Práctica 1.

Inflamación: Diagnóstico por el laboratorio

Introducción
El primer suceso en la inflamación aguda es la liberación de señales químicas (quimiocinas)
que inducen la expresión de moléculas de adhesión (selectinas) en el endotelio de los capilares
locales. El movimiento de los polimorfonucleares (PMN) que transitan por el sitio se hace más
lento y expresan integrinas adhesivas en su superficie. La interacción entre moléculas de
adhesión del endotelio y de los leucocitos conduce a una unión firme de los PMN al endotelio,
seguida del paso de las células a través de la pared endotelial a los tejidos subyacentes. Allí,
los factores quimiotácticos liberados por las bacterias o por las células del huésped conducen
a los PMN al sitio de infección. La liberación de histamina por los mastocitos, de ácido
araquidónico y de prostaglandinas amplifica el proceso inflamatorio. Ante el primer ataque,
las señales químicas movilizan células al sitio inflamado, facilitan la extravasación de líquidos
y otros mediadores para contener, combatir y sanar el tejido afectado (Ryan & Ray, 2011). La
presencia de leucocitos en una muestra directa del sitio afectado es indicativa de inflamación,
y la cantidad relativa (escasos, moderados, abundantes) de los mismos sugiere la intensidad
del proceso. Las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1 e IL-6 son las principales señales que
inducen la respuesta de fase aguda. TNF- α estimula la liberación de factores de la coagulación
por células endoteliales vasculares, lo que da lugar a coagulación de la sangre en capilares.
Estas tres citocinas proinflamatorias también actúan sobre los hepatocitos induciendo la
secreción de proteínas de fase aguda (proteínas APR) por el hígado. Una proteína APR
sintetizada en el hígado es la proteína C reactiva (CRP), opsonina que actúa contra el patógeno
opsonizándolo y facilitando su fagocitosis. En condiciones normales, la CRP está en
concentraciones bajas en sangre (~1 mg/L ó 0.1 mg/dl), su concentración aumenta durante la
respuesta de fase aguda. La concentración sanguínea de CRP se considera un indicador de la
magnitud de la inflamación (Owen, et. al., 2014). Luego de un estímulo inflamatorio, la
concentración de CRP aumenta rápidamente, por encima de 0.5 mg/dl en las primeras 6 horas
y alcanza un pico máximo en 48 horas, el cual refleja la extensión de la lesión. Cuando el
estímulo desaparece, los niveles de CRP disminuyen a su estado basal en aproximadamente
18 horas. La concentración plasmática de CRP permanece elevada en procesos inflamatorios
crónicos como la artritis reumatoide (AR), tuberculosis pulmonar o neoplasias extensas. Por lo
general, la CRP es más sensible que la velocidad de sedimentación globular (VSG) y, a diferencia
de ésta, no varía con la edad, con la morfología de los eritrocitos ni con las variaciones de otras
proteínas (González & Molina, 2010).
Para indagar sobre respuesta inflamatoria de fase aguda se mide la VSG, prueba ampliamente
utilizada para detección y seguimiento de enfermedades infecciosas, enfermedades malignas
y otras que afectan a las proteínas del plasma y la velocidad de sedimentación (Jou, et al. 2011).
La VSG es una medida indirecta de la concentración de proteínas de fase aguda; se modifica
por variables como la viscosidad plasmática, el tamaño, forma y número de eritrocitos y las
fuerzas de repulsión entre ellos, determinadas por el ácido siálico en su superficie, cuya carga
negativa actúa repeliendo a otras células rojas. El incremento de las proteínas de fase aguda,
como el fibrinógeno, la proteína de unión a manosa, amiloide sérico A y proteínas del
complemento, se traduce en un aumento de la agregación de los eritrocitos (formación de
pilas de monedas o Fenómeno de Rouleaux) y en un incremento de la VSG. La VSG varía con el
género y la edad. El método más sensible para determinar VSG es el de Westergren. Los valores
normales en adultos menores de 50 años es de 0 a 15 mm/hora en hombres y de 0 a 20
mm/hora en mujeres. La VSG se eleva 48 horas luego de iniciarse el proceso inflamatorio y se
normaliza 10 días después de haberse resuelto. También aumenta con la edad y en mayores
de 50 años, el valor normal se obtiene dividiendo la edad en años por dos (González & Molina,
2010).
Las respuestas inmunitarias e inflamatorias por lo general se limitan por sí solas, de modo que
una vez que el agente patógeno y el tejido dañado son eliminados, la inflamación por lo general
disminuye y los tejidos sanan. La persistencia de agentes patógenos o de sustancias
perjudiciales pueden causar inflamación crónica, daño tisular y enfermedad continuos (Owen,
et. al., 2014). La inflamación crónica agrupa las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.
En este proceso, la infiltración celular está compuesta de linfocitos y macrófagos, con un
número relativamente pequeño de PMN. La inflamación crónica se asocia con patógenos de
lento crecimiento, como las micobacterias, hongos y parásitos, para los que la inmunidad
mediada por células (TH1) es la defensa adaptativa principal. Muchos de estos patógenos
tienen mecanismos que les permiten multiplicarse en macrófagos no activados. Si las células T
activan efectivamente a los macrófagos, cesa la multiplicación, y la inflamación y lesión son
mínimas. En caso contrario, la multiplicación y la inflamación crónica continúan, a veces en
forma de un granuloma, que es una indicación de un componente de hipersensibilidad
destructiva en la inflamación (Ryan & Ray, 2011).

Habilidades

 Interpreta correctamente los resultados de las pruebas de laboratorio para

diagnosticar inflamación.
 Sigue correctamente un protocolo para asegurar la confiabilidad del resultado

Material y métodos
A) Equipo

 Microscopio óptico
 Centrífuga
 Agitador mecánico
B) Material

 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Torniquete
 Jeringa de 3 ml
 Gasas
 Torundas
 Tubos de Wintrobe o pipetas de Westergren
 Tubos de 4 ml con anticoagulante (EDTA)
 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
 Gradilla para tubos de ensaye
 Gradilla pata tubos de Wintrobe o pipetas de Westergren
 Cánulas
 Placas de fondo negro
 Pipetas Pasteur
 Pipetas automáticas de 1000 ul
 Hisopos estériles

C) Soluciones, biológicos y reactivos

 Reactivo de látex para proteína C reactiva

 100 ml de solución de Wright
 250 ml de buffer de fosfatos de pH 6.4 para tinción de Wright
 100 ml de solución de cristal violeta para tinción de Gram
 100 ml de lugol para tinción de Gram
  100 ml de solución de safranina para tinción Gram
 100 ml de alcohol-acetona para tinción de Gram
 50 ml de solución salina (NaCl) al 0.85%.
 50 ml de agua destilada
 Etanol
d) Muestras biológicas

 5 ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA

 50 ml de orina, aproximadamente, del chorro medio de la primera orina de la mañana
 Muestra de exudado faríngeo
 Suero

Procedimientos
Toma de muestra
1. Tomar la muestra de exudado faríngeo a partir de una persona que refiera molestias de
garganta, sin tratamiento con antibióticos o antiinflamatorios, sin aseo bucal y en ayunas,
haciendo uso de los hisopos estériles.
2. Descargar la muestra haciendo rotar el hisopo sobre un portaobjetos limpio. La rotación
debe ser suave, sin friccionar vigorosamente, con el objeto de mantener lo más intacta posible
la estructura celular.
3. Fijar inmediatamente los extendidos al calor y teñir por la técnica de Gram (descrita en el
apéndice de este manual).
4. Tomar una muestra de sangre periférica anticoagulada con EDTA.
5. Hacer extendido sanguíneo a partir de la sangre anticoagulada, dejar secar y teñir por la
técnica de Wright (descrita en el apéndice de este manual).

Examen del sedimento urinario

1. Homogenice la muestra de orina y llene con ella un tubo de 13 x 100 mm. Centrifugue a
1500 rpm, durante 5 min.
2. Elimine el sobrenadante. Resuspenda el sedimento en la cantidad de orina que le haya
quedado. Con esta suspensión haga una preparación entre porta y cubre objetos.
3. Observe al microscopio con objetivo de 40X en busca de leucocitos, microorganismos y
células. Saque el promedio de leucocitos observados en un total de 10 campos y repórtelos en
No. / campo.
Detección y cuantificación de la proteína C reactiva
Siga las instrucciones del inserto que acompaña al Kit de reactivos que usará para realizar la
prueba
Determinación de la velocidad de sedimentación globular
1. Extraer sangre venosa (1-2 ml) y homogenizar con anticoagulante (EDTA).
2. Con una cánula llenar con sangre el tubo de Wintrobe hasta donde indique la marca.
3. Colocar el tubo con sangre en la gradilla, asegurándose de que el tubo quede en una
posición de 90° con respecto a la superficie.
4. Colocar la gradilla en un lugar libre de vibraciones y de factores que pueda modificar
la velocidad con que los eritrocitos caen al fondo del tubo.
5. Dejar transcurrir 60 minutos.
6. Leer la sedimentación eritrocitaria, se expresa en mm/hrs.

Resultados
a) Interpretación

 Valoración de los exudados o muestra directa de sitio inflamado: Para que los extendidos
se consideren representativos, deberá considerarse el número de células epiteliales o de
leucocitos presentes.
 Criterios: Se considerará que el paciente cursa con un proceso inflamatorio cuando en la
preparación se encuentre un promedio de 8 a 10 leucocitos por campo de gran aumento,
en por lo menos 10 campos leídos. En este caso la respuesta inflamatoria exudativa (RIE)
se considerará escasa, a partir de esta referencia el analista reportará en términos
relativos: escaso, moderado ó abundante.
 En el sedimento urinario un número de 0-8 leucocitos por campo es considerado como
normal (Strasinger & Di Lorenzo., 2010).
 Interpretación de la prueba cualitativa de la PCR en látex: Una reacción negativa se
indica por la suspensión uniforme, sin muestras de aglutinación en la mezcla de reacción,
indica que las muestras de suero contiene una concentración de PCR menor de 6 mg/L.
Un resultado es positivo cuando hay aglutinación en la reacción e indica presencia de CRP
sérica en una concentración mayor de 6 mg/L.
 Interpretación de resultados de la VSG: Los mm/h recorridos por los glóbulos rojos se
compararán con los valores de referencia

b) Reporte de resultados (observación microscópica de exudados)

El informe de laboratorio deberá contener una descripción detallada de las células
observadas y de los microorganismos encontrados e indicar sus cantidades (escasas,
moderadas y abundantes). La papeleta de resultados incluirá:
Resultados de Laboratorio
Nombre: ______________________________________________Edad:______ Género: ____
Examen de laboratorio practicado: _______________________________________________

Resultados
Resultado Valores de referencia
VSG
CRP

Examen microscópico
Células: especificar el tipo y número de células observadas (epiteliales, leucocitos)
Microorganismos: Anotar el mayor número de características posibles de los m.o. que logre
detectar en la muestra y la cantidad relativa de los mismos
Intensidad de la reacción inflamatoria ó No. de leucocitos por campo, dependiendo de la
muestra analizada

____________________________________________
Practicó

Lugar y fecha _______________________________________

Observaciones

 Anote los factores o sucesos que ocurran durante los procedimientos y que puedan
modificar los resultados de las determinaciones
Análisis de los resultados
¿Hubo factores o desvío en los procedimientos que pueden alterar los resultados? ¿Considera
que las muestras fueron obtenidas en óptimas condiciones y que son representativas de lo que
se evaluó? ¿Los procedimientos se llevaron a cabo con la máxima calidad? (Considere los
factores conocidos como errores pre-analíticos y errores analíticos)
¿Se pueden mejorar los resultados? ¿Qué sugiere para ello? ¿Tuvo dificultades para identificar
las células que se encuentran presentes en la inflamación? ¿Podría hacerlo con mayor facilidad
en ocasiones futuras? ¿Contaba usted con la información necesaria para identificar células que
participan en la inflamación?

Interpretación de resultados
Conclusiones

Referencias
1. Owen JA., Punt J., Stranford SA ., Kuby J. (2014). Kuby Inmunología. 7ª Edición. España:
Editorial Mc Graw Hill. pp. 166-173.
2. Ryan KJ., Ray CG. (2011). Microbiología Médica. 5ª Edición. EUA: Editorial Mc Graw Hill.
pp. 21-22.
3. Jou MJ., Lewis SM., Briggs C., Lee SH., De La Salle B., Mcfadden S., 2011. ICSH review of the
measurement of the erythocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory
Hematology, 33(2), pp.125–132.
4. Strasinger SK.,Di Lorenzo SM.(2010). Análisis de orina y de los líquidos corporales. 5ª Edición.
Buenos Aires:Editorial Médica Panamericana, Pp 82-85.
5. González, L.A. & Restrepo, F.M., 2010. Evaluación de la inflamación en el laboratorio.
Revista Colombiana de Reumatología, 17(1), pp.35–47

Cuestionario
1. ¿Qué es un exudado?
2. ¿Cuáles son las células características de una inflamación aguda?
3. ¿Cuáles son las proteínas de fase aguda de la inflamación? ¿Cuál o cuáles de ellas tienen
utilidad en el diagnóstico por el laboratorio?
4. Enlista las citocinas proinflamatorias.
5. ¿Cuáles son las causas de la inflamación crónica? Menciona algunos ejemplos
6. ¿Cuáles son las células características de inflamación crónica? ¿Cómo varía la
concentración de CRP en una inflamación crónica?
7. ¿Qué factores pueden modificar los valores de la VSG? ¿Qué valores de VSG se pueden
encontrar en enfermedades inflamatorias crónicas? Mencione ejemplos
8. ¿Qué métodos se pueden usar para determinar la CPR? ¿Cuál de ellos es el más sensible?
Apéndice

Tinción de Gram
1. Hacer un extendido de la muestra (Exudado) en un portaobjetos
2. Fijar inmediatamente al calor y teñir.
3. Cubrir el portaobjetos con la solución de trabajo el colorante cristal violeta durante 1 minuto
y enjuagar con agua corriente
4. Cubrir el portaobjetos con lugol durante 1 minuto y enjuagar con agua corriente
5. Eliminar el exceso de colorante con alcohol acetona de 10 a 15 segundos y enjuagar con
agua corriente.
6. Añadir colorante Safranina durante 1 minuto y enjuagar con agua corriente y dejar secar a
temperatura ambiente.

Tinción de Wright
1. Hacer extendido sanguíneo a partir de la sangre anticoagulada y dejar secar
2. Teñir la preparación con colorante de Wright durante 8 minutos.
3. Añadir buffer de fosfatos (pH 6.4) durante 10 minutos y soplar con una perilla para mezclar
con el colorante hasta formar una capa verde metálico.
4. Lavar con agua corriente
5. Secar al aire y observar el extendido al microscopio con aceite de inmersión con el objetivo
de 100X para realizar el conteo diferencial de leucocitos.