Estado actual de las vacunas contra leishmaniosis.

PRIMERA GENERACIÓN DE VACUNAS

Se han desarrollado varias generaciones de vacunas contra la leishmaniosis: la
primera se centró en parásitos muertos o extractos crudos.
Estas vacunas han sido preparadas con Leishmania amazonensis y/o Leishmania
major, lisadas por autoclave y con adyuvante de Freund completo, o mediante la
mezcla de promastigotos de Leishmania mexicana sometidos al autoclave y BCG
(Bacilo de Calmette-Guérin). Se han usado para inmunoterapia o
inmunoquimioterapia, que resultó efectiva contra la enfermedad cutánea leve y en
la prevención de las lesiones cutáneas deformantes, pero no contra la leishmaniosis
visceral . En 1980 la vacunación contra la leishmaniosis con parásitos muertos
experimentó un auge con base en la demostración de la excelente protección que
confiere en ratones, cuando se administra intravenosa o intraperitonealmente;
infortunadamente, con el tiempo los parásitos sometidos al autoclave pierden su
potencia inmunogénica .
En el caso de la leishmaniosis visceral canina, se han empleado con éxito vacunas
con fracciones del parásito, entre ellas la Leishmune®, que consiste en una
preparación enriquecida de glicoproteína de promastigotos de Leishmania
donovani, llamada ligando de fucosa-manosa (FML, por su sigla en inglés) que es
formulada con saponina de Quillaja saponania, como adyuvante. La glicoproteína,
el FML, es una molécula esencial (involucrada en la construcción del DNA del
parásito) y constituye el mayor complejo antigénico de L. donovani . También se ha
usado ampliamente como candidato para vacuna el lipofosfoglicano (LPG)
de Leishmania spp., un ligando para TLR2 en células NK que regula la producción
de IFN-γ y TNF-α, pero con resultados contradictorios.
Otro enfoque de la inmunoterapia consiste en usar una sola proteína antigénica del
patógeno con el fin de provocar una respuesta inmunitaria específica; en este
sentido, se ha empleado el péptido gp63 de Leishmania(leishmanolisina) por ser
una proteína inmunógena en todas las especies de Leishmania. Esto lo hace un
buen candidato para vacunas de péptidos contra este grupo de parásitos.
También se han usado en perros vacunas contra Leishmania infantum atenuadas
con gentamicina, aminoglucósido que afecta el metabolismo tiolredox del parásito,
que es crucial para su supervivencia cuando se expone al estrés oxidativo generado
durante su entrada al macrófago del mamífero; el parásito puede penetrar, pero no
sobrevive y genera una fuerte respuesta inmunitaria del hospedero .
De la misma manera, pero en ratones, se ha empleado la vacunación con proteína
ribosomal purificada de extractos crudos de promastigotos (LRP, por la sigla en
inglés de Leishmania major ribosomal protein) combinada con el
oligodeoxinucleótido CpG (CpG ODN), como adyuvante, pues induce respuesta Th1
(28). Igualmente, se han usado antígenos de Leishmania spp., tales como: tiol
antioxidante específico (TSA, por la sigla en inglés de thiol specific antioxidant),
proteína 1 inductora de estrés (LmSTI1, por la sigla en inglés), cisteína peptidasa
(CPA), histona H1, factor iniciador eucariótico de Leishmania (LelF), proteína 11 de
membrana de quinetoplasto (KMP11, por la sigla en inglés), proteínas de
membranas Dp 7, gp 70-2 y FML, proteína B de superficie hidrófila acilada (HASPB,
por la sigla en inglés), proteína específica de amastigoto (A2) y cisteína-proteinasa
B (CPB, por la sigla en inglés), todos con efecto protector individual para solo una
especie de Leishmania .
Otra estrategia de vacunación es el uso de las proteínas de choque térmico (HSP,
por la sigla en inglés) llamadas chaperonas moleculares porque intervienen en el
plegado, montaje, localización intracelular, secreción y degradación de proteínas
como las inmunoglobulinas y el complejo mayor de histocompatibilidad), debido a
que son altamente conservadas y tienen potencial para estimular las células T. Al
respecto, se ha usado satisfactoriamente la proteína de choque térmico 70 (HSP70)
de L. donovani en el control de la infección en hámsteres, incluso las observaciones
indican que vacunas basadas en la combinación de HSP70 con proteínas
estimuladoras Th1 (triosa fosfato isomerasa, proteína disulfuro-isomerasa y el factor
2 de elongación) de L. donovani potencian la efectividad en la destrucción del
parásito intracelular.
SEGUNDA GENERACIÓN DE VACUNAS
La siguiente vía en el desarrollo de vacunas contra Leishmania fue el uso de
parásitos vivos atenuados por medios físicos, químicos o genéticos, a saber:
cultivos in vitro por largos períodos, sensibilidad a la temperatura, atenuación por
rayos gamma, atenuación química, mutagénesis química, cultivos bajo presión de
drogas y modificaciones del parásito como la disrupción genética (46-50). Sin
embargo, los principales problemas del uso de parásitos atenuados son la seguridad
y la poca factibilidad de utilizarlos a gran escala en el campo.
Al respecto, la atenuación por modificación genética de los parásitos permite reducir
la virulencia, mantener la inmunogenicidad y producir una respuesta inmunitaria
similar a la obtenida con los parásitos vivos y virulentos, pero sin el daño asociado
a estos.
Con la secuenciación completa de L. major se puede atenuar su virulencia mediante
el bloqueo o reemplazo de genes esenciales . Lo que se pretende es diseñar
parásitos sin los genes que les garantizan larga supervivencia dentro del hospedero,
haciéndolos, por tanto, seguros para inmunizar . Por ejemplo, en L. majorse
modificó el gen de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS), y en L.
mexicana la cisteína-proteasa CPA y CCPB (18,53-55). Asimismo, por deleciones
se han desarrollado leishmanias knock-out para los genes A2 rel, SIR2 y Hsp70-II y
para genes de proteínas esenciales como: cisteína-proteinasa, transportador de
bioterina, complejo citocromo C oxidasa, proteína parecida a ubiquitina, proteína
que convierte el precursor Ufm1 a su forma conjugada y proteína p27 específica de
amastigotos.
También se han empleado parásitos distintos a Leishmania en la técnica de
vacunación con base en la atenuación como el antígeno LCR1 de L. chagasi (similar
a una proteína flagelar de Tripanosoma cruzi) en BCG (71); el antígeno proteico de
la membrana del quinetoplasto KMP-11 en taquizoítos atenuados de Toxoplasma
gondii (72) y Leishmania tarentolae (no patógena para humanos), bien sea solo,
recombinante con expresión única del gen A2 o fusionado con los genes CPA, CPB
y CTE49. Este último enfoque para las vacunas vivas atenuadas, es decir, el empleo
de Leishmanias no patógenas para el ser humano, fue ideado por Breton (73), con
base en el alto nivel de inmunorreactividad cruzada que se observa entre especies
de parásitos patógenos y no patógenos para el ser humano, y podría llegar a ser la
vacuna que mayor seguridad ofrezca al receptor en esta categoría.
TERCERA GENERACIÓN DE VACUNAS
De esta generación la sustancia más probada como candidato para vacuna
recombinante es la proteína de superficie B1 acilada hidrófila (HASPB1), que
confiere protección contra L. donovani . También se ha empleado el candidato
antigénico NH36, que confiere protección contra la infección por L. chagasi, L.
mexicana y L. amazonensis. Esto plantea su efectividad potencial como vacuna
inmunoprofiláctica bivalente, para el control de ambas endemias. A la par se han
empleado las proteínas ribosomales recombinantes L3 y L5 de L. major para el
desarrollo de vacunas contra Leishmania. Asimismo, la vacuna de DNA basada en
la expresión de la proteína antioxidante tiol específica de amastigoto y promastigoto
induce respuesta inmune de la plataforma Th1, cuyo efecto puede amplificarse
cuando se acompaña con aluminio: este es un ejemplo de los intentos por impulsar
las vacunas DNA con adyuvantes . Coler y colaboradores han trabajado en
leishmaniosis visceral con tres poliproteínas recombinantes de Leishmania (TSA,
LmSTI1, LeIF) en asociación con el lípido monofosforil y el hidrocarburo escualeno
como coadyuvante (MPL-SE). En Europa se están haciendo pruebas clínicas de
dos nuevas vacunas de DNA (una basada en un vector viral, y la otra, en la
expresión genética de antígenos seleccionados de Leishmania denominada
LEISHDNAVAX2.
Por las siguientes razones son notorias las ventajas de estas estrategias
profilácticas sobre las anteriores: son vacunas simples, se pueden producir a gran
escala, son estables a temperatura ambiente, lo que facilita su almacenamiento y
transporte, y, finalmente, se pueden combinar varios antígenos y administrarlos en
una sola dosis y por tanto brindar protección contra más de una especie
de Leishmania, con lo cual se reduce el número de vacunas.
Inmunología de la Leishmaniasis.
La interacción de la Leishmania y el sistema inmune es muy compleja y varía según
la especie de Leishmania y según las características del hospedero. La infección
por Leishmania major es una de las más estudiadas y esta puede llegar
eventualmente a generar una respuesta inmune protectora contra subsecuentes
infecciones por la misma especie; sin embargo, esto no ocurre con todas las
especies de Leishmania.6, 8-9
La interacción con el sistema inmunitario comienza desde el momento de la
picadura del insecto. La introducción de las piezas bucales lacera los vasos
sanguíneos de la unión dermo-epidérmica. Además, el insecto inyecta sustancias
vasodilatadoras y la enzima hialuronidasa provocando la formación de una pequeña
“piscina de sangre” con la que se alimenta. Inmediatamente, el sistema inmune
innato interviene para detener este proceso mediante la activación del
complemento, la liberación de cininas que producen vasoconstricción, la activación
de la coagulación que produce trombosis de los vasos lacerados y la llegada de
macrófagos residentes y de neutrófilos sanguíneos al sitio de la lesión. Esto en
teoría podría limitar la capacidad del insecto para alimentarse y para transmitir la
leishmaniasis. Sin embargo, la saliva del insecto contiene potentes sustancias
vasodilatadoras: maxadilan (Lutzomyia) o adenosina (Phlebotomus),
antiagregantes plaquetarios, apirasa y sustancias estimuladoras de la producción
de prostaglandina E2 (PGE2). Estos mecanismos utilizados por el insecto para
favorecer su alimentación reducen la inflamación y facilitan la transmisión de la
Leishmania. De hecho, en un estudio se demostró que las lesiones de ratones
inoculados con promastigotes de L. major y saliva de flebótomo crecieron más
grandes y más rápido que las lesiones de ratones inoculados exclusivamente con
promastigotes de L. major.
Una vez inoculados los promastigotes, se da la activación de la cascada del
complemento que lisa aproximadamente al 90 % de los promastigotes metacíclicos
inyectados; sin embargo, hay un 10 % que sobrevive. Esto ocurre porque el
promastigote metacíclico es más resistente a la lisis por complemento que el
promastigote procíclico debido a su grueso glicocálix. También, el parásito contiene
cinasas que fosforilan a C3, C5 y C9 provocando su inactivación. Además, el LPG
y la gp63 favorecen la unión de C3bi a la superficie del parásito. De esta manera el
parásito favorece su propia opsonización y posterior fagocitosis mediada por los
receptores de complemento (CR). A su vez, la activación de complemento ha
favorecido la liberación de las anafilotoxinas C3a y C5a que son potentes agentes
quimiotácticos para neutrófilos (PMN) y monocitos. Además, se ha demostrado in
vitro que L. major secreta un factor que es quimiotáctico para PMN denominado
factor quimiotáctico de Leishmania (LCF).8 También los mastocitos juegan un papel
importante en esta respuesta de quimioatracción de PMN. En presencia del
parásito, los mastocitos liberan sus gránulos de TNF-α que es quimiotáctico para
los PMN.
A pesar de esta gran liberación de sustancias quimiotácticas, las primeras células
en infectarse son las que ya están en el sitio al momento de darse la inoculación.
Es por esto que los macrófagos residentes son los primeros en verse afectados.
Estos fagocitan los parásitos que resistieron la lisis por complemento mediante el
receptor CD11b/CD18 y mediante el receptor de manosa-fucosa que se une a los
residuos de manosa del LPG. El LPG también puede interactuar con la proteína C
reactiva y favorecer la fagocitosis a través del receptor de dicha proteína. Este
mecanismo no provoca la activación del macrófago. La entrada por el receptor
CD11b/CD18 es una ventaja para el parásito porque, a pesar de que los macrófagos
son potentes células presentadoras de antígenos (CPA), la entrada a través de este
receptor no provoca la activación del macrófago. Una vez en el interior del
macrófago, los parásitos se transforman en amastigotes, inhiben además la
producción de IL-12 por el macrófago y se dividen activamente. Eventualmente
abandonan el macrófago para entrar en otro. Hasta este momento la infección no
muestra ninguna manifestación clínicamente detectable.
Los primeros que llegan al sitio de la infección son los PMN Ellos fagocitan el
parásito pero no son la célula hospedera definitiva del mismo. Además, liberan IL-8
favoreciendo la llegada de un mayor número de PMN 8 y liberan quimiocinas como
MIP-1α/β y MIP-2 que atraen a los monocitos al sitio de inoculación, la interacción
provocaba la secreción de TNF e IL-12 por los macrófagos con la consecuente
destrucción de los parásitos y también permite la llegada de las células dendríticas
al sitio de inflamación marca el inicio de la respuesta adaptativa a la infección por
Leishmania fagocitando y presentando mas antígenos parasitarios para amplificar
la respuesta inmunológica.
Biología molecular de la leishmaniosis.
Los promastigotes procíclicos están cubiertos por un glicocálix grueso de 7 nm de
espesor. El glicocálix de los promastigotes metacíclicos es aún más grueso con
aproximadamente 17 nm de espesor; sin embargo, los amastigotes prácticamente
no tienen glicocálix. El glicocálix está compuesto por glicoproteínas y otras
sustancias glicosiladas que se encuentran ancladas a la membrana celular por una
unión de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Una de las moléculas más importantes de la
superficie de los promastigotes es el lipofosfoglicano (LPG). La estructura de LPG
varía según las especies de Leishmania pero básicamente está compuesto por
unidades repetitivas de un disacárido y un fosfato unidos a la membrana por el ancla
de GPI. Las variaciones en las cadenas laterales que se unen a la estructura central
de LPG son importantes entre las distintas especies de Leishmania. La L. major
tiene una estructura altamente ramificada; mientras que el LPG de L. donovani
prácticamente no tiene ramificaciones. El LPG juega un papel importante en la
supervivencia del parásito y en la modulación de la respuesta inmunológica del
hospedero.
La glicoproteína 63 (gp63) o Leishmaniolisina o proteasa mayor de superficie es una
proteinasa de superficie de 63 kDa. Se expresa en grandes cantidades (más de 500
mil copias) y está distribuida en todo el cuerpo del promastigote incluyendo el
flagelo. A pesar de esto, es 10 veces menos frecuente que el LPG. La gp63 es una
metaloproteinasa de zinc con un amplio rango de sustratos tales como caseína,
gelatina, albúmina, hemoglobina y fibrinógeno.6 La gp63 se relaciona con la entrada
del parásito al macrófago y favorece la fagocitosis y la sobrevida del amastigote
dentro del macrófago. También, afecta la función del complemento aumentando la
resistencia del parásito a la lisis mediada por complemento.
La molécula más abundante en la superficie de los promastigotes es el fosfolípido
de glicosilinositol (GIPL), un tipo de glicolípido con un ancla de GPI. El GIPL es 10
veces más abundante que el LPG; sin embargo, su tamaño pequeño lo mantiene
cerca de la membrana celular y cubierto por las moléculas de LPG. Se cree que
tiene un rol protector en la superficie del promastigote.