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Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná


Tecnologia em Processos Químicos

PREPARAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE ​Escherichia Coli


E EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL

Alunos: Adson Ruan Gonçalves –


adson@alunos.utfpr.edu.br
Alexandre H. G. de Souza –
xandysouza2017@outlook.com
Ana Paula de Matos –
ana_188_paula@hotmail.com
André Bassi –
afbassi@hotmail.com
Fabio Grota Moraes –
fabiogm_0807@hotmail.com

Professor: Dr. Thiago Cintra Maniglia

Toledo, 09 de Maio de 2018.


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Tecnologia em Processos Químicos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 2
2. OBJETIVOS 4
2.1 Objetivo Principal 4
2.2 Objetivos específicos 4
​3. ​METODOLOGIA EXPERIMENTAL 5
3.1 ​Materiais e Reagentes 5
3.2 ​Procedimento Experimental para transformação de E.coli 6
3.3 Procedimento experimental para a extração do DNA plasmidial 7
​ 4. ​RESULTADOS E DISCUSSÃO 8
4.1 Preparação e transformação de E. coli 8
4.2 Extração de DNA plasmidial 10
​ 5. ​CONCLUSÃO 11

6. ​REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12

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1. INTRODUÇÃO

A transformação bacteriana consiste na inserção de um gene específico em uma


célula receptora, para posteriormente esse gene ser expresso na mesma, essa técnica
permite o melhoramento genético de vários organismos, podendo ser na aplicada em
várias áreas, coma na agricultura, medicina e meio ambiente.
Na transformação, as células devem ser tornadas competentes, ou seja, devem
ser capazes de receber e multiplicar o DNA exógeno. Muitos métodos para
transformação bacteriana foram baseados nas observações de Mendel e Higa, em
1970, que demonstraram que bactérias tratadas com soluções geladas de cloreto de
cálcio e, logo após, sendo brevemente aquecidas, podiam ser transfectadas com DNA
do bacteriófago.
A transformação por choque térmico e cloreto de cálcio é bastante econômica.
Primeiramente as bactérias são tratadas com a solução de NaCl, para posteriormente
serem submetidas a um aumento brusco de temperatura, dessa forma, gerando uma
diferença de pressão entre o interior e exterior da célula induzindo a formação de poros
na membrana plasmática, fazendo com que o DNA exógeno possa entrar na célula
hospedeira.
O processo de transformação faz uso de várias enzimas que modificam as
moléculas de DNA pela adição ou remoção de grupamentos químicos. Dentre elas
estão: as DNA-polimerases, enzimas responsáveis por sintetizar uma nova fita de DNA.
Transcriptases reversas promovem a replicação do RNA. Enzimas de restrição estão
presentes em procariotos como forma de defesa, sua função é clivar o DNA.

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Os vetores utilizados para transformar as células hospedeiras, são chamados de


elementos genéticos móveis, podem ser: plasmídeos, bacteriófagos e cosmídeos.
Sendo que cada um suporta respectivamente 10 kb, 10 a 20 kb, 30 a 45 kb.
A seleção das células transformadas pode ser feita com o auxílio de marcadores
de seleção. Os mesmos são responsáveis por conferir uma nova característica à
células transformada, inexistente na célula não transformada. A maioria dos plasmídeos
utilizados como vetores de clonagem, apresenta genes que tornam as bactérias
transformadas resistentes a antibióticos. Então a seleção das células pode ser
executada, colocando as células transformadas para crescerem em um meio sólido
contendo determinado antibiótico. Porém, é necessário que as enzimas que conferem
resistência ao antibiótico já estejam presentes no meio, para isso logo após o choque
térmico e antes de serem expostas ao meio de seleção, elas devem ser colocadas, por
pouco tempo, em um pequeno volume de meio líquido sem antibiótico. Isso fará com
que ocorra a replicação do plasmídeo, juntamente com a expressão de seus genes.
Dessa forma quando as células forem expostas ao meio seletivo elas já sintetizaram
quantidade suficiente das enzimas que conferem resistência, e poderão sobreviver a
ação seletiva.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Principal

Preparar e transformar uma colônia de bactéria ​Escherichia coli​, para que a mesma,
após a transformação, apresentasse resistência à ampicilina e extrair o DNA plasmidial
de uma cultura de bactérias.

2.2 Objetivos específicos

● Tornar a cultura de​ E.coli​ competente e transformá-la;


● Observar o crescimento, ou não, da cultura de ​E.coli​ após a transformação;
● Extrair o DNA plasmidial de ​E.coli​ através do Kit Miniprep Quiagen©.

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3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1 Materiais e Reagentes

● Centrífuga;
● Tubos eppendorf estéril;
● Tubos de ensaio;
● Micropipetas eletrônicas;
● Placas de Petri;
● Agitador tipo Vortéx;
● Gelo;
● Meio de cultura LB (Luria Bertani);
● Triptona;
● Extrato de levedura;
● Água destilada;
● Solução de CaCl2;
● Ampicilina;
● Plasmídeo;
● Células de E.coli;
● Kit Miniprep Quiagen©, contendo todos os tampões utilizados;
● Coluna de centrifugação.

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3.2 Procedimento Experimental para transformação de ​E.coli

Antes da prática, os técnicos do laboratório, prepararam os meios de cultura e o


cultivo das células para que fosse possível realizar as transformações de ​E. coli ​para a
aula prática. Os meios e o cultivo foram preparados com o meio LB.
Para o início da prática transferiu-se as células de ​E. coli ​para o microtubo, e,
posteriormente centrifugado por 8,0 min a 13000 rpm. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e a massa de células foi ressuspendida com 10 ml da
solução de CaCl​2​. Com o auxílio de um agitador tipo Vórtex, foi misturado a suspensão
com o reagente e levado para a centrífuga por 8,0 min à 13000 rpm, e descartou-se o
sobrenadante.
As células foram ressuspendidas mais uma vez com a solução de CaCl​2 e

mantidas em gelo por 10 min. Após isso, a solução foi levada a centrífuga por mais 10
min e descartado o sobrenadante. O sedimento foi ressuspendido com mais 5 ml de
CaCl​2​.
Com o auxílio de uma micropipeta transferiu-se 200 µL de células competentes
em um tubo eppendorf estéril, adicionando 5 µL do plasmídeo e posteriormente
incubando-o no gelo por 10 min. Feito isso, utilizou-se do banho maria para esquentar
a solução a 42°C por 2 min e rapidamente levando ao gelo por 30 segundos para dar
um heatshock. Adicionou-se mais 5 ml de meio LB, que posteriormente, fora agitado a
37°C por 30 minutos. Após a agitação, centrifugou-se o tubo por 5 min, descartando o
sobrenadante e ressuspendeu-se as células em uma pequena quantidade de meio no
tubo.
As células foram semeadas no meio, nas placas de petri, contendo ampicilina e
em meio sem a presença de ampicilina.

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3.3 Procedimento experimental para a extração do DNA plasmidial

Para o início da prática centrifugou-se 5 ml da cultura de bactérias a 12000 rotações por


minuto, por 3 min, e posteriormente, descartou-se o sobrenadante. Após isso, foi
ressuspendido pellet em 250 µL de tampão P1 e mais 250 µL de tampão P2 e agitou-se
o tubo manualmente diversas vezes a fim de tornar a solução azul. Adicionou-se mais
350 µL de tampão N3 e mais uma vez invertendo até ficar incolor.
Centrifugou-se por 10 min a 13000 rpm, o sobrenadante foi transferido para a
coluna de centrifugação e posteriormente centrifugado por 1 min a 13000 rpm,
descartando o líquido que passou pela coluna. A coluna foi lavada com 750 µL do
tampão PE e centrifugado novamente por mais 1 min. O líquido que atravessou a
coluna foi descartado e a coluna foi centrifugada por mais 1 min, com o objetivo de
retirar os resíduos do filtro.
No final, a coluna foi transferida para um tubo eppendorf e adicionado 50 µL de
tampão EB no centro do filtro e centrifugado por 1 min. Dado isso, a amostra foi
guardado em um freezer a -20°C.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Preparação e transformação de ​E. coli

Cada etapa do procedimento experimental tem um objetivo distinto. As soluções


de células cultivadas no meio LB foram centrifugadas para que a biomassa se
separasse de maneira efetiva do meio, sendo este descartado posteriormente.
A etapa preliminar de preparação das células, para que pudessem receber os
plasmídeos, foi realizada de acordo com um método físico, consistindo basicamente de
um choque térmico, ou seja, um aumento rápido de temperatura seguido de um
resfriamento, criando um gradiente de pressão entre os meios extra e intracelular e
induzido a formação de poros na membrana plasmática da bactéria pelos quais os
plasmídeos conseguem adentrar a célula (CALVETE ​et al.​, 2015). Como mecanismo
auxiliar, utilizou-se o cloreto de cálcio de forma a neutralizar uma eventual repulsão
eletrostática entre o DNA plasmidial e a membrana plasmática da célula (BROOKS ​et
al.​, 2012), ou seja, é possível considerar este procedimento como um método
termoquímico.
Vale salientar que a adição de cloreto de cálcio se deu em duas etapas,
consistindo num aumento gradativo da concentração da solução. O objetivo por trás
disso foi evitar que o meio se tornasse hipertônico, repentinamente, e causasse a lise
celular.
Ao final desta etapa, as células – teoricamente – competentes foram novamente
separadas do meio líquido por meio de uma centrifugação e empregadas na

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metodologia de transformação. A solução de plasmídeo foi adicionada às células, que


passaram pelo choque térmico de forma a induzir a entrada dos plasmídeos pelos
poros formados na membrana plasmática.
As células – teoricamente – transformadas foram inoculadas novamente no meio
LB de forma a favorecer a adaptação e iniciar o crescimento celular (fase lag) antes de
serem cultivadas em placas contendo meio LB sólido com e sem ampicilina. A solução
de células não-transformadas também foi incubada em placas com e sem ampicilina.
Um resumo do que se observou após o período de cultivo – e o que isso significa para
fins de avaliação do método utilizado, é apresentado abaixo.
● Células não transformadas em meio sem ampicilina: houve crescimento
celular, indicando que a cultura original era viável.
● Células não transformadas em meio com ampicilina: não houve
crescimento, indicando que a cultura original não apresentava resistência
ao antibiótico.
● Células transformadas em meio sem ampicilina: houve crescimento,
evidenciando que o processo não causou danos à cultura (isto é, não
destruiu as células inicialmente viáveis).
● Células transformadas em meio com ampicilina: houve crescimento,
mostrando que esta cultura foi efetivamente transformada, manifestando a
ação do DNA plasmidial.
A resistência à ampicilina foi conferida por conta da região amp​R do DNA
plasmidial e sua manifestação mostra que o método termoquímico utilizado foi
bem-sucedido para a transformação de ​E. coli​, representando uma boa alternativa para
a Engenharia Genética. Além disso, este método é bastante empregado em especial
por se tratar de uma técnica barata, já que não precisa de equipamentos caros e/ou

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mais sofisticados como é o caso para outros métodos de transformação tais quais a
eletroporação e a biobalística (CALVETE ​et al.​, 2015).

4.2 Extração de DNA plasmidial

Cada etapa experimental possui uma função diferente. A cultura bacteriana foi
centrifugada com o objetivo de separar a biomassa do meio, sendo esse descartado.
Com a adição do tampão P1, que continha RNAse, na ressuspensão, preservou-se a
integridade do DNA devido seu pH evitar a ação da DNAse ao EDTA, que age quelando
os cofatores Mg​+ e Ca​+ (REGITANO et al., 2001), ao mesmo tempo que degradou o
RNA. Os tampões P2 e N3 tinham como objetivo desnaturar proteínas, evitando assim
que alguma enzima acabasse degradando o DNA, causando perda do DNA de
interesse.
Após a centrifugação para remover as proteínas desnaturadas e o RNA
degradado, o sobrenadante foi transferido para a coluna de centrifugação, para separar
o DNA do meio através de outra centrifugação. O tampão PB foi adicionado com o
intuito de purificar e o PE para fazer com que o DNA genômico perca a afinidade,
fazendo assim, com que, na coluna de centrifugação restasse apenas o DNA
plasmidial. Com a coluna transferida para um tubo eppendorf, pode-se finalmente
adicionar o tampão EB, que fez com que o DNA plasmidial perdesse a afinidade e fosse
coletado e, posteriormente, armazenado com sucesso.
O isolamento de DNA plasmidial é um procedimento básico e fundamental para a
clonagem molecular. Existem muitas técnicas disponíveis que permitem o isolamento
de DNA (LIMA, 2008), e a utilização de kits de extração facilitam o processo, pois eles
fornecem os tampões e reagentes necessários além de explicitar o protocolo a se
seguir, garantindo o sucesso da extração e evitando que amostras sejam perdidas.

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5. CONCLUSÃO

É possível concluir que obteve-se êxito em ambos os procedimentos. Ao final do


experimento para transformar a colônia de ​E.coli​, conferindo-a resistência à ampicilina,
por meio do método termoquímico, alcançou-se os resultados desejados, assim como
era previsto pelo protocolo. O experimento para a extração do DNA plasmidial também
ocorreu da forma esperada.
Portanto, entende-se que ambas as técnicas são de fundamental importância
para a Engenharia Genética e clonagem gênica, de modo que, ambas são
relativamente baratas além de serem de fácil execução, proporcionando assim,
resultados rápidos e de forma eficaz.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BROOKS, Geo F.; Butel, Janet S.; Morse, Stephen A. ​Microbiologia Médica de
Jawetz, Melnick e Adelberg​. 25. ed. São Paulo: Artmed, 2012.

CALVETE, Crislaine L.;Caseiro, Marcos M. C.; Souza, Cleide B. Biotecnologia:


Transformação bacteriana por método de choque térmico. ​Revista UNILUS Ensino e
Pesquisa​, v. 12, n. 26, jan./mar. 2015. ISSN 2318-2083 (eletrônico).

LIMA, L. M. de. - ​Conceitos básicos de técnicas em biologia molecular.​Campina


Grande: Embrapa Algodão, 2008.

REGITANO, L. C. de A.; COUTINHO, L. L. (Ed.). - ​Biologia molecular aplicada à


produção animal​. Embrapa Informação Tecnológica, Brasília, 2001.

ZARA, A. ​Biologia molecular básica.​ 5. ed. Porto Alegre, 2014.

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