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BIB 315 – METABÓLITOS VEGETAIS: ORIGEM, DIVERSIDADE E APLICAÇÕES

Prática 9: Análise e doseamento de flavonoides UV e CLAE

Objetivos: Analisar o teor de flavonoides totais dos extratos alcoólicos obtidos anteriormente através de
espectrofotometria de UV/vis e CLAE.

A. Preparo da Curva Padrão de Rutina


1. Utilizar uma solução de Rutina 100 µg/mL (2,5 mg de Rutina dissolvidos em 25 mL de MeOH - em balão
volumétrico) – Sol. R.
2. Tomar alíquotas dessa solução de acordo com a tabela abaixo:

Espectrofotômetro CLAE
Sol. R MeOH µg/mL µg na Abs Abs µg na Área do pico*
(mL) mL reação (grupo 1) (grupo 2) reação
1 0,000 1,000 0
2 0,030 0,970 3,0
3 0,050 0,950 5,0
4 0,100 0,900 10,0
5 0,150 0,850 15,0
6 0,200 0,800 20,0
7 0,250 0,750 25,0
8 0,300 0,700 30,0
9 0,500 0,500 50,0
10 0,600 0,400 60,0

3. Tomar uma alíquota de 0,5 mL de cada ponto preparado acima.


4. Adicionar 0,5 mL da solução de cloreto de alumínio em cada ponto da curva.
5. Deixar em repouso por 15 minutos e ler a absorbância em espectrofotômetro UV/Visível a 420 nm,
usando a solução correspondente a 0 µg de rutina como referência (branco).
6. Do volume restante das soluções preparadas para compor a curva padrão, injetar 25 µL no CLAE.
Anotar a área do pico produzido pela cromatografia líquida.
B. Doseamento
1. Em tubos com tampa, transferir uma alíquota de 0,5 mL do extrato bruto produzido na aula anterior
(Análise de Fenóis Totais).
2. Acrescentar 0,5 mL de solução de cloreto de alumínio.
3. Ler a absorbância em espectrofotômetro UV/Visível a 420 nm após 15 minutos.
Espécie Abs
Thunbergia erectus
Nicotiana sp
Psidium guajava
Piptadenia gonoacantha

C. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)


1. Injetar 25 µL de cada extrato bruto no cromatógrafo líquido.
Sistema de Solventes: A. ácido acético 0,1%, B. acetonitrila; Coluna Zorbax (4,6 x 250 mm, 5 µ) RP
C18.
Gradiente: 0-5 min 12% de B; 5-8 min 12-20% de B; 8-28 min 20% de B; 28-38 min 20-50% de B; 38-
48 min 50-65% de B; 48-50 min 65-100% de B; 50-55 min 100% de B; 55-60 min 12% de B.
Fluxos: 0-40 min 0,5 mL/min; 40-55 min 1 mL/min; 55-56 0,5 mL/min 56-60 0,5 mL/min.
Detector 352 nm.

No relatório
1. Comparar as espécies com relação ao teor de flavonóides (porcentagem ou mg/g) que elas
apresentaram.
2. Calcular a porcentagen do pico de maior abundância indicado no cromatograma da espécie do seu
grupo.
3. Apresentar como anexo a tabela com os valores e o cálculo completo feito para o material do seu grupo.

Preparo de Soluções:
o
Cloreto de Alumínio: Pesar 5 g de cloreto de alumínio previamente seco em estufa a 110 C por 3 horas e
dissolver em 100 mL de água.