2.3.13 Encefalopatia Espongiforme Bovina

CAPÍTULO 2.3.13.
ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA
RESUMEN
La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurológica, mortal, reconocida

por primera vez en 1986 en Inglaterra. Los cambios patológicos, el modelo epidemiológico y la
transmisión indican que la EEB es una de las encefalopatías espongiformes causadas por agentes
infecciosos no convencionales o priones. El arquetipo de este grupo de enfermedades es el prurigo
lumbar de las ovejas y las cabras (ver Capítulo 2.4.8. Prurigo lumbar).
La epizootia actual de la EEB se puede explicar por la exposición oral a un agente semejante al del
prurigo lumbar en las proteínas derivadas de rumiantes que se incluían en los concentrados
cárnicos patentados como comida o en suplementos alimenticios. Los casos iniciales de EEB en
otros países parecen ser el resultado de exportaciones de ganado infectado de Inglaterra o de
comida con derivados cárnicos contaminados, aunque ahora se implican también exportaciones de
otros países. Otros casos iniciales son claramente autóctonos, sin una relación clara con alimentos
cárnicos importados, lo que sugiere la existencia de casos previos no detectados. En Julio de 1988
se aplicó en Inglaterra la prohibición de alimentar a los rumiantes con proteínas derivadas de
rumiantes. Desde entonces, salvo ciertas excepciones, en toda la Unión Europea y en algunos
otros países se ha prohibido la alimentación de los rumiantes con proteínas derivadas de
mamíferos. Desde Abril de 1996, ésta prohibición respecto a la alimentación con derivados
cárnicos de mamíferos se ha extendido en Inglaterra a todos los animales de granja. La decisión
2000/766/EC de la Comisión Europea de diciembre del año 2000 incluyó una prohibición temporal
de la alimentación de animales de granja para producción alimentaria con proteínas procesadas de
origen animal. Se ha demostrado la transmisión experimental de la EEB al ganado bovino después
de la exposición parenteral y oral a tejido cerebral de ganado bovino afectado. Como consecuencia
de estas medidas de control, la epizootia está ya en descenso en algunos países europeos, como
Inglaterra y Suiza. En la actualidad se presentan casos de EBE en la mayor parte de Europa, y
también se han detectado en Asia y en Norteamérica.
Se sospecha que el agente de la EEB es la fuente común de encefalopatías espongiformes

transmisibles (EET) en otras especies de bóvidos y de félidos. Existe evidencia de una relación
causal entre el agente de la EEB y una nueva forma variante de EET, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD).
En Inglaterra la EEB presenta una mayor incidencia en el ganado bovino de entre 4 y 5 años. La
duración clínica es variable pero puede prolongarse durante varios meses. Los síntomas clínicos
observados son lo bastante llamativos como para sospechar la existencia de la enfermedad,
particularmente si se eliminan otros diagnósticos diferentes. Los primeros síntomas clínicos suelen
ser sutiles y pueden llevar a la eliminación de animales afectados antes de que se dispare la
sospecha de EEB. En países con una política establecida contra la enfermedad, los casos
clínicamente sospechosos deben sacrificarse, analizarse los cerebros y destruirse las
correspondientes canales. La confirmación del diagnóstico se basa fundamentalmente en el
examen inmunohistoquímico del cerebro (IHQ). Solamente se han descrito lesiones en el sistema
nervioso central (SNC). Las recomendaciones sobre precauciones de seguridad en el manejo de
material infectado con EEB consideran que la EEB es una zoonosis adscrita actualmente al nivel 3
de contención (con derogación).
Identificación del agente: En la actualidad no existe ninguna prueba diagnóstica para la detección
del agente de la EEB en el animal vivo. La naturaleza de los agentes que causan las EET no está
clara. En la patogénesis de estas enfermedades presenta una importancia crítica una isoforma de
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 593

Capítulo 2.3.13. — Encefalopatía espongiforme bovina
una proteína de membrana PrP1 (denominada PrPres) que es específica de la enfermedad y

parcialmente resistente a proteasas, y que según la hipótesis del prión constituye el único
componente del agente infeccioso.
Para confirmar el diagnóstico de la encefalopatía espongiforme, es necesario realizar un examen

histológico e inmunohistoquímico del cerebro. Con una experiencia clínica y patológica adecuada,
la correlación en la EEB entre el diagnóstico clínico y el neurohistológico puede superar el 90%. El
examen histopatológico también puede aportar un diagnóstico diferencial en casos en los que no
se detectan lesiones de EEB. La lesión patognomónica es una combinación de un cambio
espongiforme en la materia gris del cerebro y una vacuolización neuronal de algunos núcleos
cerebrales. Normalmente, aunque no siempre, este cambio presenta simetría bilateral. La
detección en el SNC del ganado bovino afectado de acumulaciones de PrP anormal (PrPres)
mediante métodos inmunoquímicos específicos representa una aproximación al diagnóstico
específico de la enfermedad. En extractos de cerebros no fijados, se puede detectar PrPres por
inmunotransferencia u otros métodos de inmunoensayo. En cerebros fijados con formalina, se
pueden demostrar las disposiciones características de las acumulaciones de PrP específicas de la
enfermedad mediante métodos inmunohistoquímicos. Ambos enfoques se utlizan ampliamente en
la actualidad como métodos de diagnóstico confirmativo y se recomiendan como adicionales al
examen histológico. No debería establecerse un diagnóstico negativo basándose únicamente en la
ausencia de vacuolización detectable. Los métodos IHQ y otros métodos de detección de PrP
pueden proporcionar un diagnóstico de EEB en animales que parecen clínicamente normales, con
lesiones espongiformes mínimas en el cerebro (o sin ellas). En los extractos tratados con
detergente de cerebros no fijados (o fijados con formalina) y afectados por EEB, se pueden
visualizar por microscopía electrónica fibrillas características, que son homólogas a las fibrillas
asociadas con el prurigo lumbar y que están compuestas por PrPres. Este punto de vista se ha
utilizado también para confirmar el diagnóstico, pero carece de la sensibilidad de los métodos
inmunoquímicos estándar.
La EEB se puede transmitir al ratón mediante la inoculación intracerebral o intraperitoneal de tejido

cerebral de ganado bovino con afección terminal o por la alimentación, pero los períodos de
incubación, de varios meses, excluyen este bioensayo para una utilización de rutina. Éste es el
único método práctico actualmente disponible para detectar la infectividad.
Pruebas serológicas: En las EETs no se han detectado respuestas inmunes específicas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En la actualidad no existen

productos biológicos disponibles. En muchos países se utilizan para el diagnóstico de la EEB kits
comerciales.
A. INTRODUCCIÓN
Se ha descrito previamente un detallado informe en ingles, en francés y en español (55), sobre la encefalopatía
espongiforme bovina (EEB), su trasmisión experimental (20, 39), su distribución, epidemiología, síntomas
clínicos, patología, diagnóstico, prevención y control. Revisiones más recientes contienen información
actualizada (2, 16, 17, 26, 28, 36, 46, 62, 65, 80, 81, 96). De modo invariable, la EEB es una enfermedad mortal
del ganado bovino, cuyos casos se reconocieron por primera vez en Inglaterra en Noviembre de 1986 (92). La
EEB pertenece al grupo de las enfermedades conocidas como encefalopatías espongiformes transmisibles (EET)
o enfermedades priónicas, tipificadas en las especies animales por el prurigo lumbar de las ovejas. Estas
enfermedades se definen por la acumulación patológica de una isoforma anormal, parcialmente resistente a
proteasas, de una proteína codificada por el hospedador (PrP), que se designa como PrPres. La acumulación
tiene lugar principalmente en el sistema nervioso central (SNC), aunque también en el tejido linforeticular y en los
tejidos nerviosos periféricos. Los estudios retrospectivos indican que los primeros casos de EEB se presentaron
en Abril de 1985. Los estudios epidemiológicos iniciales establecieron que la presencia de EEB presentaba la
forma de una fuente epizoonósica común y extendida, debida a una infección transmitida por los alimentos, con
un agente semejante al del prurigo lumbar presente en las harinas producidas de derivados cárnicos y utilizadas
en las dietas como suplemento proteico.
Además de en Inglaterra, en otros países se ha presentado EEB en ganado bovino importado y/o en ganado
bovino autóctono. Probablemente, el origen de tales casos esté relacionado directa o indirectamente con la
1 PrP: Proteína prión.
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exportación de ganado bovino infectado o en alimentos contaminados de países con presencia de EEB,
incluyendo históricamente a Inglaterra. Parece claro que la infección se ha propagado después dentro de los
países donde tuvieron lugar los casos (24, 25, 31). En algunos países, los únicos casos detectados reflejan una
exposición endógena más bien que una relación directa con la importación de alimento contaminado. Se han
registrado casos de EEB dentro de la población bovina autóctona fuera de Inglaterra, en la mayoría de los países
europeos y en algunos otros donde se han establecido sistemas eficaces de seguimiento y control. Éstos
incluyen Austria, Bélgica, Canadá, la República Checa, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania, Grecia, Irlanda,
Israel, Italia, Japón, Liechtenstein, Luxemburgo, Países Bajos, Polonia, Portugal, Eslovaquia, Eslovenia, España
y Suiza. Para estadísticas actuales sobre la EEB en el mundo, los lectores deben consultar la página Web de la
OIE.
A partir de Julio de 1988 en Inglaterra, y de Enero de 1989 en Irlanda del Norte, se prohibió la alimentación de
rumiantes con proteínas derivadas de rumiantes. Con algunas excepciones, la prohibición de alimentar a los
rumiantes con proteínas derivadas de mamíferos se ha introducido desde entonces en otras partes: en Suiza en
Diciembre de 1990 (86) y en la Unión Europea en Junio de 1994 (62). En Inglaterra, desde Abril de 1996, esta
prohibición de la Unión Europea para proteínas presentadas en forma de harinas de derivados cárnicos, se
extendió a todos los animales de granja, incluyendo caballos y peces. Desde Enero de 2001, la utilización de
piensos con derivados cárnicos de mamíferos y de peces está prohibida en toda la Unión Europea (32).
Se ha demostrado experimentalmente que la EEB puede transmitirse al ganado por vía parenteral y oral después
de la exposición a tejido cerebral de ganado afectado (20, 90). Estudios epidemiológicos británicos han revelado
un mayor riesgo en la descendencia de casos clínicos de EEB para desarrollar la enfermedad (27, 29, 30, 38,
98). No se ha establecido si esto se debe a una verdadera transmisión materna. Se considera que este riesgo no
es la causa del mantenimiento de la infección endémica de la población bovina en Inglaterra, y las estimaciones
de este riesgo se han revisado posteriormente a la baja (26). No existe evidencia de transmisión horizontal de
EEB en el ganado bovino. Los estudios epidemiológicos y de transmisión no han encontrado evidencias de
riesgo en el semen (100), en la leche (58, 84) ni a través de embriones (100, 101). A consecuencia de las
medidas de control, la epizootia en Inglaterra y Suiza ha descendido (48), y en otras partes muestra los primeros
efectos del control en forma de cambios en la incidencia de la edad específica (24, 31, 65). En algunos países no
se han ejercido controles lo suficientemente largos como para reconocer los efectos. La interpretación del estado
de la epizootia en Europa se ha visto favorecida por la introducción de un seguimiento activo mediante pruebas
de diagnóstico rápido, que han confirmado la infección en el ganado con síntomas clínicos y han detectado
también animales infectados que no se habían reconocido por no haber llegado al punto de la manifestación
clínica. La investigación retrospectiva en las granjas de origen de la enfermedad confirma, con frecuencia, que se
presentan algunos síntomas previos al sacrificio, pero no han despertado la consideración suficiente como para
establecer sobre ellos un diagnóstico de la EEB.
Durante el transcurso de la epizootia de EEB se ha sospechado la existencia de EETs en varias especies de

bóvidos y felinos exóticos mantenidos en cautividad y en gatos domésticos y, en algunos casos, se sabe que
están causadas por el agente de la EEB o un agente que es indistinguible de dicho agente por los métodos
actualmente disponibles. Se supone que la exposición tuvo lugar por vía alimentaria.
Los estudios epidemiológicos llevados a cabo en el pasado, no han encontrado relación entre la exposición del
hombre a los agentes causales de las encefalopatías espongiformes en animales y la existencia de la EET
humana –es decir, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD). En particular, no se ha establecido un mayor
riesgo ocupacional o dietético por exposición a productos ovinos, lo que sugiere que los agentes del prurigo
lumbar no representan un peligro para la salud humana bajo condiciones de exposición naturales. Sin embargo,
el estudio de casos de CJD en Inglaterra dio lugar en Marzo de 1996 al anuncio del reconocimiento de diez
casos de una variante aparentemente nueva de CJD esporádica (v-CJD) en dicho país (99). La identificación de
la cepa del agente causal de v-CJD en ratones (11, 76) proporcionó evidencia clara de que en v-CJD se
encuentra también la misma cepa del agente derivado de la EEB. Esta conclusión está también apoyada por
estudios que muestran similitudes entre los modelos de las bandas de inmunotransferencia y de glicoproteínas
de la isoforma de PrPres relacionada con la enfermedad en pacientes con v-CJD y los de algunas especies de
animales con EEB adquirida natural o experimentalmente (18, 49). Por tanto, teniendo en cuenta la evidencia
actual, la explicación más probable de los casos de v-CJD es que se deben a la exposición al agente de la EEB,
aunque no puede excluirse la participación de un agente indistinguible de la EEB por los métodos actuales. La
incidencia actual de la enfermedad debe ser considerada con cautela. Por consiguiente, se recomienda ahora
tomar precauciones para el manejo del agente de la EBE basadas en la suposición de que la EBE es
transmisible a los humanos. Debido a que se desconoce el período de incubación de v-CJD, es demasiado
prematuro predecir el desarrollo de la epidemia. Los intentos en este sentido han originado predicciones muy
variables, aunque, como los casos continúan apareciendo, los límites de seguridad se van estrechando (19, 37,
41-43, 51, 59).
Se ha observado EEB clínica en ganado bovino adulto, y en general se presenta en animales de 4-5 años. No
existen razas predilectas, pero la incidencia en las explotaciones según el tipo de aptitud indica que ésta es mas
alta en las vacas de leche que en las de carne, y en Inglaterra los terneros procedentes de explotaciones de
producción láctea fueron los alimentados principalmente con raciones concentradas que contenían pienso con

harinas de derivados cárnicos. La aparición de síntomas clínicos no es estacional ni se asocia con una fase
determinada del ciclo reproductor.
La EEB presenta unos comienzos que pasan desapercibidos y, por lo general, un curso progresivo lento (9, 55,
92, 97). En ocasiones, se presenta un caso con síntomas agudos y con un rápido deterioro (97), aunque la
frecuencia de las observaciones es un factor importante a la hora de determinar si se pierden los síntomas
iniciales. Los síntomas, aunque variables, incluyen por lo general cambios de comportamiento, aprehensión e
hiperactividad. Por ejemplo, las vacas afectadas pueden resistirse a entrar a las salas de ordeño o patean
vigorosamente durante el ordeño. La falta de coordinación en las patas traseras y la debilidad pueden ser las
primeras características observadas, especialmente en vacas de aptitud no láctea. En el transcurso del periodo
clínico predominan los síntomas neurológicos y pueden incluir muchos aspectos de un estado mental y de
comportamiento alterado, anormalidades posturales y de movimiento, y una sensación anormal, aunque los
síntomas nerviosos más comunes son aprehensión, ataxia de las patas posteriores e hiperestesia al contacto y a
los sonidos. El intenso prurito que es característico de algunas ovejas con prurigo lumbar no es destacable en el
ganado bovino con EEB, aunque en algunos casos manifiestan tendencia a rozarse y rascarse. A veces los
animales afectados se mantienen con la cabeza baja, el cuello extendido y las orejas dirigidas hacia atrás. La
anormalidad en el andar incluye agitación de los cuartos traseros y extensión de las patas; estas características
se aprecian mejor cuando el ganado está pastando. La ataxia también pueden implicar a las patas delanteras y,
a medida que avanza la gravedad de los síntomas motores, el cuadro clínico está dominado por una debilidad
generalizada que ocasiona caídas y postración. Aunque no son síntomas específicos, la rumia reducida (3, 5), la
braquicardia y las alteraciones del ritmo cardíaco (4) sugieren que las perturbaciones autónomas constituyen una
característica de la EEB. A medida que la enfermedad progresa, los síntomas nerviosos se acompañan de
manifestaciones clínicas generales, como pérdida del aspecto normal, reducción del peso corporal y disminución
de la producción láctea. No ha habido cambios en la descripción clínica de la EEB a lo largo de la epizootia en
Inglaterra (95). Los síntomas clínicos en otros países donde se ha presentado EEB son esencialmente similares
(9). El desarrollo clínico, que se extiende por lo general a un período de semanas o meses, requiere
eventualmente el sacrificio por consideraciones sociales. Una política establecida para determinar el estado de
un país en cuanto a EEB exige la declaración obligatoria y la investigación diagnóstica de casos clínicamente
sospechosos, su sacrificio y la destrucción completa de las canales del ganado afectado (63). Al principio de la
enfermedad los síntomas pueden ser sutiles, variables e inespecíficos, y pueden enmascarar el diagnóstico
clínico en un examen inicial. La observación continuada de esos casos equívocos, junto a procedimientos
adecuados de patología clínica para eliminar diagnósticos diferenciales, en especial desórdenes metabólicos,
permitirán establecer la progresión de los síntomas esenciales. Algunos síntomas tempranos de la EEB son
similares a manifestaciones de la cetosis nerviosa, falta de magnesio, listeriosis encefálicas y otras encefalitis.
Los síntomas clínicos desapercibidos a veces se manifiestan aumentados en condiciones de estrés, como el
causado por el transporte.
Debido a la relación establecida entre la EEB y la v-CJD, los agentes de la EEB y de las EET relacionadas se
consideran en la actualidad vinculados a la EET humana (1). En consecuencia, los veterinarios y el personal de
laboratorio que realiza necropsias de animales sospechosos de EEB o que maneja tejidos derivados de tales
animales debe llevar a cabo el trabajo en el nivel de contención 3 (ver Capítulo I.1.6), a veces con limitaciones.
No existen evidencias de que el patógeno se transmita por el aire. Por tanto no se requiere que el aire del
laboratorio se filtre a través de filtros HEPA. Además los agentes de las EET no se inactivan con fumigantes
convencionales, por lo que no hay necesidad de que las instalaciones se sellen para permitir la fumigación. Estas
limitaciones se contienen en códigos de conducta emitidos por el Comité Asesor sobre Patógenos Peligrosos
(ACDP) bajo los auspicios del Departamento Ejecutivo de Salud y Seguridad del Reino Unido, en apoyo de la
legislación británica y europea para proteger a los individuos en su puesto de trabajo. Siempre deben
determinarse los riesgos locales para tener en consideración la naturaleza del trabajo. Es importante vestir ropa
adecuada y seguir estrictamente el código de conducta para evitar la exposición al agente. Los laboratorios que
trabajan sobre EEB deben cumplir con la normativa nacional sobre biocontención y bioseguridad. Los
procedimientos recomendados para descontaminación pueden no ser completamente efectivos cuando se trata
con material de un título alto o cuando el agente se protege en el interior de materia orgánica seca. La
inactivación física que se recomienda es un tratamiento en autoclave a 134°C-138°C durante 18 minutos a una
presión de 18 libras por pulgada cuadrada. Sin embargo, la temperatura no es siempre totalmente eficaz y la
inactivación completa puede no alcanzarse en determinadas condiciones, como cuando el material problema se
presenta en forma de macerado (82). La desinfección se lleva a cabo con hipoclorito sódico que contenga un 2%
de cloro libre, o con hidróxido sódico 2 N, aplicado durante más de 1 hora en el caso de superficies o durante
toda la noche en el caso de equipos (83).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1. Identificación del agente
La naturaleza de los agentes que causan las EETs en animales o en el hombre no está clara (71). La única
macromolécula específica de la enfermedad identificada en enfermedades de tipo prurigo lumbar es la forma
modificada (PrPres) de una proteína de membrana codificada por el hospedador (PrPC), que está altamente

conservada y es de función desconocida. Con frecuencia PrPres se denomina también PrPSc y PrPD en el prurigo
lumbar y PrPbse en la EEB. Una importante tendencia científica sostiene que el agente se compone solamente de
la isoforma PrP específica de la enfermedad y que la forma alterada es capaz de inducir la conversión de la
forma normal: esta interpretación representa la hipótesis del “prión” o de “solo proteína”. La tendencia opuesta
mantiene que el agente es un virus o partícula similar, y que contiene ácido nucleico. La identificación de varias
“cepas” o aislamientos de agentes del prurigo lumbar, con períodos de incubación y modelos de cambios
neuropatológicos característicos cuando se transmiten a ratones, se considera que apoya la última hipótesis.
Estudios previos para determinar la resistencia del agente a la degradación se han interpretado como una
indicación de que los agentes de las EETs no contienen ácidos nucleicos. Sin embargo, un análisis crítico de las
características de la desnaturalización de los agentes de EETs, incluyendo los efectos de radiaciones ultravioleta
e ionizantes, de temperaturas extremas, del autoclave y de un amplio espectro de desinfectantes químicos,
sugiere que los datos obtenidos son compatibles con los esperados para virus muy pequeños (15). Las bases
moleculares para la variación de cepas son todavía confusas, aunque quienes apoyan la hipótesis del prión
sostienen que ésta no es incompatible con la existencia de diversas cepas (66).
La caracterización de los aislamientos mediante transmisión de EEB a ratones ha indicado que la EEB está
causada por una única cepa mayoritaria del agente que difiere de las caracterizadas para el agente del prurigo
lumbar en las ovejas (10). La uniformidad de la patología entre el ganado bovino afectado apoya también la
noción de una cepa única de EEB y facilita la definición de un fenotipo particular de la enfermedad en el caso de
la EEB (91). Este modelo específico de neuropatología en la especie hospedadora es una característica
importante para definir un caso de EEB. Sin embargo, resulta difícil excluir totalmente la posibilidad de que
puedan existir otras cepas del agente con baja frecuencia. A falta de métodos in-vitro para el aislamiento del
agente causal, la confirmación convencional del diagnóstico de este grupo de enfermedades ha sido la
demostración de las características morfológicas de la encefalopatía espongiforme por examen histopatológico.
Éste sigue siendo, por definición, el único método por el que se puede diagnosticar esta patología vacuolar
característica. Sin embargo, dado el papel esencial de la molécula PrPres y el aumento en las posibilidades
técnicas en éste área, es importante en la actualidad que los enfoques diagnósticos utilicen uno o más métodos
para detectar la forma anormal de la proteína. La demostración por microscopía electrónica de fibrillas
características en extractos del SNC, denominadas fibrillas asociadas a prurigo lumbar (SAF), que están
fundamentalmente compuestas de PrPres, es otro método morfológico de diagnóstico. Los métodos de detección
de la PrP específica de la enfermedad incluyen la demostración inmunohistoquímica (IHC), inmunotransferencia
de SAF y, más recientemente, una serie de inmunoensayos rápidos para análisis. El uso de cada método
particular depende del propósito del diagnóstico aplicado en el contexto epidemiológico y de su validación a
dichos efectos. Estos propósitos varían desde la confirmación del diagnóstico clínico en el control de la
enfermedad epizoótica al análisis de poblaciones sanas para evidenciar la enfermedad encubierta o preclínica.
La definición adoptada del caso patológico también variará en función del método aplicado para la confirmación
de un caso o para el muestreo de una población. En la primera situación es importante utilizar enfoques que
permitan verificar el fenotipo patológico de la EEB. Parece también claro que un aspecto crítico en este proceso
de selección de un método único o de un enfoque plural es la realización de métodos individuales. Debe
destacarse que el desarrollo de métodos es un campo en rápida evolución, particularmente en lo que se refiere a
los ensayos rápidos de inmunoanálisis para la detección de PrPres. Debe tenerse cuidado con la interpretación
de los datos utilizando metodologías que no resistan una referencia cruzada con los estándares definidos aquí.
Esto es particularmente importante respecto a la definición de cepa. Sin una comparación apropiada con criterios
previamente publicados, las diferencias metodológicas pueden generar diferencias en los resultados que no
justifican notificar la identificación de una nueva cepa. Los anuncios precipitados sobre detección de nuevas
cepas pueden tener repercusiones serias, y por otra parte la identificación razonada es importante a efectos
estratégicos y de control.
El control de calidad (CC) y la calidad de la determinación (CD) deben ser una parte esencial de los
procedimientos de las pruebas. Para obtener asistencia en esta área y favorecer comparaciones entre
laboratorios a nivel internacional se puede contactar con los laboratorios de referencia de la OIE.
a) Preparación de la muestra
Para la preparación del material sujeto a examen diagnóstico se sacrifica el ganado sospechoso de
enfermedad con una inyección intravenosa de una solución concentrada de barbiturato, después de sedarlo
si es necesario. Se ha descrito el procedimiento técnico relativo a la recogida, la fijación y el tratamiento
histológico (8, 73), y se revisa a continuación de forma resumida.
En un país donde no se haya descrito la presencia de EEB, o ésta es de baja incidencia, en todos los casos
de control de la enfermedad neurológica del ganado bovino adulto es importante adoptar un enfoque
neuropatológico estándar en el que se examinen áreas representativas de todo el cerebro. El alejamiento
de esta norma depende de circunstancias nacionales locales, que incluyen si es o no necesario realizar un
diagnóstico diferencial. Además, cuando se seleccionan inmunoensayos rápidos como método inicial de
elección, debe tenerse cuidado de que el muestreo y la preparación de los tejidos para una prueba no
comprometa la capacidad para confirmar el fenotipo patológico por métodos histopatológicos.

El tejido cerebral debe extraerse lo más rápidamente posible después de la muerte del animal. Para su uso
potencial en pruebas de detección de la PrP específica de la enfermedad, el material fresco debe tomarse
como una sección transversal completa de la médula (2-4 g), en torno al extremo caudal del cuarto
ventrículo (llamado obex), evitando específicamente dañar la región del obex. La médula espinal cervical y
el hemisferio lateral del cerebelo también ofrecen áreas óptimas de muestreo que no deben infiltrarse en las
necesidades histopatológicas. Este tejido se congela antes de la prueba; deben tomarse precauciones para
asegurar que los tejidos para examen histológico o IHC no se congelen, pues esto provoca lesiones falsas
que pueden interferir con la identificación de la vacuolización, y/o la localización del lugar seleccionado. Es
posible (pero no deseable) realizar inmunohistoquímica para PrP con material que se ha congelado antes
de la fijación (21). Sin embargo, es importante estar seguro de que se han identificado y comprobado los
sitios adecuados antes de considerar un resultado negativo. Si se muestrea el resto del tejido cerebral para
examen histopatológico, debe colocarse en aproximadamente 4-6 litros de solución salina fijadora con 10%
de formol, que debe cambiarse dos veces a la semana. Después de una fijación de 2 semanas, el cerebro
se corta en secciones transversales. El tiempo de fijación puede reducirse cortando en fresco el tallo
cerebral en porciones transversales más pequeñas, dejando intactas las áreas que son importantes para el
diagnóstico, como el obex, los pedúnculos cerebelares y los culícolos rostrales. El tiempo de fijación de
estas piezas pequeñas del tallo cerebral se puede reducir a 2-5 días dependiendo de otros factores
(temperatura, agitación, uso de microondas). Después de completar las 2 semanas estándar de fijación, las
otras partes del cerebro fijadas con formol pueden utilizarse para un diagnóstico diferencial. En principio,
debería seleccionarse una única pieza cortada por el obex de la médula oblonga (Fig. 1) para su
tratamiento histológico por métodos convencionales de inclusión en parafina para tejido nervioso. Las
secciones, en cortes de 5 µm de grosor, se examinan para el característico cambio espongiforme y para
vacuolización neuronal. Si los resultados no son claros debido a lesiones mínimas, o cuando resultan de
difícil interpretación histológica por autolisis o daño del material, o si no están presentes lesiones
histológicas, es necesario llevar a cabo pruebas adicionales del tipo de IHC o inmunotransferencia.
Cuando en un país en particular se detecta la presencia de EEB en la población de ganado bovino

autóctono, con evidencias de que la distribución de las lesiones coincide con la de los cerebros del ganado
en la epizootia de Inglaterra, es adecuado extraer tan solo el cerebro posterior a efectos de control (Fig. 1).
Esto se puede realizar por el agujero occipital sin la extracción del calvario. Este procedimiento reduce la
cantidad de fijador utilizado, disminuyendo costes y aumentando la seguridad, pero manteniendo una
representación de las principales áreas que son objeto del examen histológico. El diagnóstico puede
confirmarse si se presentan los cambios típicos en la médula a nivel del obex. Cuando las lesiones no
resultan aparentes en la médula (obex), se debe realizar inmunohistoquímica. Sin embargo, dado el modelo
constante de lesión, es poco probable que esto contribuya a una confirmación adicional en más del 0,5% de
los casos de EEB con lesiones ausentes en la sección de la médula (obex) (88). Obviamente, este
protocolo abreviado no permite establecer un análisis neuropatológico completo para un diagnóstico
diferencial, ni representa una caracterización fenotípica completa de ninguna EET.
Fig. 1. Tallo cerebral después de retirar el cerebelo, a) vista dorsal, y b) vista lateral.
Niveles recomendados para tomar las secciones:
A—A = médula en el obex; B–B = médula a través de los pedúnculos cerebelares caudales;
C–C = cerebro medio a través de los culículos rostrales.

En zonas donde se identifica el índice de casos por vigilancia activa, puede carecerse de las áreas del
cerebro necesarias para una caracterización fenotípica completa. En la mayoría de los países, solo se
recoge el cerebro posterior (ver más adelante), incluso antes de la primera confirmación de EEB. En teoría,
se deben recoger cabezas muestreadas en el transcurso de la vigilancia activa hasta disponer de las
primeras pruebas. Esto facilita un muestreo amplio de cerebros de animales positivos y permite el enfoque
recomendado para la caracterización de los casos. Tal hecho es particularmente importante si se utilizan
pruebas que no están validadas y cuando se reivindica la identificación de nuevas cepas en ausencia de
comparaciones con los métodos aquí descritos.
El procesamiento del tejido cerebral para utilización en la prueba rápida debe realizarse exactamente como
indica el fabricante del kit o el método de la prueba. Los detalles del proceso varían de método a método y
no deben cambiarse sin datos de validación que apoyen la variación metodológica. La muestra preferida
para el inmunoensayo es el obex o una zona situada 1,5 cm por delante. La elección debe tener en cuenta
el mejor método de confirmación, pues la incapacidad para examinar histológicamente el tallo cerebral por
el obex puede ocultar la detección bilateral de la vacuolización. El muestreo de la médula rostral para la
prueba rápida no compromete el examen por medios histológicos o inmunohistoquímicos. La semisección
del tallo cerebral a nivel del obex impide determinar la simetría de las lesiones, pero tal necesidad es menor
si se emplea inmunohistoquímica. Sin embargo, si se adopta este enfoque, resulta crítico asegurarse de
que el sitio elegido no esté dañado. Tanto el núcleo dorsal del nervio vago (el área objetivo del prurigo
lumbar) como el núcleo del tracto solitario (el área objetivo en el ganado bovino) son pequeños y se sitúan
cerca del eje (Fig. 2).
Figura 2. Sección transversal a nivel del obex para identificar los sitios clave
para el diagnóstico por histopatología e inmunohostoquímica en la EEB (núcleo del tracto solitario [1] y
núcleo del tracto V del trigémino [2]) y en el prurigo lumbar (núcleo dorsal del vago [3]).
Una semisección no apropiada puede ocasionar fácilmente la pérdida completa del área objetivo en la
prueba confirmativa y reducir por tanto la eficacia del programa de vigilancia. Tal enfoque requiere el apoyo
en una política clara y un programa de control de formación y procedimientos de muestreo. Debido a la
distribución irregular de PrPres, el tamaño de la muestra debe ser el especificado en el kit de diagnóstico, y
si no está especificado debe ser al menos de 0,5 g. La realización de todas las pruebas puede estar
influenciada por cambios autolíticos. Para reducir el peligro de los operadores que recogen un gran número
de muestras durante un programa de vigilancia activa, los cerebros deben ser muestreados sin abrir el
cráneo. Esto es llevado a cabo fácilmente, incluso en los mataderos, entrenando a los operarios a utilizar
una cuchara especialmente diseñada que se puede insertar en el agujero occipital de la cabeza cortada. A
continuación se describe un protocolo elaborado por el Laboratorio de Referencia de la OIE en Berna,
Suiza. Algunos fabricantes de pruebas rápidas también venden cucharas desechables para extraer el
cerebro.
• Obtención del tallo cerebral o médula

Una vez que se ha separado la cabeza del cuerpo entre el atlas y el agujero occipital, se coloca en un
soporte con el hueso frontal hacia abajo; el extremo caudal de la médula es así visible por el agujero

occipital. Se disecciona la médula a través del agujero occipital, sin abrir el cráneo, por medio de una
cuchara especialmente diseñada, de bordes afilados y mango largo (Fig. 3). Se inserta la cuchara en el
agujero occipital, entre la médula espinal y el hueso, y se va pasando a lo largo de la pared ósea,
moviéndola lateralmente para ir seccionando los nervios craneales a ambos lados, al tiempo que se evita
deteriorar el tejido cerebral por dejar el instrumento pegado al hueso. La cuchara avanza de este modo
hasta una distancia de aproximadamente 7 cm y a continuación se inclina hacia abajo, seccionando y
separando la médula oblonga caudal (con algunos fragmentos de cerebelo) del resto del cerebro. El
operario atrae luego hacia sí la cuchara, manteniéndola en posición inclinada hacia abajo. De esta manera,
la médula espinal seccionada se desliza fuera del cráneo pasando por el agujero occcipital.
Fig. 3. La cabeza se separa del cuerpo y se coloca del revés en un soporte; la médula espinal (bs) se separa del
hueso dando cortes laterales (flechas curvas) mediante una cuchara especialmente diseñada de bordes afilados y
mango largo que se inserta en el agujero occipital entre el hueso y el tejido cerebral. La muestra preferida para
inmunoensayo es el obex o una zona 1,5 cm anterior al obex.
b) Examen histológico
La definición inicial de un caso patológico de EEB se basa en los cambios histopatológicos en el SNC y
esto ha supuesto la confirmación normal del diagnóstico clínico de la EEB (88, 92). El examen
histopatológico también permite verificar el fenotipo neuropatológico característico de la EEB (78, 94). Los
cambios histopatológicos son neurodegenerativos y muy similares a los del prurigo lumbar en las ovejas.
Las propiedades más destacables son una vacuolización que supone un cambio espongiforme en la
materia gris de áreas neuroanatómicas específicas, y la presencia vacuolas únicas o múltiples dentro de la
zona perinuclear de las neuronas. La apariencia exacta del cambio espongiforme en las EETs observable
por microscopía óptica se ha definido con anterioridad (56). En la EEB, el cambio espongiforme es la forma
predominante del cambio vacuolar. Ambas formas de vacuolización se distribuyen bilateralmente y
normalmente de modo simétrico, con un aspecto repetitivo de gravedad en lo que respecta a su distribución
por el cerebro (89, 94). En la epizootia de EEB en Inglaterra, la elevada frecuencia de vacuolización en el
parénquima neuronal de algunos núcleos anatómicos de la médula oblonga a nivel del obex supuso un
medio adecuado para establecer un diagnóstico con una única sección de la médula (88). Sin embargo, la
observación de lesiones medulares equívocas a este nivel hace necesario el examen de otras áreas
cerebrales para detectar casos de EEB con lesiones mínimas o potencialmente atípicas y para, cuando sea
necesario, establecer diagnósticos diferenciales. En la EEB no hay alteraciones neurodegenerativas
destacables distintas a la vacuolización. Como en el prurigo lumbar, otra característica es una gliosis
(astrocitosis), particularmente en las zonas de vacuolización. La detección de gliosis puede verificarse
mediante el uso de colorantes especiales y por inmunohistoquímica. Por ejemplo, la astrocitosis puede
demostrarse detectando el aumento de proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP).

La interpretación de los cambios vacuolares observados en el cerebro bovino debe hacerse con precaución.
En las neuronas del núcleo rojo y oculomotor del cerebro medio del ganado bovino se han descrito, de
modo ocasional, vacuolas perinucleares que son indistinguibles de las presentes en la EEB (34, 40, 57, 92).
Por tanto, como ocurre en el prurigo lumbar, donde el diagnóstico se puede equivocar por la presencia de
vacuolización neuronal dispersada por la médula de ovejas sanas (ver Capítulo 2. 4. 8. Prurigo lumbar (86,
87), el diagnóstico histopatológico de la EEB no debe establecerse por la aparición de neuronas vacuoladas
aisladas. Incluso la presencia de neuronas vacuoladas relativamente numerosas en el núcleo rojo y en los
núcleos habenulares deben ignorarse. La mayor seguridad para reducir los diagnósticos falsos positivos
reside en determinar la presencia del cambio espongiforme en localizaciones neuroanatómicas específicas.
Como en el prurigo lumbar de las ovejas, existe la posibilidad de que ocurran casos de EEB donde las
lesiones cerebrales sean mínimas o indetectables por microscopía. Este problema potencial solo puede
resolverse por criterios diagnósticos que sean independientes de la histopatología (73, 93). (Ver también la
siguiente sección)
c) Detección de formas de PrP específicas de la enfermedad
Durante los últimos años, en muchos países el examen histopatológico limitado a la médula oblonga ha
sido el método de investigación utilizado en el laboratorio para procesar un gran número de casos
sospechosos. La demostración de cambios típicos proporciona un diagnóstico definitivo. En la actualidad
muchos laboratorios han mejorado o reemplazado el examen histopatológico con IHC y otros métodos para
la detección de PrP. Cuando los resultados del análisis histopatológico son confusos o negativos, o cuando
las muestras de cerebro son inadecuadas para un examen histológico debido a autolisis o daños, la
detección de la acumulación de PrP anormal constituye el método de elección. La aplicación de estas
pruebas para PrP está en aumento en la fase descendente de la epizootia y en programas de vigilancia que
requieren un control crítico de la enfermedad.
La utilización de IHC para detectar la acumulación de PrPres en material fijado con formalina e incluido en
parafina es un método para emplear junto a la evaluación histopatológica de las secciones de la médula o
incluso como una alternativa a tal procedimiento (47, 94). Se han aplicado con éxito varios protocolos para
la detección de PrPres por IHC como diagnóstico de la EEB (44, 47, 54, 94). Es conveniente una
armonización para conseguir un método de diagnóstico rutinario por IHC que esté completamente validado
y estandarizado. Sin embargo, es probable que solo se puedan emitir los principios generales, y que los
métodos exactos se determinen a nivel de cada laboratorio individual. Una colaboración establecida por la
Comisión Europea entre laboratorios europeos consideró la necesidad de homogenizar los métodos de
diagnóstico y concluyó que una estandarización total de los métodos era difícil y probablemente
innecesaria. Las condiciones locales siempre imponen un cierto grado de variación entre los laboratorios, y
cada método debe optimizarse para su utilización con los tejidos estándar y los reactivos comunes (como el
agua) que se emplean localmente. Históricamente, también ha habido una dependencia “casera” de
anticuerpos policlonales, pero el aumento de anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente ha
reducido significativamente esta variación. Es mucho más importante lograr un procedimiento
estandarizado, controlado por el ejercicio de análisis de calidad y por la comparación con resultados de un
método modelo estandarizado.
La técnica es más sensible que la técnica histopatológica normal y puede detectar casos en los últimos
meses de la incubación antes de la aparición de los cambios vacuolares, al menos en casos de EEB
inducida experimentalmente (62) y posiblemente también en la infección natural (23). Por tanto la EEB
puede diagnosticarse mediante IHC en animales con cambios morfológicos poco claros o inexistentes. La
técnica no necesita períodos largos de fijación de los tejidos, aunque para mayor exactitud debe seguir las
normas establecidas en histopatología, y funciona bien en tejidos autolisados en los que no es posible la
evaluación morfológica siempre que el tejido se procese histológicamente de un modo adecuado. La
detección de la acumulación de PrP anormal por IHC es tan sensible como el método de
inmunotransferencia para la detección de PrPres (69). En combinación con buenas preparaciones
histológicas, la IHC permite detectar las acumulaciones de PrP anormal. Como estas acumulaciones, de
modo similar a que ocurre con la patología vacuolar, presentan un modelo típico de distribución y
apariencia, su detección supone una prueba simultánea o confirmativa del fenotipo de la enfermedad.
Los laboratorios sin una experiencia inmunohistoquímica previa pueden desear adoptar el método modelo
que se describe a continuación. Como para otras técnicas descritas en este texto, las indicaciones
resultarán por sí mismas insuficientes para permitir su inmediata reproducción en el laboratorio. Sin
embargo, mediante consultas con los autores y el seguimiento de las modificaciones específicas que sean
necesarias para justificar las variaciones en las calidades o concentraciones de los reactivos, puede
utilizarse para comparación con métodos preferidos a nivel local. El método descrito más adelante es el
utilizado en el diagnóstico de la EEB por el Laboratorio de Referencia de la OIE en Inglaterra, y para la
preparación de materiales de referencia en otros laboratorios.

• Marcaje inmunohistoquímico de PrP específica de la enfermedad
• Reactivos
Guardar las preparaciones comerciales según indican las instrucciones del fabricante.
Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,5% de Tween 20, pH 7,6 (TBST)
Ácido fórmico (96%)
Solución de tampón citrato (0,2%), pH 6,4
Peróxido de hidrógeno (30% p/v) (Sigma)
Metanol
Kit de Vectastain Elite RAT con el complejo de IgG avidina-biotina (ABC), de Vector Labs
Solución de sulfato de cobre (0,5%)
Di-amino-benzidina (DAB) (Sigma)
Hematoxilina de Mayer
HCl conc. al 0,5% en etanol absoluto
Etanol absoluto
Xileno
Amoniaco en agua
Anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal R145 de rata contra PrP bovina, disponible en la Agencia para
Laboratorios Veterinarios de Weybridge, Inglaterra)
• Tejidos
Tejidos fijados con formalina de un grosor máximo de 3 mm. Sumergir en 96% de ácido fórmico durante
1 hora. Lavar en agua corriente durante 10 minutos. Sumergir en formalina neutra tamponada durante
1 hora y procesar por el método usual para inclusión en parafina.
• Método
Después de la preparación de los bloques de inclusión en parafina (siguiendo los métodos rutinarios), cortar
en secciones finas de 3 µm de grosor y montar en portas recubiertos de polisina o similares. Secar al aire y
colocar en una estufa a 60°C durante toda la noche.
i) Eliminar la parafina de los cortes en xileno durante 10 minutos.

ii) Lavar dos veces en etanol absoluto durante 30 segundos (agitar).
iii) Lavar en agua corriente del grifo durante 10 minutos.
iv) Sumergir en ácido fórmico al 96% durante 5 minutos. (El tratamiento con ácido fórmico se emplea
para la recuperación preliminar de antígeno, y también para mantener una buena morfología tisular
durante el posterior pase por autoclave, a la vez que aumenta la seguridad del operario reduciendo
los niveles de infectividad en el tejido manejado).
v) Lavar en agua corriente del grifo durante 10 minutos.
vi) Sumergir en solución de tampón citrato en un recipiente de plástico abierto y autoclavar durante
5 minutos a 121°C.
vii) Enfriar 10 minutos a temperatura ambiente y luego lavar en agua corriente del grifo durante
10 minutos.
viii) Sumergir en peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 20 minutos.
ix) Lavar en agua corriente durante 10 minutos.
x) Secar los cortes y aislarlos con un marcador.
xi) A partir de ahora los cortes no se deben dejar secar.
xii) Lavar dos veces los cortes con TBST.
xiii) Añadir el suero normal de conejo (NRS)* durante 60 minutos a temperatura ambiente (* Diluir el
NRS siguiendo las instrucciones del fabricante).

xiv) Eliminar el NRS y aplicar el anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal R145 de rata contra PrP
bovina a dilución 1/3.000) durante 16-18 horas a temperatura ambiente.
xv) Lavar los cortes dos veces con TBST durante 2-3 minutos cada vez.
xvi) Aplicar el anticuerpo secundario* (Ig de conejo anti-rata) durante 60 minutos a temperatura
ambiente (*Diluir el anticuerpo secundario siguiendo las instrucciones del fabricante).
xvii) Preparar el complejo avidina-biotina (ABC) siguiendo las instrucciones del fabricante y dejar a
temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usar.
xviii) Lavar los cortes dos veces con TBST durante 3 minutos cada vez.
xix) Aplicar el ABC durante 30 minutos a temperatura ambiente.
xx) Lavar los cortes dos veces con TBST durante 3 minutos cada vez.
xxi) Aplicar DAB durante 10 minutos.
xxii) Lavar dos veces con agua de grifo durante 2 minutos cada vez.
xxiii) Sumergir en sulfato de cobre acuoso al 0,5% durante 5 minutos.
xxiv) Lavar con agua de grifo durante 1 minuto.
xxv) Sumergir los cortes en hematoxilina de Mayer durante 5 minutos.
xxvi) Lavar con agua de grifo hasta que el agua de lavado corra clara.
xxvii) Diferenciar con alcohol ácido al 1% (1% de HCl en etanol) durante 2-3 segundos.
xxviii) Lavar los cortes con agua de grifo durante 1 minuto.
xxix) Sumergir en agua alcalinizada con amoníaco para convertir en azul la coloración marrón de
contraste de la hematoxilina. Se puede obtener el mismo efecto lavando en agua corriente durante
5 minutos o mediante inmersión en 0,05% de carbonato de litio.
xxx) Sumergir dos veces los cortes en etanol absoluto durante 30 segundos cada vez.
xxxi) Aclarar los cortes con xileno durante 2-5 minutos.
xxxii) Colocar los cubres y dejar secar.
Se considera que las acumulaciones de PrP anormal detectadas por IHC constituyen potencialmente un
diagnóstico preclínico del prurigo lumbar en las ovejas (en algunos genotipos, pero no en todos) utilizando
biopsias de tejidos linfoides de las amígdalas (72) o de la membrana nictitante (64). Sin embargo, mediante
bioensayos con ratón o por IHC, no se ha logrado detectar la infectividad de la EEB en los tejidos linfáticos
durante el período de incubación o en el transcurso de la enfermedad clínica en ganado bovino infectado
experimentalmente (90), excepto en el íleon distal que contiene las placas de Peyer. Esto sugiere que tales
tejidos no son adecuados en la actualidad para utilizarlos en diagnóstico. Un resultado no publicado sobre
la detección de infectividad en las amígdalas de un animal infectado experimentalmente a los 10 meses de
la exposición oral, permanece incompleto. El hallazgo contrasta con los resultados negativos de las
amígdalas recogidas en dicho estudio antes y después de ese tiempo, y no supone un avance importante
en las posibilidades de las pruebas en ganado in-vivo.
La detección de PrPres por purificación de las fibrillas asociadas al prurigo lumbar (SAF) y por técnicas de
inmunotransferencia (35, 50, 79), se realiza con material del cerebro o de la médula espinal, fresco (sin fijar)
o congelado. Las mejoras en los métodos de purificación y extracción de PrP (7, 22) han contribuido al
aumento de la sensibilidad de este método. Cuando el tamaño de la muestra es considerable, esta
metodología suele proporcionar un método sensible para el diagnóstico confirmativo, después de una
sospecha inicial de la enfermedad por pruebas rápidas de desarrollo más reciente (ver a continuación). Por
este motivo, y a falta de un método publicado que sea accesible y completo, se reproduce aquí el método
de inmunotransferencia de SAF.
• Protocolo para el diagnóstico de las EET mediante inmunotransferencia de SAF

Se describe un ejemplo del procedimiento seguido para la purificación y detección de la isoforma de la
proteína priónica que es específica de la enfermedad (PrPres), partiendo de material obtenido del tallo
cerebral no fijado. Primero se obtiene la purificación de las fibrillas asociadas al prurigo lumbar (SAF) por
ultracentrifugación, y luego se sigue un tratamiento con proteinasa K para digerir los restos de la PrPc
celular. Después, las fibrillas se centrifugan a través de una capa de sacarosa para una purificación
adicional, antes de detectar la PrPres por inmunotransferencia.

• Preparación de la muestra
El material del tallo cerebral se debe tomar, si es posible, de la región del obex (esta es la región con
contenido más elevado de PrPres). Se debe disponer de las siguientes muestras:
Control negativo: 4 g.
Control positivo: 4 g.
Muestra sospechosa con señal fuerte en prueba rápida (por ejemplo, densidad óptica [DO] >2,5 en la
prueba Bio-Rad Platelia): 1 g, que será tratado completamente con proteinasa K*.
Muestra sospechosa con señal débil en prueba rápida (por ejemplo, DO < 2,5 en la prueba Bio-Rad
Platelia): 2 g con tratamiento con proteinasa K y 2 g sin tratamiento.
*NOTA: Dependiendo del resultado en la prueba rápida, la cantidad de material del tallo cerebral puede ser
2 g ó 1 g, a efectos confirmativos. Sin embargo, si el examen de una muestra de 1 g resulta negativo, dicha
muestra debe repetirse con al menos 2 g y con tratamiento con proteinasa K.
i) Tomar la cantidad adecuada de material del tallo cerebral (región del obex).
ii) Cortar en pequeños trozos (eliminando la duramadre) y añadir 5 ml de tampón de lisis del cerebro
(BLB) (10 g de N-lauroil-sarcosina, sal sódica [Catálogo Sigma No. L5125] en 100 ml de tampón
fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, más inhibidores de proteasas - 10 µl de fluoruro de fenilmetilsulfonil
[PMSF] 100 mM y 10 µl de N-etil-maleimida [NEM] 100 mM).
iii) Homogenizar cuidadosamente en un homogenizador de vidrio (douncer).
iv) Transferir cuidadosamente a tubos de plástico de 50 ml.
v) Añadir otros 2-5 ml de BLB en el homogenizador, lavar bien y añadir también el lavado al tubo de
plástico, llevando el volumen final del homogeinizado a 10 ml. Sonicar durante 1 minuto.
vi) Transferir la muestra a un tubo cerrado, equilibrar el peso añadiendo BLB, y cerrar el tubo con la
tapadera.
vii) Centrifugar a 20.000 g (17.000 rpm) durante 30 minutos a 10°C en un rotor 70Ti de una ultracentrífuga
Beckman.
viii) Extraer cuidadosamente el sobrenadante con una jeringa y pasarlo a un tubo de centrífuga limpio.
Después, llenar con BLB hasta el cuello del tubo. Cerrar los tubos como antes y centrifugar a
177.000 g (46.000 rpm) durante 135 minutos a 10°C en un rotor 70Ti de una ultracentrífuga Beckman.
ix) Eliminar el sobrenadante y suspender el precipitado en 3 ml de agua destilada con 50 µl de Tris-HCl 1
M, pH 7,4 (0,0167 M) por aspiración suave con una pipeta. Para muestras menores de 2 g de material
cerebral solo se emplea 1,5 ml de agua destilada con 25 µl de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 (0,0167 M).
x) Incubar en un baño de agua a 37°C durante 15 minutos con agitación ocasional.
xi) Para la solución KI-HSB, preparar 1,5 g de tiosulfato sódico, 1 g de N-lauroil-sarcosina en 1 ml de Tris-
HCl 1 M y añadir 10 g de yoduro potásico para una solución al 10% o 15 g para una solución al 15%.
Diluir a 100 ml con agua destilada. Añadir a la muestra 6 ml de la solución KI-HSB al 15% e incubar
otros 30 minutos como en el paso anterior x. Para menos de 2 g de material cerebral, se añaden 3 ml
de KI-HBS al 15%.
xii) Dividir la solución en dos alícuotas de 4,5 ml (solo para muestras que se dividen para análisis con y
sin tratamiento con proteinasa K).
xiii) A una alícuota añadir 1 mg/ml de proteinasa K (PK) e incubar 1 hora como en el paso x. Cantidad de
solución de PK a añadir, para 2 g y menos: 45 µl.
xiv) A la otra alícuota, añadir 4,5 ml de KI-HSB al 10% y después transferir cuidadosamente a un tubo de
ultracentrífuga. Añadir al fondo del tubo con una jeringa y con cuidado 2 ml de sacarosa al 20% y
llenar el tubo hasta el cuello con KI-HSB al 10%. Centrifugar a 189.000 g (51.000 rpm) durante 1 hora
a 10°C.
xv) Realizar el paso anterior con la muestra tratada con proteinasa K.
xvi) Eliminar cuidadosamente los sobrenadantes y secar bien los tubos, poniendo siempre atención en el
precipitado.

xvii) Resuspender las muestras en 40 µl de tampón de muestra (2 ml de dodecil sulfato sódico al 20%
[SDS], 1 ml de Tris-HCl [1 M, pH 7,4], 1 ml de mercaptoetanol, 0,6 g de sacarosa, 1-3 gotas de azul de
bromotimol, 15 ml de agua destilada).
xviii) Sonicar las muestras durante 30 segundos.
xix) Centrifugar brevemente para concentrar la muestra en el fondo del tubo.
• SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) e

inmunotransferencia
i) Disponer una placa grande de vidrio y otra pequeña con espaciadores para preparar un minigel
después de lavar los cristales con etanol al 70% y secarlos por completo.
ii) Preparar el gel de separación y verterlo o pipetearlo entre las dos placas hasta unos 2 cm del extremo
de la placa de vidrio pequeña. Pipetear cuidadosamente una capa de isopropanol sobre el gel y dejar
reposar durante aproximadamente 60 minutos.
iii) Lavar cuidadosamente la superficie del gel con agua desionizada. Preparar el gel de concentración y
verterlo o pipetearlo encima del gel de separación. Insertar un peine a los 30 segundos y dejar reposar
el gel durante 5 minutos.
iv) Extraer el peine y montar el aparato del gel.
v) Llenar la cámara del gel de electroforesis con el tampón de electroforesis (Tris 25 mM [3,03 g/litro],
glicina 192 mM [14,4 g/litro], metanol al 20% [200 ml/litro], SDS al 0,2% [2 g/litro]). El nivel del gel debe
estar bastante por debajo del nivel del tampón. Limpiar cuidadosamente con una pipeta los pocillos de
las calles de recorrido de restos de gel.
vi) Depositar 30 µl de cada muestra en el equipo de minigel con 13% de SDS después de incubar las
muestras durante 5 minutos a 95°C.
vii) Llevar a cabo la electroforesis en el gel a 100 V hasta que las muestras hayan entrado bien en el gel
de separación y continuar después a 200 V (por otros 30-40 minutos). Detener el recorrido cuando el
color azul del frente alcance el borde final del gel.
viii) Iniciar la transferencia: para ello, disponer en el siguiente orden en la cámara semiseca:
- tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampón de transferencia, de tamaño

ligeramente mayor que las membranas;
- membrana immobilon-P-Transfer (esta membrana debe equilibrarse previamente, primero en
metanol durante 5 minutos y luego en tampón de transferencia);
- gel;
- tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampón de transferencia.
Cerrar la cámara semiseca y efectuar la transferencia a 15 V durante 50 minutos.
ix) Sacar la membrana de la cámara de transferencia y bloquearla en 20 ml de I-Block (5% de leche en

polvo desnatada en solución salina tamponada con fosfato [PBS] + 0,1% de Tween 20) durante
30 minutos a temperatura ambiente en un agitador.
x) Incubar con el anticuerpo primario en I-Block durante 1,5 horas a temperatura ambiente o durante toda
la noche a 4°C.
xi) Lavar tres veces durante 10 minutos cada vez con PBS + 0,1% de Tween 20 (PBS/Tween) en un
agitador.
xii) Incubar durante 1 hora con el conjugado (GAM-AP) diluido 1/1000 en PBS/Tween a temperatura
ambiente en un agitador.
xiii) Lavar tres veces durante 10 minutos cada vez con PBS/Tween en un agitador.
xiv) Incubar en tampón de ensayo durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación.
xv) Visualizar los anticuerpos unidos añadiendo 1,5 ml del reactivo de detección CDP Star (Tropix) en
cada transferencia e incubando durante 5 minutos. A continuación, envolver la membrana en papel de
plástico y detectar las señales en una cámara o mediante exposición a un film.

• Interpretación de los resultados

Como este protocolo se centra en concentrar por ultracentrifugación la PrPres insoluble, no hay que esperar
la observación de señal en la muestra digerida del control negativo, ni en la alícuota no digerida, que
contienen solo PrPc soluble, y que es probable que presente solo una señal de baja intensidad. La
glicoproteína priónica está dos veces glicosilada. En consecuencia, después de la digestión con PK la
PrPres produce bandas con masas moleculares de 30-27 kDa, 26-24 kDa y 21-19 kDa por
inmunotransferencia. En la PrPres de la EEB la banda superior es la más destacable. Éste es también el
caso en la señal de la mayoría de los casos de prurigo lumbar, pero las intensidades de las bandas también
pueden ser diferentes.
Control Negativo:
- No tratado con PK: sin señal o solo una señal débil de PrPc (33-35 kDa).
- Tratado con PK: sin señal específica de PrP
Control Positivo:
- No tratado con PK: señal muy fuerte, a veces demasiado fuerte como para diferenciar bandas
aisladas, con la señal de mayor intensidad a 33-35 kDa.
- Tratado con PK: tres bandas visibles de PrPres.
Debe observarse un desplazamiento en el peso molecular cuando se compara la fracción digerida y la no
digerida del control positivo, que corresponde a la comprobación de la actividad PK.
Muestra para diagnóstico:
- La muestra problema tratada con PK se considera positiva si las señales que corresponden a PrPres
son claramente visibles. Es conveniente que las muestras para diagnóstico se coloquen en la misma
prueba de transferencia que el control positivo tratado con PK. Siempre deben colocarse en el mismo
gel que una muestra control para PrPc no digerida con el fin de poder apreciar el desplazamiento en
peso molecular.
- La muestra para diagnóstico tratada con PK se considera negativa si no existe una señal específica
detectable de PrPres.
- La prueba debe repetirse si los resultados del control negativo o positivo son atípicos o si los de la
muestra problema no son concluyentes, como por ejemplo cuando las señales:
- son muy débiles (repetir la preparación de SAF con mayor cantidad de material cerebral)
- muestran bandas que no corresponden con el control positivo (repetir el procedimiento y utilizar
además otros métodos de diagnóstico).
• Pruebas rápidas para la detección de las formas de PrP específicas de la enfermedad

Las técnicas automatizadas de inmunotransferencia y enzimoinmunoensayo (ELISA) permiten el análisis de
muchas muestras cerebrales (60, 61, 69, 70) y en la actualidad están comercializadas. Tales técnicas se
pueden realizar con rapidez, son más sensibles que el método histopatológico y su sensibilidad es
equiparable a la de la inmunotransferencia de SAF. En comparación con la inmunohistoquímica, su
sensibilidad está por determinar. En un ensayo llevado a cabo en representación de la Comisión Europea
(60, 61), se demostró que para el diagnóstico con tejido cerebral en poblaciones seleccionadas resultaban
adecuados un método de inmunotransferencia y dos métodos específicos de tipo ELISA. Esta evaluación
se limitó a comparar el análisis de una muestra de cerebros de ganado identificado como sospechoso por
cambios histopatológicos característicos de EEB con el de una muestra de cerebros de ganado bovino de
Nueva Zelanda, no expuesto a EEB y que eran histológicamente negativos. Estas pruebas están ahora
aprobadas, y se utilizan en países europeos y en algunos otros para programas de análisis y seguimiento a
gran escala. Constituyen un medio de análisis de animales en la fase tardía del período de incubación (los
últimos meses), por ejemplo en muestreos de material post-mortem recogido de ganado bovino sacrificado
rutinariamente. Estas pruebas, desarrolladas recientemente, ofrecen una ayuda eficaz en países que llevan
a cabo un seguimiento de la detección de nuevos casos de EEB y en aquellos otros en los que se
considera necesario un medio para determinar la prevalencia de EEB, que sea independiente del sistema
de la declaración de casos sospechosos. Desde su introducción en Europa, en Enero de 2001, estas
pruebas han sido las responsables de la identificación de la mayoría de los animales infectados por EEB.
En algunos países, dada la rapidez con que pueden obtenerse los resultados, las pruebas rápidas
constituyen la prueba inicial preferida, aunque la confirmación de un diagnóstico de EEB requiere el
examen del cerebro fijado por histopatología y/o por IHC.

En el año 2001 la Comisión Europea evaluó una nueva generación de pruebas rápidas de diagnóstico (33,
70). El proceso ha resaltado la necesidad de tal evaluación y ha identificado los peligros de utilizar
prematuramente los medios de investigación para un control activo. Aunque el programa de evaluación
sirve para apoyar la legislación europea respecto al seguimiento de la EEB, las consecuencias son también
relevantes para otros países. La aparición de resultados falsos positivos y negativos es tan elevada que la
introducción de nuevas pruebas debería basarse antes en una cuidadosa evaluación de la prueba y de su
realización. Las pretensiones de los fabricantes deberían basarse en datos, evaluados preferiblemente de
modo independiente. Hay que destacar que el proceso de una validación completa de todos estos métodos
de diagnóstico de la EEB está limitado por la ausencia de un verdadero estándar de oro y por la
consiguiente necesidad de aplicar estándares de comparación que están basados en relativamente pocos
estudios. Por tanto, persiste la necesidad de que se publiquen estudios a gran escala sobre realización de
las pruebas ya que ninguno de los datos publicados hasta la fecha cumple los procedimientos reconocidos
para la validación de las pruebas de otras enfermedades. Los estudios iniciados por la Comisión Europea
representan evaluaciones de las pruebas, y sus validaciones están en marcha. Debe tenerse cuidado con la
interpretación comparada de las pruebas cuando se aplican a animales aparentemente sanos ya que las
diferentes pruebas pueden variar en sensibilidad respecto a la fase de incubación y a la patogénesis de la
enfermedad.
A continuación se presentan algunos breves detalles de las cinco pruebas aprobadas actualmente por la
Unión Europea para su utilización. Ver la Sección B1 para el intercambio de terminología respecto a la
forma anormal de PrP.
• La prueba Enfer Test2 es una prueba cualitativa basada en un inmunoensayo quimioluminiscente en

microplaca para la detección de la proteína resistente del prión (PrPres). La PrPres extraída de
muestras se une a pocillos preparados en placas de microtitulación y se detecta con un anticuerpo
primario policlonal anti-PrP, un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano, y un
substrato quimioluminiscente.
• La prueba Platelia® o TeSeE®3 es un inmunoensayo en sándwich que utiliza dos anticuerpos
monoclonales para la detección de la proteína anormal del prión que es resistente a la proteinasa K.
La presencia de la PrP anormal se revela por un substrato coloreado. La prueba se ha autorizado
tanto en formato manual como automatizado.
• La prueba Prionics® Check Western Blot4 es un método basado en inmunotransferencia para la
detección de la forma específica de la enfermedad de la proteína del prión. Las muestras se
homogenizan y se tratan con proteinasa para eliminar la PrP normal (PrPc) y para convertir la PrPres al
fragmento PrP27-30. Las muestras se separan por electroforesis en gel, se transfieren a una
membrana y se identifica PrP27-30 por su inmunoreactividad con anticuerpos anti-PrP y por los pesos
moleculares de las bandas
• La prueba CDI5 es un inmunoensayo de conformación automatizada para la detección de la
enfermedad que origina PrPres. La prueba se basa en un ELISA tipo sándwich que utiliza un
anticuerpo marcado con europio para detectar cualquier PrP presente en la muestra. La comparación
entre la forma normal (PrPc) y la total (PrPc más PrPres) permite determinar el nivel de la PrPres
anormal presente en la muestra.
• La prueba Prionics® Check LIA6 es un inmunoensayo luminiscente en microplaca. Las muestras se
tratan con proteinasa K para degradar la PrPc, mientras la PrPres se reduce al fragmento de 27-
30 kDa. La reacción proteolítica se detiene y la PrPres que contiene la muestra se detecta por un
enzimoinmunoensayo en sándwich con una reacción enzimática quimioluminiscente.
d) Otras pruebas de diagnóstico
Mediante tinción negativa de los extractos de tejido encefálico o medular, fresco o congelado obtenidos con
detergentes, se ha empleado como método adicional de diagnóstico de la EEB la demostración por
microscopía electrónica de las fibrillas características, que son las homólogas en los bóvidos a las SAF en
ovinos (ver Capítulo 2.4.8. Prurigo lumbar), (75, 79, 92). Esta evidencia es particularmente útil cuando el
examen histopatológico resulta difícil por la descomposición post-mortem (74). Trabajos recientes sobre el
2 Prueba distribuida por: Abbot Diagnostics, Abbot Laboratorios, 100 Abbot Park Road, Abbot Park, IL 60034-3500, EE.UU.
3 Platelia Bio-Rad (Una versión posterior de esta prueba, la TeSeE, ha sido aprobada por la Comisión Europea y está
actualmente comercializada). Bio-Rad, 3 Boulevard Raymond Poincar, 92430 Marnes la Coquette, Paris, Francia.
4 Prionics Check Western Blot and Prionics LIA: Prionics, Wagistrasse 27a, CH-8952 Schlieren, Suiza. Distribuidor: Roche
Diagnpostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania.
5 Prueba CDI: InPro Biotechnology, 870 Dubuque Avenue, South San Francisco, CA 94080, EE.UU.
6 Prionics LIA, Wagistrasse 27a, CH-8952 Schlieren, Suiza (ver nota 4 a pie de página), www.prionics.com

prurigo lumbar indican que el método se puede aplicar, con modificaciones, a tejido fijado con formalina
(13). La detección de las fibrillas se correlaciona bien con el diagnóstico histopatológico de la EEB (77) pero
no ofrece la especificidad o sensibilidad que presentan los métodos de IHC o de inmunotransferencia.
Algunas de las pruebas inmunológicas rápidas también son eficaces en presencia de autolisis (14) y dada
su mayor sensibilidad que la detección de SAF pueden ser las pruebas preferidas en tales circunstancias.
La infección por EEB se puede observar mediante una inoculación intracerebral/intraperitoneal (39) o por
alimentación de ratones con tejido cerebral de ganado con una afección terminal (6), pero este bioensayo
no resulta práctico para el diagnóstico rutinario debido al largo tiempo de incubación (> 292 días). Un futuro
desarrollo de ratones transgénicos que sobreexpresen el gen PrP bovino podría, teóricamente, ofrecer
bioensayos con períodos de incubación más cortos para la EEB. Sin embargo, los datos obtenidos de un
estudio de este tipo no conducen a períodos de incubación más reducidos que los de las cepas normales
de ratones (12).
Existe la necesidad de una prueba para la EEB que pueda aplicarse al animal vivo y que tenga una
sensibilidad capaz de detectar PrPres a niveles bajos, como ocurre en las primeras fases del periodo de
incubación de la enfermedad. De vez en cuando se publican diversos enfoques potenciales, a menudo de
forma preliminar, basados solo en datos limitados. Ninguno ha progresado hasta el punto de superar una
revisión detallada y la evaluación crítica por otros, de modo que las pretensiones de dichos trabajos deben
interpretarse con cautela.
Algunas proteínas marcadoras, fundamentalmente la apolipoproteína E (Apo E), se pueden detectar por
electroforesis bidimensional en el líquido cerebroespinal de casos clínicamente sospechosos e
histopatológicamente confirmados de EEB (53). Sin embargo, la Apo E es un marcador inespecífico de
neurodegeneración y no puede ser útil para el diagnóstico de casos preclínicos de EEB. El análisis del
líquido cerebroespinal para la proteína 14-3-3 tampoco es de utilidad en el diagnóstico de la EEB (68). De
modo similar, los estudios sobre las proteínas S-100 en el líquido cerebroespinal (45) y en el suero (67) no
proporcionan resultados sobre los que basar pruebas útiles para el diagnóstico de EEB. La detección
electroquímica de metabolitos en la orina (52) presenta una validación final que indica unos valores de
especificidad y sensibilidad inferiores a los requeridos para un posible papel independiente en el
diagnóstico de la EEB. Hay datos preliminares que indican que en la orina del ganado bovino infectado se
puede detectar un derivado de la molécula de PrP (77), lo que ha abierto nuevas investigaciones con vistas
a comercializar una prueba de diagnóstico, pero se necesita más evaluación y revisión de los datos.
2) Pruebas serológicas
A semejanza de lo que ocurre con el prurigo lumbar, donde no se ha detectado respuesta inmune en el
hospedador, parece probable que no exista respuesta inmune en el caso de la EEB.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO

En la actualidad no existen productos biológicos disponibles. Como se ha comentado anteriormente, en muchos
países se ha autorizado la utilización de kits comerciales para diagnóstico.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la encefalopatía espongiforme bovina (ver Cuadro en la
Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int).

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2.3.13 Encefalopatia Espongiforme Bovina

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CAPÍTULO 2.3.13.

ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA

La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurológica, mortal, reconocida

Se sospecha que el agente de la EEB es la fuente común de encefalopatías espongiformes

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 593

una proteína de membrana PrP1 (denominada PrPres) que es específica de la enfermedad y

Para confirmar el diagnóstico de la encefalopatía espongiforme, es necesario realizar un examen

La EEB se puede transmitir al ratón mediante la inoculación intracerebral o intraperitoneal de tejido

Pruebas serológicas: En las EETs no se han detectado respuestas inmunes específicas.

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En la actualidad no existen

1 PrP: Proteína prión.

594 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Durante el transcurso de la epizootia de EEB se ha sospechado la existencia de EETs en varias especies de

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 595

1. Identificación del agente

596 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 597

Cuando en un país en particular se detecta la presencia de EEB en la población de ganado bovino

598 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

• Obtención del tallo cerebral o médula

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 599

600 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

c) Detección de formas de PrP específicas de la enfermedad

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 601

• Marcaje inmunohistoquímico de PrP específica de la enfermedad

i) Eliminar la parafina de los cortes en xileno durante 10 minutos.

602 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

• Protocolo para el diagnóstico de las EET mediante inmunotransferencia de SAF

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 603

604 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

• SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) e

iv) Extraer el peine y montar el aparato del gel.

- tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampón de transferencia, de tamaño

- tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampón de transferencia.

Cerrar la cámara semiseca y efectuar la transferencia a 15 V durante 50 minutos.

ix) Sacar la membrana de la cámara de transferencia y bloquearla en 20 ml de I-Block (5% de leche en

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 605

• Interpretación de los resultados

Muestra para diagnóstico:

• Pruebas rápidas para la detección de las formas de PrP específicas de la enfermedad

606 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

• La prueba Enfer Test2 es una prueba cualitativa basada en un inmunoensayo quimioluminiscente en

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 607

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO

1. ADVISORY COMMITTEE ON DANGEROUS PATHOGENS (1998). Transmissible Spongiform Encephalopathy Agents:

608 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 609

610 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 611

612 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 613

614 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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