cortes de tejidos congelados o jados levemente en portaobje­ tos de vidrio 

para localizar un antígeno en células y tejidos. La reacción del anticuerpo 
con el antígeno puede entonces exa­ minarse y fotogra arse con un 
microscopio de uorescencia o un microscopio confocal que produce una 
reconstrucción tridimensional de los tejidos examinados ( g. 1­4). 

En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticu­ erpos: anticuerpos 
policlonales producidos por animales inmunizados y anticuerpos monoclonales 
producidos por líneas celulares inmortalizadas (duplicación continua). 

En un procedimiento típico, una proteína especí ca, como la actina, se aísla 
a partir de una célula muscular de una especie, p. ej. una rata, y se inyecta 
en la circulación de otra especie, p. ej. un conejo. En el conejo inmunizado, 
el sis­ tema inmunitario reconoce las moléculas de actina de la rata como un
antígeno extraño. Este reconocimiento desenca­ dena una cascada de 
reacciones inmunitarias que activan las células inmunitarias llamadas 
linfocitos B. Diferentes clones de linfocitos B se activan y eventualmente 
conducen a la producción y secreción de anticuerpos anti­actina. En con­ 
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Anticuerpo

junto, estos anticuerpos policlonales representan mezclas de diferentes 
anticuerpos producidos por muchos clones de linfocitos B donde cada clon 
reconoce diferentes regiones de la molécula de actina. Los anticuerpos se 
retiran de la san­ gre, se puri can y conjugan con un colorante uorescente. 
Éstos ahora sí se pueden utilizar para localizar moléculas de actina en 
tejidos o células de rata. Si la actina está presente en una célula o tejido, 
como un broblasto en el tejido con­ juntivo, el anticuerpo marcado con 
uoresceína se une a la misma y la reacción puede verse con el microscopio 
de uorescencia. 

Los anticuerpos monoclonales (cuadro 1­3) son los pro­ ducidos por una línea 
celular productora de anticuerpos que se derivó de un solo clon de linfocitos B.
Para producir anticuerpos monoclonales contra un antígeno especí co, se 
inmuniza un ratón o rata con ese antígeno. Los linfocitos B activados, que 
son de diferentes clonas, son aislados del tejido linfático (bazo o ganglios 
linfáticos) del animal y se fusionan con células de mieloma (células 
tumorales inmortales) para generar hibridomas. Esta fusión produce 
diferentes hibrido­ 

   
a
Antígeno

Anticuerpo secundario fluorescente

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Anticuerpo primario

b
FIGURA 1­5 ▲ Inmuno uorescencia directa e indirecta. a. En la inmunofluorescencia 
directa, un anticuerpo primario marcado con fluoro­ cromo reacciona con un antígeno 
específico dentro de la muestra de tejido. A continuación, las estructuras marcadas, se 
examinan con el microscopio de fluorescencia en el que una longitud de onda excitadora 
(por lo general luz ultravioleta) desencadena la emisión de otra longitud de onda. La 
longitud de esta emisión depende de la índole del fluorocromo utilizado para marcar el 
anticuerpo. b. El método indirecto comprende dos procesos. Primero, los anticuerpos 
primarios específicos reaccionan con el antígeno de interés. Segundo, los anticuerpos 
secundarios, que están marcados con fluorocromo, reaccionan con los anticuerpos 
primarios. La apariencia de las estructuras marcadas dentro del tejido es la misma en ambos
métodos y para verlas se necesita un microscopio de fluorescencia. 
    
9 

CUADRO1­3 Correlación clínica: anticuerpos 
monoclonales en medicina 
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En la actualidad, los anticuerpos monoclonales son de uso muy difundido en técnicas 
inmunocitoquímicas y tam­ bién tienen muchas aplicaciones clínicas. Los anticuerpos 
monoclonales conjugados con compuestos radiactivos se utilizan para detectar y 
diagnosticar metástasis tumorales en patología, diferenciar los subtipos de tumores y sus 
etapas de su diferenciación y en el diagnóstico de enferme­ 

dades infecciosas para identificar microorganismos en la sangre y en los líquidos de los 
tejidos. En estudios clínicos recientes, se han usado los anticuerpos monoclonales con­ 
jugados con inmunotoxinas, fármacos de quimioterapia o radioisótopos para administrar 
agentes terapéuticos a las células tumorales específicas en el cuerpo. 

CAPÍTULO 1 Técnicas HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA 
10  FIGURA 1­6 Microtúbulos vistos con técnicas inmunoci­ toquímicas. El comportamiento de los m
obtenidos de células de tumores de mamarios humanos puede estudiarse in vitro mediante la cuantifica
  iniciada por el centrosoma. Esta imagen se obtuvo con el microscopio de fluorescencia. Mediante el us
los microtúbulos se marcaron con una mezcla de anticuerpos monoclonales antitubulina a y antitubulin
visualizaron con anticuerpos secundarios conjuga­ dos con fluoresceína (inmunoglobulina G de cabra 
La reacción antígeno­anticuerpo, realizada directamente sobre el cubreobjetos de vidrio, permitió ver l
formación de más de 120 microtúbulos que aparecen en esta imagen. Estos se originan en el centriolo 
adquirir una distribución radial uniforme. 1 400 X. (Fotomicrografía gentileza de las Dras. Wilma L. L

mas, uno por cada clon de linfocito B activado fusionado a la célula del mieloma, qu
solo tipo de anticuerpo (monoclonal) y que al mismo tiempo es una célula inmortal. 
monoclonales contra moléculas de actina humana, los linfo­ citos B de los órganos li
esta actina deben fusionarse con células de mieloma, y pos­ teriormente identi car los
cuerpo monoclonal que reconozca a dicha actina. 

Para localizar un antígeno diana (o blanco) en células y teji­ dos, se utilizan técnicas inmu
indirectas. 

La técnica de inmunocitoquímica más antigua utilizada para la identi cación de la dis
células y tejidos se conoce como inmunofluorescen­ cia directa. Esta técnica utiliza un a
monoclonal) marcado con uorocromo que reacciona con el antígeno dentro de la mue
un solo paso, este método involucra un único anticuerpo marcado. La visualización d
baja intensidad de la emisión de la señal. Debido a la sensibilidad subóptima, los mé
están siendo reemplazados cada vez más por los métodos indirectos. 

La inmunofluorescencia indirecta proporciona una sen­ sibilidad mucho mayor que los m
nombre de “técnica del emparedado” o “de la capa doble”. En lugar de conjugar un u
especí co dirigido contra el antígeno de interés (p. ej., una molécula de actina de rata

tanto, cuando la uoresceína se conjuga directamente con el anticuerpo primario espec
uoresceína se conjuga con un anticuerpo secundario, el método es indirecto. El méto
considerable la emisión de la señal de uorescencia del tejido. Una ventaja adicional d

Es que un solo anticuerpo secundario se puede utilizar para localizar la unión especí 
primarios ( g. 1­6). Para los estudios microscópicos, el anticuerpo secundario puede 
uorescentes de modo que se vean múltiples marcas en el mismo corte de tejido (v. g.
 uorescencia indirecta son que es cara, requiere de mucho trabajo y no se adapta con f
automatizados. 

También es posible conjugar anticuerpos policlonales o monoclonales con otras susta
roxidasa de rábano), que convierten sustratos incoloros (p. ej., DAB) en un producto
precipita en el sitio de la reacción enzimática. La tin­ ción que resulta de este método 
el microscopio óptico (v. g. 1­3b), ya sea con técnicas inmunocitoquímicas directas o
coloidal o ferritina (una molécula que contiene hierro) se pueden unir a la molécula d
en electrones pueden verse directa­ mente con el microscopio electrónico. 

Técnicas de hibridación 
La hibridación es un método de localización de ARN men­ sajero (ARNm) o ADN median
interés con una sonda de nucleótidos de secuencia complementaria. 

CAPÍTULO 1  Técnicas 
se conjuga con un  HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA 
anticuerpo secundario  dirigido contra el 

En general, el término hibridación describe la capacidad de las moléculas monocatenarias de A
(hibridar) con secuencias complementarias. En el labora­ torio, la hibridación requiere el aisl
mezcla a continuación con una secuencia de nucleó­ tidos complementaria (denominada sond
detectan más a menudo usando un marcador radiactivo unido a un componente del híbrido. 

La unión de la sonda y la secuencia puede tener lugar en una solución o en una membrana de
situ, la localización del ARNm o ADN es­ pecí co (p.ej., ARNm para insulina) se realiza direc
tejidos, como células de cultivo o em­ briones enteros, adicionando la sonda de nucléotidos m
técnica permite la localización de secuencias de nucleótidos especí cas tan pequeñas como 10
por célula. 

En la hibridación in situ se utilizan diversas sondas de nucleótidos. Las sondas de oligonucleótid
de 20 a 40 nucleótidos. Las sondas de ADN monocatenario o bicatenario son mucho más larg
000 nucleótidos. Para la localización especí­ 

ca del ARNm, se utilizan sondas de ARN complementarias. 

Estas sondas se marcan con isótopos radioactivos (p. ej., 32P, 
CAPÍTULO 1 Técnicas HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA 

12 
TABLA 1­3 
 
  
Distancia entre los puntos que se resuelven 

Ojo humano 

Microscopio óptico de campo claro 

MEB 

METEn la teoría En la práctica 

Microscopio de fuerza atómica 

0,2 mm 

0,2 mm 

2,5 nm 

CAPÍTULO 1  Técnicas MICROSCOPÍA 
0,05 nm 1,0 nm 

13 
 
 CAPÍTULO 1 Técnicas MICROSCOPÍA 

14 
 

 
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CAPÍTULO 1 Técnicas MICROSCOPÍA 

 
15 

Consideraciones funcionales: Uso 
CUADRO 1­4 
correctodel microscopio óptico 
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Esta breve introducción al uso correcto del microscopio óptico se dirige a aquellos 
estudiantes que usarán el microscopio para el examen de rutina de los tejidos. Si los 
comentarios siguientes parecen elementales, sólo se debe a que la mayo­ ría de los usuarios 
del microscopio no lo hacen aprovechando todas sus ventaja. A pesar del equipo sofisticado
del que disponemos en la actualidad, en muchos casos se carece 

de instrucción formal necesaria sobre el uso correcto del mi­ croscopio óptico. 

Los sistemas ópticos costosos y muy corregidos sólo pueden funcionar de forma óptima 
cuando los trayectos de los haces de iluminación y de observación están centrados y tienen 
un ajuste correcto. El uso de ajustes y alineamientos adecuados contribuirá sustancialmente 
al reconocimiento de detalles muy diminutos de la muestra y a la manifestación fidedigna 
de los colores para la visión directa o mediante la fotomicrografía. 

La iluminación Köhler es una de las claves de la buena microscopía y está incorporada en 
el diseño de prácticamente todos los microscopios modernos que se usan en laboratorios o 
para la investigación. En la figura C1­4.1 se ilustran los dos trayectos de los rayos 
luminosos y todos los controles de ajustes de un microscopio moderno; es necesario seguir 
las instrucciones que se dan a continuación para obtener una ilu­ minación adecuada en el 
microscopio. 

• Se enfoca el condensador moviéndolo hacia arriba o hacia abajo hasta que el contorno de 
su diafragma de campo aparezca bien nítido (en foco). 

• Se centra el diafragma de campo con los controles de centrado de la subplatina (donde 
está el condensador). Después se abre el diafragma de campo hasta que el haz luminoso 
cubra todo el campo observado. 

• Se retira el ocular (o se usa un telescopio de centrado oun accesorio telescópico de fase si 
se dispone de ellos)y se observa la pupila de salida del objetivo. Así se veráun campo 
circular iluminado cuyo radio es directamente proporcional a la abertura numérica del 
objetivo. A medida que se cierra el diafragma del condensador, su contorno aparecerá 
dentro de este campo circular. Para la mayor parte de los preparados teñidos, el diafragma 
del conden­ sador debe cerrarse hasta cubrir aproximadamente dos terceras partes de la 
abertura del objetivo. El resultado de este ajuste es el mejor equilibrio entre la resolución y 
el contraste (que no es más que la diferencia de intensidades entre las regiones claras y 
oscuras de la muestra). 

Si se ponen en práctica estos cinco consejos simples, la imagen obtenida será la mejor que 
permita la óptica del mi­ croscopio. Ahora veamos por qué. 

Primero, ¿por qué ajustamos el diafragma de un campo para cubrir sólo el campo 
observado? El iluminar un campo más grande que el sistema óptico puede “ver” sólo 
conduce a reflexiones internas o una pérdida de luz lo cual trae como consecuencia más 
“ruido” o una disminución del contraste de la imagen. 

Los pasos del ajuste necesarios para conseguir una buena iluminación Köhler son pocos y 
sencillos: 

• Se enfoca la muestra 

• Se cierra el diafragma de campo 

Ocular

Tubo

Objetivo

Lente condensador auxiliar Platina Diafragma del condensador Condensador

Ajuste de la platina Diafragma de campo

Fuente luminosa

Cámara tubular opcional

       
         
FIGURA C1­4.1 ▲ Diagrama de un microscopio óptico típico. Este dibujo muestra un 
corte transversal del microscopio, sus componentes ope­ racionales y el trayecto de la luz. 

Ajuste

de foco

(Continúa en página 16) 
   

 
 CAPÍTULO 1 Técnicas MICROSCOPÍA 

16   
Consideraciones 
 
funcionales: uso correcto 
del microscopio 

CUADRO 1­4 
óptico (cont.) 
Segundo, ¿por qué se pone énfasis en el 
ajuste del diafragma del condensador o, en 
otras palabras, en la abertura de ilu­ 
minación? Este diafragma ejerce gran 
influencia sobre la resolución y el contraste 
con que se pueden observar ciertos detalles 
de la muestra. 

Para la mayoría de las aplicaciones 
prácticas, la resolución está determinada por
la ecuación 

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refracción de un haz oblicuo o uno de 
abertura mayor. Este ángulo se mantiene 
esencialmente constante, pero se le presenta
al objetivo de manera tal que puede ser 
captado con facilidad. 

¿Cómo afecta al contraste el ajuste de la 
abertura? En teoría lo más cercano a la 
transferencia real de contraste entre la 
muestra e imagen se obtendría por la 
interacción (interferencia) entre los rayos no
refractados y todos aquellos refractados. 

Para la transferencia de contraste entre 
transmisión total y absorción completa en 
una muestra, la relación de intensidad entre 
la luz refractada y la no refractada tendría 
que ser 1:1 para obtener una interferencia 
destructiva total (negro) o una interferencia 
constructiva total (blanco). Cuando la 
abertura del condensador es igual a la 
abertura del objetivo, la luz no refractada 
penetra el objetivo con intensidad completa 
pero la luz refractada sólo puede hacerlo de 
forma parcial, lo cual produce una 
disminución del contraste. En otras 
palabras, cerrando la abertura del 
condensador hasta las dos terceras partes de 
la abertura del objetivo se consigue una 
relación de intensidad entre la luz refractada
y la luz no refractada que se acerca a 1:1 y 
en consecuencia optimiza el contraste. Si se 
cierra la abertura del condensador (o se baja
el condensador) y se pierde este equilibrio, 
se producirán fenómenos de inter­ ferencia 
o artefactos de la imagen, como anillos de 
refracción o líneas que rodean las distintas 
estructuras de la muestra. La mayor parte de
las técnicas microscópicas empleadas para 
aumentar el contraste (p. ej., campo oscuro, 
iluminación oblicua, contraste de fase, 
modulación de contraste) tiene su 
 fundamento en el mismo principio, es decir 
que suprimen o reducen la intensidad de la 
luz no refractada para mejorar un contraste 
de la muestra que es inherentemente bajo. 

Si se siguen los pasos descritos y se 
mantienen limpias las lentes, la calidad y la 
fidelidad de las imágenes observadas sólo 
variarán de acuerdo con la capacidad de 
funcionamiento del sistema óptico. 

Otros sistemas ópticos 
Además del microscopio de campo 
claro, de uso habitual en el examen 
de rutina de los preparados 
histológicos, en los la­ boratorios 
clínicos y de investigación se 
CAPÍTULO 1 Técnicas  MICROSCOPÍA 
FIGURA 1­11 ▲ Diagrama de la luz 
emitida en foco y fuera de foco en el 
microscopio confocal. a. Este diagrama 
muestra la trayectoria del haz láser y de la 
luz emitida cuando la estructura formadora 
de imágenes está directamente en el foco de 
la lente. La pantalla con un orificio pun­ 
tiforme al otro lado del sistema óptico del 
microscopio confocal permite que la luz de la
estructura en foco atraviese el orificio. 
Posteriormente, programas informáticos 
traducen la luz en una imagen. Debido a que 
el punto focal de la lente del objetivo del 
microscopio forma una imagen nítida a la 
altura en la que está el orificio puntiforme, 
estos dos puntos se denominan puntos con­ 
focales. b. Este diagrama muestra el tra­ 
yecto del haz láser y de la luz emitida, que 
está fuera de foco en relación con el orificio 
puntiforme. Por lo tanto, la luz de la muestra 
bloqueada por el orificio puntiforme nunca se
detecta. 

Detector

 
Abertura del detector (orificio puntiforme)

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Lente del fototubo