota se sumerge el objetivo. La función del aceite
de cedro es proporcionar mayor iluminación al cañón evitando la dispersión de los haces luminosos.
1. Para transportarlo use las dos manos, una sujetando el brazo del microscopio y la otra sosteniéndolo por
la base. NUNCA cargue el aparato usando solo una de las manos!!!
2. No gire el tornillo micrométrico indefinidamente para mover el cañón, ya que podrá dañar su delicado
mecanismo. Úselo solamente para ajustar el foco y para las observaciones de profundidad.
3. No pase los dedos por las lentes para limpiarlas. El vidrio de las lentes se raya fácilmente (más que el
vidrio común), por tanto, solo debe usarse un papel especial, bien suave, para limpiarlas.
4. Evite mojar el microscopio mientras está trabajando. Si esto ocurriera, séquelo con un paño bien suave.
5. No desmonte cualquier parte del microscopio. Este es un instrumento muy caro, por tanto, todo cuidado
es poco.
6. Cuando termine el trabajo con el microscopio, retire de la platina lo que estuviera observando, coloque
el objetivo de menor aumento y baje el cañón. Guarde el aparato en un lugar adecuado, teniendo
cuidado de verificar que está listo para volver a ser usado.
Procedimiento.
Los hongos y sus esporas se encuentran en las más diversas condiciones ambientales. La recolección,
asilamiento y cultivo no representan por tanto dificultades. El problema es, al contrario, evitar contaminar
por hongos los cultivos de otros organismos, especialmente bacterias.
Mezclar 6,0 g de harina de maíz con agua hasta obtener una papilla y hervir hasta
obtener una crema. Filtrar por gasa. Agregar 1,5 g de agar. Calentar hasta que el
agar quede disuelto. Completar hasta un volumen de 100 ml con agua, distribuir en
tubos pequeños y esterilizar en el autoclave (o en olla a presión) durante 20 minutos
(121 ºC).
El cultivo en portaobjetos permite acompañar el desarrollo de un hongo sin que las esporas se esparzan por
el aire contaminando otros cultivos y eventualmente, desencadenando reacciones alérgicas. El
procedimiento más simple es colocar un trozo de cinta durex (cinta adhesiva) sobre las hifas y pegarlo
sobre el portaobjetos. No obstante, si quisiéramos observar el crecimiento de hongos, el mejor
procedimiento es el siguiente:
A. Inocular un tubo con agar nutritivo, líquido y enfriado (45-50 oC), con un cultivo de hongos de pan o
fruta; rotar el tubo entre las palmas de la mano para distribuir bien el inóculo;
B. Flamear un portaobjetos y un cubreobjetos, poner una gota del cultivo sobre el portaobjetos y colocar el
cubreobjetos de tal manera que el agar se disperse hasta más o menos 5 mm de sus bordes;
C. Colocar el portaobjetos en una placa de Petri con una “bolita” de algodón embebida en agua; la
humedad del algodón retarda el resecamiento del medio; incubar por 2 a 4 días a temperatura
ambiente;
Material
Portaobjetos de vidrio, algodón, alcohol 95 o GL, alcohol 90 o GL, papel absorbente, cultivo de Bacillus
megatherium, patrones Gram negativos (G-) y Gram positivos (G+), soluciones colorantes (azul de metileno,
cristal violeta, fucsina o safranina, lugol), nigrosina (= tinta de la India), mechero Bunsen, ansa de Níquel-
cromo, microscopio.
Procedimiento
ATENCIÓN!!! Antes de iniciar el trabajo, limpie y desengrase los portaobjetos con un trozo
de algodón embebido en alcohol al 90 o GL. Cuando termine el trabajo limpie
cuidadosamente el objetivo de inmersión del microscopio con algodón embebido en xilol o
solución de éter-cloroformo.
1. Luego de flamear el ansa, colocar una gota de la suspensión mixta de bacterias sobre el portaobjetos
identificado con el nombre del alumno.
2. Dejar secar espontáneamente.
3. Fijar el preparado sobre el portaobjetos, asegurando con una pinza de madera y pasándolo tres veces
sobre la llama del mechero Bunsen, con la parte del preparado hacia arriba.
C. MÉTODO DE COLORACIÓN DE
GRAM
La composición de los medios de cultivo varía hasta el infinito. Sin embargo, podemos groseramente dividir
a los medios de cultivo en dos categorías:
o Los medios llamados complejos, cuya composición no está bien definida (extracto de carne, de
levadura, de peptona, de malta, etc.)
o Los medios sintéticos de composición determinada
Los medios que sirven de sustrato para el cultivo bacteriano pueden presentarse como medios líquidos o
sólidos. Generalmente se agrega agar como agente solidificante, un azúcar obtenido de algas marinas. Este
soporta perfectamente el autoclave (salvo a pH < 4 o a pH > 9), se derrite cuando la temperatura pasa los
90ºC y solidifica cuando la temperatura baja de 50ºC.
a) Mezclar los componentes en las proporciones indicadas y agregar agua destilada hasta completar el
volumen deseado. Se fuera necesario, para disolver los componentes, calentar en Baño María.
b) Determinar el pH y ajustarlo si fuera necesario.
c) Distribuir el medio en tubos sin llenarlos totalmente.
d) Tapar.
e) Esterilizar.
Observación
A falta de los componentes mencionados arriba, el caldo puede ser preparado según: Cortar en trozos
pequeños 500 g de carne sin grasa, agregar 900 ml de agua y mantener en el refrigerador por 12 horas.
Calentar lentamente y hervir por 10 minutos. Agregar 5 g de sal (no iodada). Tirar la espuma, dejar esfriar y
filtrar dos veces. Completar el volumen a 1000 ml.
LA ESTERILIZACIÓN
La esterilización puede ser definida como la destrucción completa de todo organismo vivo mediante
procesos de calentamiento, filtración o cualquier otro método físico o químico.
Algunas soluciones (vitaminas, antibióticos, etc.) no pueden ser esterilizadas por calor sin sufrir graves
alteraciones. Los preparados que contienen compuestos termolábiles son esterilizados por filtración. Todo
el equipamiento de filtración es previamente esterilizado en el autoclave.
Las membranas Millipore son esterilizadas por ebullición suave durante 20 minutos en agua destilada; se
debe tener cuidado que no toquen las paredes del recipiente. Se deja enfriar, se retiran las membranas del
agua con una pinza estéril, colocándolas inmediatamente son el respectivo disco de soporte.
Sistema Millipore
También se pueden esterilizar medios líquidos con filtros descartables que pueden ser acoplados a jeringas.
Este método es de gran utilidad para la preparación de medios de cultivo de células vegetales porque
permite esterilizar hormonas sin pérdida de actividad.
Investigar: ¿Existen otras formas de esterilización? ¿Cuáles? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de esos
métodos?
LA TÉCNICA BÁSICA
Solamente con el sembrado en placa pueden obtenerse colonias aisladas. Es una pérdida de tiempo y
material simplemente distribuir la muestra sobre la placa, esperando realizar un diagnóstico bacteriológico.
El arte del sembrado solo se aprende a través de prácticas diarias repetidas.
La técnica del agotamiento del inóculo es una técnica de rutina para el aislamiento de bacterias en cultivos
puros. Si el sembrado no fuera satisfactorio, no se obtienen colonias aisladas, debiéndose requerir de una
nueva muestra.
La placa de Petri debe contener un medio de cultivo, en el cual el microorganismo a ser aislado crezca
característicamente. El medio de cultivo debe estar bien seco, ya que si estuviera húmedo, el agua de
condensación puede arrastrar las bacterias sobre la superficie de la placa.
Las placas de Petri deberán abrirse próximas al mechero Bunsen, para evitar la contaminación con
gérmenes del aire. La Figura de abajo muestra las tres formas posibles de sujetar la placa durante el
procedimiento. Pruebe las tres formas posibles con una placa vacía antes de elegir cuál es la que se adapta
mejor a sus posibilidades.
Una ansada del material a ser sembrado es colocada en la parte superior del medio de cultivo. Tocar
solamente la superficie del medio, tratar de no perforar el agar. Ese es el llamado inóculo inicial.
Flamear el ansa de platino y, a partir del inóculo inicial, sembrar en ángulos perpendiculares al inóculo,
realizando líneas de sembrado paralelas entre sí. Girar la placa y sembrar en ángulo perpendicular a las
líneas paralelas ya hechas, de modo que el resultado sea una serie de líneas que formen pequeños
cuadrados sobre la superficie del medio.
Las colonias aisladas deben aparecer al final del sembrado. Si hubiera crecimiento de bacterias en los
centros de los cuadrados formados en el proceso de sembrado, obviamente se tratará de una
contaminación.
Una vez sembradas las placas, deben ser incubadas con la tapa, en posición invertida.
Material
Placa de Petri con medio de cultivo, tubo con solución salina estéril, pipeta estéril, ansa de níquel-cromo,
rotulador pilot, mechero Bunsen, suspensión mixta de bacterias.
Procedimiento
1. Transferir, con una pipeta estéril, 0,1 ml de la suspensión mixta de bacterias a un tubo con 4,9 ml de
solución salina estéril (dilución 1:50).
2. Agitar bien y homogeneizar.
3. Flamear el ansa y retirar una gota pequeña de la suspensión mixta de bacterias diluida y sembrarla sobre
la superficie de un medio sólido (agar simple).
ATENCIÓN: El sembrado debe ser realizado por estriado, de acuerdo con el esquema
presentado anteriormente (método de agotamiento). Entre un sector y otro, el ansa debe
ser esterilizada.
Resultados
1. Dibuje el aspecto de la placa (o fotografíe la placa) mostrando la distribución del material inoculado.
2. Describa las diferentes colonias aisladas, caracterizándolas respecto al tamaño, bordes, elevación y color.
Utilice los criterios descriptos en la página siguiente.
Desafío
¿Cómo haría para obtener un cultivo puro de una de las colonias observadas?
Objetivo: Utilizar algunos tests bioquímicos para caracterizar diferentes microorganismos (E. coli, B.
subtilis y M. luteus).
Material
3 cultivos bacterianos diferentes (A, B y C), placas de Petri con agar nutritivo, placa de Petri con agar leche,
placa de Petri con agar almidón, 3 tubos con caldo glucosado e indicador de pH, 3 tubos con caldo
lactosado e indicador de pH, 3 tubos con caldo con sacarosa e indicador de pH, solución desinfectante,
ansa, pipetas Pasteur estériles, mechero Bunsen, cinta adhesiva, rotulador pilot.
Procedimiento
Resultados
Discusión
Identifique los cultivos A, B y C sabiendo que las colonias de E. coli y B. subtilis son blancas y las de M.
luteus son amarillas; M. luteus y B. subtilis producen proteasas y fermentan la sacarosa; B. subtilis produce
amilasas; M. luteus, B. subtilis y E. coli fermentan la glucose; E. coli fermenta la lactosa.
El número de microorganismos de un cultivo puede ser estimado colocando un volumen determinado del
mismo en agar nutritivo a 37ºC de manera que cada célula pueda multiplicarse dando origen a una colonia.
Después de 24 a 48 horas de incubación podremos observar y contar las colonias. Aceptando que cada una
de ellas resulta de la multiplicación de un individuo aislado es posible calcular el número de
microorganismos en el cultivo.
Material: cultivo de E.coli (dilución / 10-4), placas de Petri con medio nutritivo, 5 tubos de ensayo con 4,5
ml de agua destilada estéril, 1 tubo de solución salina, desinfectante, jeringa de 1 ml, pipeta
Pasteur calibrada, cinta adhesiva, rotulador pilot, estufa a 370.C.
Procedimiento
Resultados
Discusión: Sugiera diferentes aplicaciones para esta técnica. ¿Cómo podría mejorarla? Prepare un
protocolo apropiado.
Lámparas especiales que emiten luz UV con longitud de onda microbicida son utilizadas para reducir el
número de microorganismos en el aire, en superficies de salas quirúrgicas y en salas asépticas donde los
productos esterilizados son fraccionados en botellas o ampollas estériles.
En esta actividad, estudiaremos la acción germicida de la luz ultravioleta sobre diferentes tipos de
microorganismos, tales como E. coli, B. subtilis, M. luteus, S. cerevisiae o Rhodotorula.
Material (por grupo): 4 placas de Petri estériles con medio nutritivo para las bacterias y con medio nutritivo
con sacarosa para las levaduras; hisopo estéril; 1 pipeta Pasteur estéril, cultivos de varios
microorganismos, 4 cartones de cartulina negra, flujo laminar con luz UV.
Procedimiento:
5. Exponer las placas a luz UV durante 1 min. (placa 1), 5 min. (placa 2), 10 min. (placa 3) y 20 min. (placa
4).
Resultados
Microorganismo _________________________________
CRECIMIENTO
Discusión
4. ¿La luz UV actuó del mismo modo sobre los diferentes microorganismos? Si la respuesta fuera negativa,
explique.
5. Un lápiz de luz UV es utilizado en algunos países para decontaminar los teléfonos celulares. ¿Usted
encuentra este método adecuado?
Discos de papel de filtro de 5 mm de diámetro, agua lavandina o lejía (dilución 50%), 1 placa de Petri con
agar nutritivo estéril, 4 tubos con 1,5 ml de agua esterilizada, 1 pipeta de 1 ml estéril, 1 pipeta Pasteur
estéril, desinfectante, 1 tubo con 5 ml de agar nutritivo estéril (agar blando), pinzas, mechero Bunsen,
estufa a 30C, cultivo puro de Escherichia coli, rotulador (pilot).
Observación 1: con otros desinfectantes se recomienda partir de 0,2 ml y preparar la dilución seriada en
tubos con 1,8 ml de agua esterilizada.
Observación 2: el agar se derrite cuando la temperatura pasa los 90ºC y solidifica cuando baja de 50ºC.
Procedimiento
B. PREPARACIÓN DE LA PLACA
En condiciones asépticas
1. Inocular el tubo con agar nutritivo líquido (agar blando) con 1 ml de un cultivo puro de
Escherichia coli. Mezclar bien.
2. Verter el contenido del tubo en la placa. Dejar solidificar.
Resultados
1. Realice un dibujo (o fotografíe) mostrando la apariencia de la placa e indicando el diámetro de las zonas
de inhibición alrededor de los discos.
Discusión
5. La descarga de agua en el retrete o inodoro diluye los desinfectantes. Comente en función de sus
resultados.
Diferentes tipos de microorganismos se desarrollan en la piel, esto ocurre en los pliegues y las partes más
húmedas asociadas a las glándulas sudoríparas. El olor de la transpiración es el resultado de la acción de
estos microorganismos.
Los desodorantes inhiben el crecimiento de los microorganismos responsables del olor a la transpiración.
En esta actividad estudiaremos la acción de diferentes desodorantes sobre el crecimiento de Micrococcus
luteus.
Material
1 placa con agar nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 ansa de Drigalsky, 3
desodorantes diferentes (A, B y C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinza estéril, rotulador o pilot, mechero
Bunsen.
Procedimiento
Resultados
Discusión
Material
1 placa con agar nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 ansa de Drigalsky, 3
dentífricos o soluciones anti-placa bacteriana diferentes (A, B y C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinza
estéril, rotulador, mechero Bunsen.
Procedimiento
Resultado
Discusión
1. ¿Los dentífricos estudiados tienen alguna acción sobre las bacterias? ¿Cuál es el más eficiente?
2. Algunos dentífricos contienen sustancias que inhiben el crecimiento bacteriano. ¿Cuáles son los otros
ingredientes de un dentífrico y cuál es su función?
El uso indiscriminado de los antibióticos en la clínica tuvo como consecuencia un aumento de formas
resistentes, dificultando el combate contra los microorganismos. Actualmente, en Brasil, la venta de
antibióticos sólo es posible con receta médica.
Objetivo
Evidenciar la acción germicida de una solución antifúngica de uso tópico y venta libre en las farmacias.
Materiales
Una placa con agar nutritivo estéril (Sabouraud), 1 cultivo en caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1 pipeta
estéril, 1 hisopo estéril, una solución antifúngica, 5 discos de papel de filtro estériles, 1 pinza estéril,
rotulador.
Procedimiento
Preguntas
¿El producto testeado mostró alguna acción germicida sobre las levaduras?
¿Cuál es la función del papel colocado en el centro de la placa?
¿Cuál es la función de las repeticiones B, C y D?
¿Cómo interpretaría la eventual aparición de colonias dentro del halo de inhibición?
BIBLIOGRAFÍA
PELCZAR M., REID R e KRIEG N. R. Microbiologia. São Paulo, Makron Books, 1996.
WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, Mac Donald and Co.,
1987.