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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 2
2. OBJETIVOS 4
2.1 Objetivo Principal 4
2.2 Objetivos específicos 4
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL 5
3.1 Materiais e Reagentes 5
3.2 Procedimento Experimental para transformação de E.coli 6
3.3 Procedimento experimental para a extração do DNA plasmidial 7
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 8
4.1 Preparação e transformação de E. coli 8
4.2 Extração de DNA plasmidial 10
5. CONCLUSÃO 11
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12
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Tecnologia em Processos Químicos
1. INTRODUÇÃO
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2. OBJETIVOS
Preparar e transformar uma colônia de bactéria Escherichia coli, para que a mesma,
após a transformação, apresentasse resistência à ampicilina e extrair o DNA plasmidial
de uma cultura de bactérias.
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3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
● Centrífuga;
● Tubos eppendorf estéril;
● Tubos de ensaio;
● Micropipetas eletrônicas;
● Placas de Petri;
● Agitador tipo Vortéx;
● Gelo;
● Meio de cultura LB (Luria Bertani);
● Triptona;
● Extrato de levedura;
● Água destilada;
● Solução de CaCl2;
● Ampicilina;
● Plasmídeo;
● Células de E.coli;
● Kit Miniprep Quiagen©, contendo todos os tampões utilizados;
● Coluna de centrifugação.
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mantidas em gelo por 10 min. Após isso, a solução foi levada a centrífuga por mais 10
min e descartado o sobrenadante. O sedimento foi ressuspendido com mais 5 ml de
CaCl2.
Com o auxílio de uma micropipeta transferiu-se 200 µL de células competentes
em um tubo eppendorf estéril, adicionando 5 µL do plasmídeo e posteriormente
incubando-o no gelo por 10 min. Feito isso, utilizou-se do banho maria para esquentar
a solução a 42°C por 2 min e rapidamente levando ao gelo por 30 segundos para dar
um heatshock. Adicionou-se mais 5 ml de meio LB, que posteriormente, fora agitado a
37°C por 30 minutos. Após a agitação, centrifugou-se o tubo por 5 min, descartando o
sobrenadante e ressuspendeu-se as células em uma pequena quantidade de meio no
tubo.
As células foram semeadas no meio, nas placas de petri, contendo ampicilina e
em meio sem a presença de ampicilina.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
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mais sofisticados como é o caso para outros métodos de transformação tais quais a
eletroporação e a biobalística (CALVETE et al., 2015).
Cada etapa experimental possui uma função diferente. A cultura bacteriana foi
centrifugada com o objetivo de separar a biomassa do meio, sendo esse descartado.
Com a adição do tampão P1, que continha RNAse, na ressuspensão, preservou-se a
integridade do DNA devido seu pH evitar a ação da DNAse ao EDTA, que age quelando
os cofatores Mg+ e Ca+ (REGITANO et al., 2001), ao mesmo tempo que degradou o
RNA. Os tampões P2 e N3 tinham como objetivo desnaturar proteínas, evitando assim
que alguma enzima acabasse degradando o DNA, causando perda do DNA de
interesse.
Após a centrifugação para remover as proteínas desnaturadas e o RNA
degradado, o sobrenadante foi transferido para a coluna de centrifugação, para separar
o DNA do meio através de outra centrifugação. O tampão PB foi adicionado com o
intuito de purificar e o PE para fazer com que o DNA genômico perca a afinidade,
fazendo assim, com que, na coluna de centrifugação restasse apenas o DNA
plasmidial. Com a coluna transferida para um tubo eppendorf, pode-se finalmente
adicionar o tampão EB, que fez com que o DNA plasmidial perdesse a afinidade e fosse
coletado e, posteriormente, armazenado com sucesso.
O isolamento de DNA plasmidial é um procedimento básico e fundamental para a
clonagem molecular. Existem muitas técnicas disponíveis que permitem o isolamento
de DNA (LIMA, 2008), e a utilização de kits de extração facilitam o processo, pois eles
fornecem os tampões e reagentes necessários além de explicitar o protocolo a se
seguir, garantindo o sucesso da extração e evitando que amostras sejam perdidas.
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5. CONCLUSÃO
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BROOKS, Geo F.; Butel, Janet S.; Morse, Stephen A. Microbiologia Médica de
Jawetz, Melnick e Adelberg. 25. ed. São Paulo: Artmed, 2012.
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