ANTOLOGÍA DE

QUÍMICA ANALÍTICA II
IQM-042

LICENCIATURA EN INGENIERIA QUÍMICA

CICLO 1

1
Presentación
El Ingeniero Mecatrónico es un profesional polifacético porque puede desempeñar cargos en
diferentes campos laborales. Debido a ello, se hace imperante que el estudiante de ingeniería tenga
dominio del inglés para cuando se convierta en profesional reciba buenas ofertas de trabajo. Pero
esto no es fácil, hay que motivar a los futuros ingenieros a que sientan interés por este idioma y es
por ello que en esta aventura del mundo del conocimiento en la que estamos inmersos tanto
docentes como estudiantes, es necesario que el docente despierte en sus estudiantes el interés por
el estudio de este idioma que es reconocido como el idioma universal para las comunicaciones.

El idioma inglés es una herramienta clave para el triunfo profesional, ya que nos permite
intercambiar con otras culturas a nivel mundial, por algo es considerado el idioma de las
comunicaciones. Con respecto al avance tecnológico, es indiscutible que el inglés se ha convertido
en el idioma de mayor uso en el mundo, cada día se emplea más en casi todas las áreas del
conocimiento y desarrollo humano.

Su aprendizaje ya no es un lujo, sino que es una necesidad. Por eso se dice que quien no domine esa
lengua estaría en desventaja con respecto a otros profesionales. En el campo laboral, si uno como
profesional conoce dicho idioma, se le abrirán prácticamente todas las puertas en este campo, ya
que serían muchas las ofertas de trabajo que les permitiría obtener fuentes de empleo muy bien
remuneradas. Dichas ofertas pueden ser, desde un empleo con salario medio hasta los más altos
niveles profesionales y gerenciales.

Hoy en día, cualquier investigador o profesional que quiera estar al día o acceder a libros
especializados necesita irremediablemente saber inglés para estar informado de los rápidos avances
que están teniendo lugar en su área de conocimiento, ya que el avance rápido de la tecnología en
todos los campos, llegan constantemente a las empresas ya sean nuevos equipos, aparatos e
instrumentos cuyas instrucciones de funcionamiento y mantenimiento suelen estar redactados en
su mayoría en inglés.

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Temario
Presentación........................................................................................................................................ 2
Temario ............................................................................................................................................... 3
Unidad I. Generalidades del análisis instrumental.............................................................................. 5
1.1. Métodos clásicos e instrumental. ............................................................................................ 5
1.2. Clasificación de las técnicas instrumentales. ........................................................................... 5
1.3 Sensibilidad y límites de detección. .......................................................................................... 6
1.4 Relación señal-ruido .................................................................................................................. 7
1.5 Calibración de los métodos instrumentales. ............................................................................. 8
1.6. Curvas de calibración ............................................................................................................. 10
1.6.1 Método de estándar externo ............................................................................................... 10
1.6.2 Método de estándar interno ................................................................................................ 11
Unidad II. Métodos espectrofotométricos ........................................................................................ 12
2.1 Propiedades de la Radiación electromagnética. ..................................................................... 12
2.1.1 Espectro electromagnético .................................................................................................. 14
2.1.2 Absorción de radiación......................................................................................................... 15
2.1.3 Ley de Beer ........................................................................................................................... 16
2.2 Espectroscopia de absorción en el visible y en el UV.............................................................. 17
2.2.1 Fundamento de la absorción de radiación visible por una muestra. ................................... 18
2.2.2 Características generales de los instrumentos utilizados para espectroscopia de absorción
en el visible en el laboratorio. ....................................................................................................... 18
2.3 Espectroscopia de absorción en el infrarrojo. ........................................................................ 20
2.3.1 Fundamento de la absorción de radiación infrarroja .......................................................... 21
2.3.2 Características generales de los espectrofotómetros IR ...................................................... 23
2.3.3 Manejo de muestras para la generación de espectros de absorción IR .............................. 25
2.3.4 Interpretación de espectros de absorción IR de compuestos sencillos ............................... 27
2.3.5 Instrumentación del equipo ................................................................................................. 29
2.4 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear................................................................. 31
2.4.1 Principio de la resonancia magnética nuclear...................................................................... 32
2.4.2 Protones equivalentes e Integración ................................................................................... 32
2.4.3 Teoría del desplazamiento químico ..................................................................................... 33
2.4.4 Multiplicidad y constantes de acoplamiento ....................................................................... 34
2.4.5 Elucidación estructural de compuestos orgánicos ............................................................... 36

3
 2.5 Espectroscopia de absorción atómica. .................................................................................... 36
2.5.1 Aplicación ............................................................................................................................. 38
2.5.2 Instrumentación ................................................................................................................... 40
2.5.3 Técnicas analíticas ................................................................................................................ 46
2.6 Espectrometría de masas. ....................................................................................................... 48
2.6.1 Conceptos de: espectro de masas, ión molecular o progenitor de pico base ..................... 51
2.6.2 Partes fundamentales de un espectrómetro de masas ....................................................... 52
2.6.3 Determinación del peso molecular y de la formula molecular por espectrometría de
masas............................................................................................................................................. 57
Determinación del peso molecular ............................................................................................... 58
Determinación de fórmulas moleculares ...................................................................................... 58
Unidad III. Métodos cromatográficos ............................................................................................... 60
3.1 Introducción. ........................................................................................................................... 60
3.1.1 Concepto y desarrollo histórico de la cromatografía ........................................................... 61
3.1.2 Conceptos de fase estacionaria y de fase móvil .................................................................. 61
3.1.3 Clasificación de los métodos cromatográficos ..................................................................... 62
3.2 Cromatografía de gases........................................................................................................... 62
3.2.1 Instrumentación ................................................................................................................... 63
3.2.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CG/EM ............................... 64
3.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución. ........................................................................ 64
3.3.1 Instrumentación ................................................................................................................... 65
3.3.2 Sistema de Bombeo ............................................................................................................. 66
3.3.3 Columnas y fases estacionarias ............................................................................................ 66
3.3.4 Detectores ............................................................................................................................ 70
3.3.5 Fase Normal y Fase Inversa Instrumentación ...................................................................... 71
3.3.6 Derivatización. ...................................................................................................................... 73

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Unidad I. Generalidades del análisis instrumental
1.1. Métodos clásicos e instrumental.

Métodos clásicos, que se basaban en propiedades químicas del analito. Se incluyen las gravimetrías,
las volumetrías y los métodos de análisis cualitativo clásico.

Métodos instrumentales, basados en propiedades químico-físicas. La clasificación de los métodos

instrumentales se realiza en base a la propiedad que se mide (espectroscópicos, electro analíticos,
térmicos...).

1.2. Clasificación de las técnicas instrumentales.

Las técnicas analíticas instrumentales las podemos clasificar en dos grupos:

- Técnicas totales, donde la señal es proporcional a la cantidad absoluta de analito.

- Técnicas instrumentales o de concentración, donde la señal es proporcional a la concentración
del analito. Éstas las podemos clasificar en:
• MÉTODOS ÓPTICOS: Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de
aplicación, incluyéndose bajo su denominación todos aquellos que implican la medida
de la radiación electromagnética emitida por la materia o que interacciona con ella.
Podemos clasificar estos métodos en:
• ESPECTROSCÓPICOS: son aquellos en los que existe un intercambio de energía entre la
radiación electromagnética y la materia. En estos métodos miden transiciones entre
distintos niveles energéticos.
 Absorción: Niveles moleculares: UV- visible, IR, microondas. Niveles atómicos:
absorción atómica, rayos X.
 Emisión: Niveles moleculares: luminiscencia (fluorescencia, fosforescencia).
Niveles atómicos: espectrometría de emisión, fotometría de llama ICP,
fluorescencia de rayos X, fluorescencia atómica.
• NO ESPECTROSCÓPICOS: se caracterizan por no tener lugar el intercambio de energía
como consecuencia de la interacción materia-radiación electromagnética. No se
producen transiciones entre los diferentes estados energéticos, sino que lo que
realmente ocurre son cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación
electromagnética.

Los primeros pueden basarse en procesos de absorción y emisión, mientras que las transiciones
entre distintos niveles energéticos pueden tener lugar a nivel atómico o molecular. En los segundos,
los principales mecanismos de interacción implicados son la dispersión (turbidimetría,
nefelometría), difracción (rayos X, electrones), refracción (refractometría, interferometría), rotación
óptica (polarimetría, dicroísmo circular).

• MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS: Los métodos electroquímicos o electroanalíticos son

menos utilizados que los espectroscópicos o los cromatográficos, aunque ofrecen
ciertas ventajas como: mayor especificidad para un determinado estado de oxidación,
información sobre la actividad de una especien química y son relativamente baratos.

5
 • MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: como se detallará más adelante se busca la separación
de los componentes de una muestra en dos fases: una estacionaria y otra móvil.

1.3 Sensibilidad y límites de detección.

La sensibilidad de un método analítico, S, se define como la pendiente, m, de la curva de calibración,

ya que ésta define la razón de cambio de la propiedad medida por unidad de concentración.

Para los métodos espectrofotométricos, 𝑆 = 𝑚𝑐𝑎𝑙 = 𝐷 𝐴/ 𝐷 𝐶 de la curva de calibración

Absorbancia vs. Concentración.

Límite de detección (LOD, del inglés Limit of detection) es la menor cantidad de un analito cuya
señal puede ser distinguida de la del ruido. El límite de detección (LDD) se define habitualmente
como la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por
un método analítico determinado. Intuitivamente, el LDD sería la concentración mínima obtenida a
partir de la medida de una muestra (que contiene el analito) que seríamos capaces de discriminar
de la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito
presente.

Límites de confianza.

La media de la población o media verdadera (m) de una medición es una constante que es siempre
desconocida. Sin embargo, en ausencia de errores sistemáticos, pueden estimarse ciertos límites
dentro de los cuales cabe esperar que caiga la media de la población con una cierta probabilidad.
Los límites así obtenidos se llaman límites de confianza de la media muestral. Los límites de
confianza derivan de la desviación estándar de la muestra, s y dependen de la certidumbre con que
se la conozca. Si ésta desviación estándar se obtiene a partir de una buena cantidad de réplicas, será
una buena aproximación de la desviación estándar de la población, s, y entonces los límites de
confianza serán mas estrechos que si la estimación de s se basa en sólo dos o tres mediciones.

El límite de detección mínimo (LD) ó la concentración mínima detectable

Es un parámetro estadístico que ha sido muy controvertido. Diferentes autores han dado diversas
definiciones y metodologías para su determinación experimental. Actualmente, algunos autores lo
definen como la cantidad o concentración mas pequeña del analito que produce una señal
XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb.

El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con
certeza (significativamente diferente o estadísticamente diferente) del ruido de fondo es que
la diferencia entre la señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual
a tres veces la desviación estandar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo.
Es decir que: en donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de
analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las lecturas del
blanco.

Experimentalmente, el límite de detección se determina involucrando todos los factores que

afectan la medida y se define, en general, para obtenerlo en unidades de concentración como:

𝐿𝐷 = 3𝑠𝑏 / 𝑚𝑐𝑎𝑙 bajas concentraciones

6
Donde, sb = desviación estandar de los blancos, mcal es la pendiente de una curva de calibración del
sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por IUPAC. Aplicado
a los métodos espectrofotómétricos, entonces, sb = desviación estándar de los blancos en
absorbancia y mcal pendiente de la curva de calibración (A vs C) en unidades de
Absorbancia/Concentración, por lo tanto, al calcular la relación el límite de detección se obtiene en
unidades de concentración.

El límite de detección máximo:

Se define como la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Generalmente, lo

que ocurre, es que las soluciones se hacen tan concentradas, que, en el caso de los métodos
espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación equivalente al
ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de
concentraciones altas. La determinación queda limitada a concentraciones menores del valor de
límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el
problema se soluciona facilmente mediante una dilución adecuado. En el caso del límite de
detección mínimo, las soluciones son concentrar la muestra o usar otra técnica con límite de
detección menor. El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva
de Ringbom, como se verá más adelante.

Límite de cuantificación

Corresponde a la cantidad o concentración del analito a partir de la cual es confiable realizar

determinaciones cuantitativas y se define como:

𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐿𝑄 = 10𝑠 𝑏 / 𝑚𝑐𝑎𝑙 𝑏𝑎𝑗𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠

1.4 Relación señal-ruido

La relación señal/ruido se define como la proporción existente entre la potencia de la señal que se
transmite y la potencia del ruido que la corrompe. Este margen es medido en decibelios.

Rango dinámico y relación señal/ruido para referirse a este margen que hay entre el ruido de fondo
y nivel de referencia, pueden utilizarse como sinónimos. No ocurre lo mismo, cuando el rango
dinámico indica la distancia entre el nivel de pico y el ruido de fondo. Que, en las especificaciones
técnicas de un equipo, aparezca la relación señal/ruido indicada en dB, no significa nada si no va
acompañado por los puntos de referencia utilizado y las ponderaciones.

Para indicar correctamente el margen dinámico, la medida en dB debe ir acompañada por:

 la curva de ponderación.
 el nivel de referencia.

Por ejemplo, en el caso de un magnetófono en unas especificaciones técnicas encontraríamos:

60 dB, CIR 468-3 (ref. 1 kHz, 320 nWb/m-1).

 CIR 468-3 es la curva de ponderación

 1 kHz es el nivel de referencia
 320 nWb/m-1 es el nivel magnético en que se ha grabado el nivel de referencia.

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Evidentemente, para poder comparar equipos en lo que se refiere a su respuesta en frecuencia, los
equipos deben haber medido esta relación señal/ruido utilizando la misma curva de ponderación y
nivel de referencia.

Factor de ruido

La magnitud del ruido generado por un dispositivo electrónico, por ejemplo un amplificador, se
puede expresar mediante el denominado factor de ruido (F), que es el resultado de dividir la relación
señal/ruido en la entrada (S/R)ent por la relación señal/ruido en la salida (S/R)sal, cuando los
valores de señal y ruido se expresan en números simples :

Sin embargo, como los valores de la relación señal/ruido suelen expresarse en forma logarítmica,
normalmente en decibelios, el factor de ruido en decibelios será, por tanto, la diferencia entre las
relaciones S/R en la entrada y en la salida del elemento bajo prueba ya que:

En lugar de , también es común efectuar la medida del factor de ruido en decibelios A (

)ponderados en función de la (curva A)

El factor de ruido es un parámetro importante en los sistemas de transmisión, ya que mientras el

ruido externo nunca se podrá eliminar totalmente, la reducción del ruido generado por los equipos
depende del cuidado de su diseño. La expresión figura de ruido es una traducción errónea del
término inglés Noise.

La relación señal/ruido cuantifica la bondad de un instrumento para realizar un análisis componental

empleando el mismo. Según la IUPAC se define el límite de detección como 3 veces la desviación
estándar de los blancos (el ruido producido por el instrumento) entre la pendiente de la recta de
calibrado del instrumento. El motivo de esta definición es sencillo: debido a que sólo se puede
detectar aquel componente que produzca una señal superior a 3 veces la señal producida por el
instrumento sin componente, el químico se asegura de que la señal estudiada es debido a la
muestra. Sin embargo, esto impide determinar componentes cuya concentración genere señal de
menor intensidad, esto se conoce como pérdida de sensibilidad.

1.5 Calibración de los métodos instrumentales.

Una calibración (estandarización) adecuada de los instrumentos es esencial para obtener análisis
exactos, la elección de una técnica de calibración depende del método instrumental, de la respuesta
del instrumento, de las interferencias presentes en la matriz de la muestra y del numero de muestras
por analizar, 3 de las técnicas de calibración más comúnmente utilizadas son la curva analítica o
grafica de trabajo, el método de adiciones estándares y el método de estándar interno.

8
Calibración por curva-Calibración por grafica analítica.

En la técnica de la curva analítica 8 o de trabajo) se preparan varias soluciones estándares que

contienen concentraciones conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de
concentraciones de interés, así como tener una composición matricial, tan parecida como se pueda
a la de las soluciones de la muestra, también se analiza una solución de fondo (blanco de reactivos),
que contiene solo la matriz del disolvente y las lecturas netas se graficaran contra las
concentraciones de las soluciones estándares, a fin de obtener la gráfica de calibración de trabajo,
si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse equipo electrónico o
programas computacionales para compensar la curvatura y producir una salida que sea una función
lineal de la concentración, en regiones no lineales el numero de soluciones estándares analizadas
debe aumentarse para obtener la exactitud del análisis de las muestras problema.

En algunos análisis también puede alcanzarse la linealidad variando parámetros instrumentales, en

el análisis espectrofotométrico, cambiar la longitud de onda utilizada para obtener las lecturas de
absorción puede producir una gráfica de trabajo más lineal, es de mayor importancia registrar todos
los parámetros instrumentales empleados para obtener los datos de la curva de calibración, porque
incluso pequeñas variaciones en estos parámetros pueden afectar la pendiente de la grafica, la curva
de calibración debe ser revisada periódicamente, haciendo uso de soluciones de concentración
conocida, para detectar cualquier cambio en la respuesta instrumental.

Calibración por el método de adiciones estándares:

Cuando es imposible suprimir interferencias físicas o químicas en la matriz de la muestra puede

usarse el método de adiciones estándares, la respuesta del instrumento debe ser función lineal de
la concentración del analito, en el intervalo de concentraciones y también debe tener una ordenada
al origen en cero (señal cero para concentración cero), una pequeña cantidad de solución del analito
de concentración conocida se añade a una alícuota de una solución de muestra analizada
previamente y el análisis se repite usando reactivos, parámetros del instrumento y procedimientos
idénticos.

Las lecturas pueden ser corregidas para cualquier señal de fondo, siempre es aconsejable revisar el
resultado con al menos otra adición estándar, las adiciones estadísticamente optimas de analito son
iguales al doble o la mitad de la cantidad del analito en la muestra original, todas las soluciones
deben ser diluidas al mismo volumen final para que cualquier interferente en la matriz de la muestra
tenga un efecto idéntico en cada solución, debe dejarse transcurrir suficiente tiempo entre la
adición del estándar y el análisis final para que el estándar agregado alcance el equilibrio con los
interferentes de la matriz.

El método de adiciones estándares es ampliamente utilizado en la química electro analítica para

obtener resultados mas exactos que los que resultan usando curvas de calibración, como las
soluciones problema y estándar se miden en idénticas condiciones, las técnicas voltamperimetricas
sensibles a la matriz (como la redisolución anódica) dependen casi exclusivamente de las adiciones
estándares para resultados cuantitativos, la absorción atómica y la espectrofotometría de emisión
de flama, usan este método con matrices de muestras complejas, en donde la viscosidad, la tensión
superficial, los efectos de flama y otras propiedades de la solución muestra no pueden reproducirse
con exactitud en las soluciones de calibración, los resultados de las adiciones estándares también

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proporcionan un medio sistematico de identificar fuentes de error en los análisis, tales como la
depleción o degradación de los reactivos de prueba, un instrumento defectuoso o soluciones
estándares inexactas.

Calibración por el Método del Estándar Interno: Se emplea un estándar interno para minimizar las
diferencias en las propiedades físicas de un conjunto de soluciones muestra que contiene el mismo
analito, este método, una cantidad fija de una sustancia pura se añade tanto a las soluciones
muestra como a las soluciones estándares, se determinan luego las respuestas del analito y del
estándar interno, cada una corregida por el fondo y se calcula el cociente de las dos respuestas, si
se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la respuesta de la línea del
estándar interno será constante, por supuesto que la concentración del estándar interno no es fija,
sin embargo, si varia uno o mas de los parámetros que afectan las respuestas medidas, dichas
respuestas del analito y del estándar interno deben ser afectada por igual, por lo tanto el cociente
de respuestas ( del analito al estándar interno) depende solamente de la concentración del analito.

1.6. Curvas de calibración

Una curva de calibración es una función de transferencia que relaciona la entrada con la salida. Es
empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una
serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio
lineal entre un carácter medible (por ejemplo, la absorbancia en los enfoques de
espectrofotometría) y la variable a determinar (concentración). Para ello, se efectúan diluciones de
unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de
una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra
problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la
concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y,
empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta
encontrar la concentración del analito. Las curvas de calibración suelen poseer al menos una fase
de respuesta lineal sobre la que se realiza un test estadístico de regresión para evaluar su fiabilidad.

1.6.1 Método de estándar externo

Este método de análisis se aplica en la determinación de un analito, en el cual los componentes de

la matriz de la muestra como también los reactivos usados en la preparación de la misma no
interfieren en el análisis, es decir no se tiene un efecto de la matriz en la señal medida.

También se puede emplear en condiciones tales que la contribución de los interferentes, sobre las
medidas se mantiene constante, con lo cual se puede realizar la oportuna corrección del error
determinado por el interferente.

El estándar de calibrado seleccionado deben aproximarse tanto en la concentración del analito

como en su composición de los diferentes componentes químicos, presentes en la matriz de la
muestra. Este requerimiento es aplicado en todos los métodos de calibración propuestos.

𝑆𝑒ñ𝑎𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 (𝑦) = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑥 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟𝑒𝑠 + 𝑆𝑒ñ𝑎𝑙𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜

10
1.6.2 Método de estándar interno

La calibración con estándar ó patrón interno se utiliza para compensar errores aleatorios y
sistemáticos como interferencias no espectrales de componentes de la matriz, fluctuaciones
debidas del método y errores instrumentales. Entre estas se tiene; variación de la velocidad de
nebulización, del tamaño de gota, fluctuaciones de las presiones gaseosas, de la viscosidad y tensión
superficial. Se aplica este método en técnicas instrumentales que permitan la determinación
multielemental.

Se selecciona como estándar interno, una sustancia diferente del analito que presente propiedades
similares a las del analito, tal que ambos sean afectados similarmente durante el análisis. También
puede seleccionarse un componente mayoritario que este presente en la muestra, y el cual se
adiciona a los patrones a elevada concentración para considerarse constante. La matriz debe estar
libre de estándar interno. El paso más importante en este método, es la selección adecuada del
estándar interno.

Considerando que se determina la intensidad de emisión de una analito (IA) y un patrón interno (IP)
a concentraciones determinadas (CA y CP) y conocidos los valores de energía necesaria para que
transcurra la transición electrónica respectiva ( EA y EP) al medir la relación de intensidades IA/IP;
sí se cumple que ΔEP≈ΔEA el segundo término de la Ec. 18 tiende a uno y la relación de intensidades
es independiente de la temperatura.

𝛼 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑝𝑜𝑟𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑.
La aplicación de este método consiste en realizar medidas simultáneas de la respuesta del
instrumento al analito y al estándar interno. El estándar interno, se añade en una cantidad conocida
y constante a la muestra, y a los estándares del analito. En la gráfica de calibrado se representa la
relación Señal analito/Señal de estándar interno en función de la concentración del analito en los
estándares. De esta manera la respuesta del instrumento o la señal analítica es independiente, de
la fluctuación debida al método de análisis. Para la muestra la relación entre la señal (SeñalM) y la
concentración (CM) viene dada por:

Similarmente, para el estándar interno se tiene:

Dividiendo

11
Donde, f corresponde al factor de respuesta f=kM/kEI este debe ser constante en un determinado
intervalo de concentración. Además, f también viene dado por el producto de la pendiente de la
curva de calibrado por la concentración del patrón interno, cuando se gráfica la relación de las
señales versus la concentración del estándar. Mientras que si se gráfica la relación de las señales
versus la relación de las concentraciones, la pendiente es directamente el factor de respuesta. Re-
escribiendo la Ec. 21 en términos de los estándares del analito (CS, SeñalS), se tiene la expresión que
describe la curva de calibrado, dada por:

Unidad II. Métodos espectrofotométricos

2.1 Propiedades de la Radiación electromagnética.

“Campo” es un término físico para una región que está bajo la influencia de cierta fuerza que puede
actuar en la materia dentro de esa región. Por ejemplo, el Sol produce un campo gravitacional que
atrae los planetas en el sistema solar y por tanto influye sus órbitas.

Las cargas eléctricas estacionarias producen campos eléctricos, mientras que las cargas eléctricas
en movimiento producen tanto campos eléctricos como magnéticos. Los cambios repetidos y
regulares en estos campos producen lo que llamamos radiación electromagnética. La radiación
electromagnética transporta energía de un punto a otro. Esta radiación se propaga (mueve) a través
del espacio a 299,792 km por segundo (alrededor de 186.000 millas por segundo). Esto significa,
que viaja a la velocidad de la luz. Efectivamente, la luz es una de las formas de la radiación
electromagnética.

Otras formas de la radiación electromagnética son los rayos X, microondas, radiación infraroja,
ondas de radio AM y FM y la radiación ultravioleta. Las propiedades de la radiación electromagnética
dependen fuertemente de su frecuencia. Las frecuencias de la radiación electromagnética son dadas
en Hertz (Hz), llamadas así por Heinrich Hertz (1857-1894), la primera persona en generar ondas de
radio. Un Hertz es un ciclo por segundo.

Frecuencia y Longitud de Onda

Tal como la radiación se propaga en una frecuencia dada, tiene una longitud de onda asociada – eso
es, la distancia entre sucesivas crestas o sucesivos valles. Las longitudes de onda son generalmente
dados en metros (o alguna fracción decimal de un metro) o Angstroms (Å, 10-10 metros).

En vista que todas las radiaciones electromagnéticas viajan a la misma velocidad (en el vacío), el
número de crestas (o valles) pasando por un punto dado en el espacio, en una unidad dada de
tiempo (digamos, un segundo), varía con la longitud de onda. Por ejemplo, 10 ondas de una longitud
de 10 metros pasarán por un punto en la misma longitud de tiempo que le tomaría 1 onda de un
largo de 100 metros. En vista que todas las formas de energía electromagnética viajan a la velocidad
de la luz, la longitud de onda equivale la velocidad de la luz dividida por la frecuencia de oscilación
(moviéndose de cresta a cresta o valle a valle).

En el dibujo inferior, las ondas electromagnéticas están pasando el punto B, moviéndose a la

derecha a la velocidad de la luz (comúnmente representada por C, y dado en km/seg) Si medimos a

12
la izquierda de B una distancia D igual a la distancia a la que viaja la luz en un segundo (2.997 X 10 5
hm), llegamos al punto A a lo largo del tren de ondas, que simplemente pasará el punto B luego de
un periodo de 1 segundo (moviéndose de izquierda a derecha). La frecuencia f del tren de onda (eso
es, el número de ondas entre A y B) por el largo de cada λ, equivale la distancia D recorrida en un
segundo.

En vista que hablamos de frecuencia y radiación electromagnética en términos de oscilaciones por

segundo y la velocidad de la luz en términos de distancia recorrida por segundo, podemos decir que:

13
2.1.1 Espectro electromagnético

Las ondas electromagnéticas se diferencian en su frecuencia y su longitud de onda. El conjunto de

todas las ondas constituye el espectro electromagnético. El espectro electromagnético se divide en
partes que reciben nombres diferentes, aunque no existe una separación clara entre ellas.

Tipos de ondas electromagnéticas

Rayos gamma

Su longitud de onda (λ) < 0.1Å, donde 1Å es igual a 10-10 m. Se originan en las desintegraciones
nucleares que emiten radiación gamma. Son muy penetrantes y muy energéticos.

Rayos X

Se producen por oscilaciones de los electrones próximos a los núcleos. Son muy energéticos y
penetrantes, dañinos para los organismos vivos, pero se utilizan de forma controlada para los
diagnósticos médicos.

0.1Å < λ < 30 Å

Rayos UVA (Ultravioletas)

Se producen por saltos electrónicos entre átomos y moléculas excitados. El Sol es emisor de rayos
ultravioleta, que son los responsables del bronceado de la piel. La radiación ultravioleta es absorbida
por la capa de ozono, y, si se recibe en dosis muy grandes, puede ser peligrosa ya que impide la
división celular, destruye microorganismos y produce quemaduras y pigmentación de la piel.

30Å < λ < 4000 Å

Luz visible

Es la pequeña parte del espectro electromagnético a la que es sensible el ojo humano.

14
400 nm < λ < 750 nm

Se producen por saltos electrónicos entre niveles atómicos y moleculares. Los cables de fibra óptica
permiten utilizar la luz visible para transmitir grandes volúmenes de información a grandes
distancias, sobre todo con el uso del láser (luz monocromática y coherente).

Radiación infrarroja

Es emitida por cuerpos calientes y son debidas a vibraciones de los átomos.

10-7 m < λ < 10-3 m

La fotografía infrarroja tiene grandes aplicaciones: en medicina (termografías), en la industria textil

se utiliza para identificar colorantes, en la detección de falsificaciones de obras de arte, en
telemandos, estudios de aislantes térmicos, cocina vitrocerámica halógena, etc.

El satélite meteorológico Meteosat realiza de noche fotografías infrarrojas.

Radiación de microondas

Son producidas por vibraciones de moléculas.

0.1 mm < λ < 1 m

Se utilizan en el radar, en radioastronomía, banda UHF de televisión, enlaces de telefonía móvil y en

hornos eléctricos.

Ondas de radio

Son ondas electromagnéticas producidas por el hombre mediante dispositivos electrónicos, sobre
todo circuitos oscilantes, y se detectan mediante antenas.

1 cm < λ < 1 km

Se emplean en radiodifusión (sistemas de radio y televisión).

2.1.2 Absorción de radiación

Una descripción simplificada de la estructura de la materia permite explicar los enlaces entre los
átomos para formar moléculas en términos de la localización de ciertas partículas subatómicas, los
electrones, entre esos átomos. Esas “partículas” evidencian sus características ondulatorias ya que
interactúan con la radiación electromagnética. La molécula en su forma estable bajo las condiciones
ambientales corrientes se encuentra en un determinado nivel energético. Si se logra hacer incidir
sobre esa molécula un fotón de radiación electromagnética con la energía apropiada, la molécula
incrementa su contenido energético absorbiendo ese fotón. Se dice entonces que la molécula pasó
a un estado excitado.

La molécula energizada se encuentra en un estado que no es estable en las condiciones ambientales

corrientes; por lo tanto, tiende a regresar a la condición estable y para lograrlo emite un fotón con
la energía que logró excitarla antes; por lo tanto, cuando un elemento irradia energía no lo hace en
todas las longitudes de onda. Solamente en aquellas de las que está “provisto”. Esas longitudes de
onda sirven para caracterizar, a cada elemento. También ocurre que cuando un elemento recibe

15
energía no absorbe todas las longitudes de onda, sino solo aquellas de las que es capaz de
“proveerse”. Coinciden, por tanto, las bandas del espectro en las que emite radiación con los huecos
o líneas negras del espectro de absorción de la radiación, como si un espectro fuera el negativo del
otro.

2.1.3 Ley de Beer

Bourguer, Lambert y Beer, a través de sus observaciones establecieron relaciones de la variación

de la intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentración de
la sustancia, para materiales translúcidos. Estas relaciones se conocen como la ley de Bourguer-
Lambert-Beer o ley general de la espectrofotometría que permite hallar la concentración de una
especie química a partir de la medida de la intensidad de luz absorbida por la muestra.

Esta ley se puede expresar en términos de potencia de luz o de intensidad de luz, asumiendo luz
monocromática, como:

𝐼𝑡 / 𝐼0 = 10 − 𝑒 𝑏𝑐
Donde: It, es la intensidad de la luz transmitida por la muestra.

 I0, es la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y que proviene de la fuente.
 e, es el coeficiente de absortividad molar en unidades de M-3. cm-1
 b, es la longitud de la trayectoria del haz de luz a través de la muestra o el espesor de la
celda en cm o lo que se conoce como paso óptico.

La relación It / I0 se conoce como transmitancia, T, y es la medida primaria que se realiza en los

instrumentos para medir la absorción de luz por parte de una muestra. Si la relación se expresa en
forma porcentual, entonces se llama porcentaje de transmitancia:

% 𝑇 = 100. 𝐼𝑡 / 𝐼0
La luz absorbida sería I0 − It, es decir, la diferencia entre la intensidad de la luz incidente y la intensidad
transmitida después de pasar a través de la muestra. A veces se expresa en forma porcentual, en
función de la transmitancia medida como:

Porcentaje de absorción = (Tblanco – Tmuestra) x 100 o absorbancia.

Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relación It / I0, entonces:

−𝑙𝑜𝑔 𝐼𝑡 / 𝐼0 = − 𝑙𝑜𝑔 𝑇 ó 𝑙𝑜𝑔 𝐼0 /𝐼𝑡 = 𝑙𝑜𝑔𝐼0 − 𝑙𝑜𝑔𝐼𝑡

La relación que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra es

16
-log It / I0 = - log T, y recibe el nombre de Absorbancia, y se designa con la letra A.

La ley de Bourguer-Lambert-Beer se puede entonces escribir de las siguientes formas:

 It / I0 = 10 -e bc
 -log T = e . b . c
 -log T = A = e . b . c

Donde: C, es la concentración del soluto en moles / litro de solución. e, es una constante

denominada coeficiente de absortividad molar cuyas unidades son: cm -1 litro / mol.

b, es la longitud de la trayectoria en cm.

Se llega, entonces, a que la absorbancia es adimensional.

El coeficiente de absortividad molar “e” es función de la longitud de onda, del índice de refracción
de la solución y es característico de cada sistema soluto-solvente. Es una propiedad intensiva, que
no depende de la concentración de la sustancia y representa la absorción de luz por parte de un mol
de soluto para una longitud de onda dada.

Si no se conoce el peso molecular de la sustancia la ley de Beer se puede expresar como:

𝐴 = 𝑎 .𝑏 .𝑐
Donde “a” se denomina coeficiente de absortividad y sus unidades dependen de las unidades de
concentración utilizadas, que pueden estar en g/L o g/100mL.

El registro de la variación del coeficiente de absortividad molar e, o de la absorbancia A, o de la

transmitancia T, en función de la longitud de onda da origen a lo que se denomina "espectro" o
curva espectral de una sustancia química e indica las características de absorción de dicha sustancia
con relación a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como
Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de absorción, o en función de
la transmitancia, denominándose el espectro, espectro de transmisión.

De igual forma cuando se registra la emisión de radiación en función de la longitud de onda, los
espectros se denominan como espectros de emisión, o espectros de fluorescencia.

2.2 Espectroscopia de absorción en el visible y en el UV.

• La absorción que se lleva a cabo tanto en la región visible como ultravioleta del espectro,
depende de las transiciones electrónicas de la molécula, la cual al absorber energía del
fotón, pasa a un estado excitado; este cambio se suele representar por:

𝑀 + ℎѵ 𝑀 ∗ .
• Es conveniente considerar en espectroscopia UV-visible que la frecuencia de un haz de
radiación que incide en una sustancia permanece invariable y que dicha ѵ está determinada
por la fuente emisora, por el contrario tanto la velocidad de radiación y la longitud de onda
dependen de la condición del medio que atraviesa, un ejemplo de esto es que la velocidad
de propagación de la radiación en el vacío o en el aire difieren muy poco y llega a alcanzar
su valor máximo que es de 3 x 108 m/s siendo λ independiente.

17
 • Sin embargo, en cualquier otro medio material, la velocidad de la radiación disminuye a
causa de la interacción de la radiación con la materia; en el caso de λ está decrece
igualmente; para el vidrio que es el material más utilizado como recipiente de una muestra
en espectroscopia, la λ se acorta en casi 200 nm o más.

2.2.1 Fundamento de la absorción de radiación visible por una muestra.

• Cuando un haz de radiación incide sobre una sustancia transparente parte de esta energía
es absorbida y el resto transmitida. Si la energía incidente tiene λ de la región visible que
comprende de los 380- 700 nm y el medio a través del cual tiene que pasar, absorbe
selectivamente ciertas longitudes de onda, el color observado corresponderá a las λ de la
energía transmitida.

• Esto es, si una sustancia absorbe luz visible esta tendrá color, el cual no es correspondiente
a la luz que absorbe, existiendo una relación inversa entre el color absorbido y el color
observado. En la tabla No. 2.3 se muestra esta relación:

Color absorbido Longitud de onda Color observado

Violeta 560-580 Amarillo verdoso
Verde-azulado 595-610 Naranja
Azul-verdoso 610-750 Rojo
Amarillo 400-435 Violeta
Rojo-naranja 490-500 Azul verdoso
Rojo o púrpura 500-560 Verde-azul

• El color de la luz absorbida es complementario del color de la propia solución por ejemplo;
una disolución que contiene proteínas presenta el color violeta al utilizar el reactivo de
Biuret para su identificación, aparece de ese color porque transmite el color violeta del
espectro pero absorbe el color amarillo; por lo que se debe utilizar en el caso de un
fotómetro un filtro color amarillo y en el caso de utilizar un espectrofotómetro se debe
hacer considerar una λ que vaya de los 400-435 nm para llevar a cabo el análisis de proteínas
colorimétricamente.

2.2.2 Características generales de los instrumentos utilizados para espectroscopia de

absorción en el visible en el laboratorio.

• En la actualidad se cuenta con equipos muy completos para poder llevar a cabo técnicas
espectroscópicas basadas en los fenómenos de emisión, absorción, fluorescencia o
dispersión de la luz con altos límites de confianza.

• Las compañías como Bausch and Lomb, Varian, Perkin Elmer y Hewlett Packard se han
dedicado por años al diseño, construcción y operación de estos equipos cuyas
características de los instrumentos usados en la espectrofotometría e absorción de la región
visible, así como los diferentes tipos se mencionan a continuación:

18
• Fuente de radiación. Las mediciones por encima de los 350 nm, se suelen llevar a cabo con
lámparas de filamento incandescente, por lo general de tugsteno que suministra suficiente
energía radiante en la región de λ donde se va a medir la absorción, además de mantener
de forma constante una intensidad de luz durante todo el tiempo que transcurra durante el
análisis.

• Estas lámparas son económicas con excelente estabilidad; una lámpara especial es la de
tugsteno-halógeno que es suficientemente brillante para los trabajos en la región visible-
UV.

• Monocromadores. Son dispositivos que permiten utilizar cierta región de λ, su función

principal consiste en proporcionar una energía radiante con valores muy estrechos de λ con
una banda espectral reducida por lo que facilitan seleccionar la λ con la que se va a trabajar
como se muestra en la figura No. 2.5.

• Los monocromadores como el de Ebert o de Littrow cuentan con una rendija de entrada
que proporciona una imagen óptima del haz de luz proveniente de la lámpara, un espejo
cóncavo colimador que produce el paralelismo de la luz entre la rendija de entrada y de
salida con ayuda de un prisma reflejante o rejilla, produciendo como efecto una banda
espectral deseada.

• Celda o cubeta. Se trata de recipientes que van a contener la muestra por lo general líquida;
su función además de la anterior consiste en transmitir la energía radiante en la λ que nos
interesa; las celdas de vidrio son apropiadas para la región visible, las de cuarzo o con alto
contenido en sílice se usan en UV, mientras que las de algunas sales como el KCl son
empleadas en espectroscopia IR.

• Las celdas son dispositivos importantes de la instrumentación, algunas de ellas tienen 1 cm

de paso de luz, pero pueden presentar caminos ópticos de fracciones de milímetro o hasta
10 cm o aún más. Por ello la celda debe estar debidamente certificada y deben ser llenadas
de tal forma que el haz de luz pase a través de la solución. También es necesario asegurarse
de la posición de la misma en el compartimiento del instrumento al igual que su limpieza
para evitar interferencias.

19
 • Detector. Son detectores fotoeléctricos el más sencillo es un fototubo; estos tubos están
construidos al vacio, en su interior están conectados un par de electrodos como se muestra
en la figura No. 2.6, en los que se mantiene un potencial y que asoman a través de una
ventana que permite la entrada de la radiación transmitida. La superficie del electrodo
negativo es fotosensible; esto quiere decir que, cuando el electrodo se irradia con los
fotones provenientes de la luz, los electrones son expulsados a la superficie llegando a
través de un diferencial de potencial al electrodo positivo y estableciendo una corriente en
el circuito, la cual es medida como % de transmitancia o Absorbancia.

• Las características que se desean encontrar en un detector son: sensibilidad elevada en la

región espectral, respuesta lineal, tiempo de respuesta rápida, bajo nivel de ruido. Sin
embargo, estos factores se deben de evaluar en la práctica. (Day, 1989).

• Amplificación y lectura. Ya que el detector percibe el haz de radiación proveniente de la

muestra, cualquier cambio en la intensidad de radiación debido a la absorción, se detecta
como señal. Esta señal amplificada del detector se utiliza para situar a un atenuador óptico,
de modo que la radiación del haz de la muestra se conserve a la misma intensidad.

• La proporción de atenuación requerida constituye una lectura directa de la absorción por

parte de la muestra.

2.3 Espectroscopia de absorción en el infrarrojo.

La espectrometría del infrarrojo es sumamente útil para determinaciones cualitativas de

compuestos orgánicos y para deducir estructuras moleculares a partir de sus grupos funcionales
tanto de compuestos orgánicos como inorgánicos.

En el análisis cualitativo la espectroscopia de infrarrojo puede usarse para la identificación de

sustancias puras o para la absorción, localización e identificación de impurezas.

Para localizar una impureza en una sustancia se hace una comparación en el espectro de las
sustancias que se estudia y una muestra de la sustancia pura. Las impurezas causan bandas de
absorción adicionales que aparecen en el espectro.

20
En el IR también están encontrando uso cada vez mayor en el análisis cuantitativo, el principal
campo de aplicación de este tipo de análisis se halla en la cuantificación de contaminantes
atmosféricos que provienen de procesos industriales.

Una parte del espectro electromagnético que se extiende desde 0.8 a 1000 m (que corresponde al
número de onda comprendidos entre los 12800 y los 10 cm-1), se considera como la región del
infrarrojo la cual está dividida en tres regiones llamadas:

a) I.R. Cercano
b) I.R. Fundamental ó Medio
c) I.R. Lejano

Sin embargo, la región de importancia analítica es la región del I.R. Fundamental ya que la mayoría
de los instrumentos infrarrojos cubren ésta región.

La mayoría de los materiales orgánicos e inorgánicos demuestran absorción y el espectro es

originado principalmente por el alargamiento vibracional y flexión dentro de la molécula. El espectro
infrarrojo es una de las propiedades más características de un compuesto ya que no existen dos
espectros iguales para dos compuestos diferentes, es como una huella dactilar.

Dentro de la región del I.R. Fundamental existen dos regiones, una de ellas es la llamada de los
grupos funcionales de 4000cm-1 a 1300 cm-1, y la región dactilar de 1300 cm-1 a 670 cm-1 .

En la región de los grupos funcionales la posición del pico de absorción es mayor o menor
dependiendo solamente del grupo funcional donde llega la absorción y no de la estructura molecular
completa. La posición de los picos en la región dactilar son dependientes de la estructura molecular
completa.

Características que debe tener una vibración para que produzca banda de absorción:

La radiación incidente debe tener una frecuencia igual a la frecuencia de la vibración que va a
producir. Que la vibración resultante produzca cambio en el momento dipolar, o sea que la vibración
no absorberá radiación infrarroja, si no hay cambio en el momento dipolar se llama vibración
inactiva y serán activas cuando haya dicho cambio en el momento dipolar.

2.3.1 Fundamento de la absorción de radiación infrarroja

La absorción de la radiación IR se limita así en gran parte a especies moleculares para las cuales
existen pequeñas diferencias de energía entre los distintos estados vibracionales y rotacionales,
pero en el IR Fundamental solo existe vibración.

Se produce solo estos efectos, debido a que los fotones producidos en el IR poseen poca energía
como para producir transiciones eléctricas pero pueden provocar que los enlaces se estiren y doblen
es decir pueden causar vibración en las moléculas en las cuales los átomos cambian su posición
relativa, ésta es la base de la espectroscopia en el infrarrojo, que las posiciones relativas de los
átomos en una molécula no están exactamente fijas o rígidas sino que fluctúan continuamente
como consecuencia de multitud de diferentes tipos de vibración. Para una molécula simple
diatómica o triatómica es fácil definir el número y la naturaleza de tales vibraciones, y relacionarlas
con las energías de absorción. Sin embargo, con moléculas poliatómicas un análisis de esta clase se

21
hace difícil, no solo a causa del gran número de centros vibratorios, sino que también porque
ocurren interacciones entre varios centros que deben tomarse en consideración.

Pueden distinguirse dos tipos básicos de vibraciones:

a) De tensión: b) De flexión:
* Simétrico * Balanceo
* Asimétrico * Aleteo
* Tijereteo
* Torsión

Tipos de vibraciones moleculares. NOTA: (+) indica un movimiento del plano de la página hacia el
lector; (-) indica un movimiento del plano de la página alejándose del lector.

Los factores que determinan la energía de un fotón para que produzca vibración en una molécula
son:

a) La masa de los átomos.

b) La geometría de la molécula.
c) La rígidez de los enlaces químicos.
d) Los períodos de las vibraciones atómicas.

22
Esquema de un espectrofotómetro de doble haz. Las líneas gruesas y obscuras indican una conexión
mecánica; las líneas delgadas una conexión eléctrica; las líneas de trazos indican la trayectoria de la
radiación.

2.3.2 Características generales de los espectrofotómetros IR

Para las medidas de absorción en el infrarrojo existen tres tipos de instrumentos disponibles: (1)
espectrofotómetros dispersivos de red que se utilizan principalmente para el análisis cualitativo; (2)
instrumentos multiplex, que emplean la transformada de Fourier y (3) fotómetros no dispersivos.

Espectrofotómetros de transformada de Fourier

Cuando estos aparecieron en el mercado por primera vez eran voluminosos, caros y requerían
frecuentes ajustes mecánicos. Por este motivo, su uso se limito a aplicaciones especiales donde sus
características únicas (rapidez, alta resolución, sensibilidad, una sensibilidad y exactitud de la
longitud de ondas incomparables) eran esenciales. En la actualidad, estos instrumentos han
reducido du tamaño y se han convertido en equipos de fácil mantenimiento.

Componentes

Mecanismo de tracción

Para la obtención de interferogramas satisfactorios (y a la vez de espectros satisfactorios), es

necesario que la velocidad del espejo móvil sea constante y que su posición se conozca exactamente
en cualquier instante. También debe permanecer constante la verticalidad del espejo respecto a la
trayectoria del haz a lo largo de todo el recorrido de 10 cm o más. En la región del infrarrojo lejano,
se pueden conseguir desplazamientos del espejo de fracciones de longitud de onda y la medida
exacta de su posición mediante un anillo micrométrico accionado por un motor. Sin embargo, para
las regiones del infrarrojo cercano y medio se requieren mecanismo mas precisos y sofisticados.

Divisores de haz

23
Los divisores del haz están construidos con materiales transparentes con índices de refracción tales
que aproximadamente el 50 por 100 de la radiación se refleja, y el 50 por 100 se transmite. Un
material que se utiliza mucho en la regio del infrarrojo lejano, es una delgada película de Mylar que
se coloca entre dos placas de un solido se bajo índice de refracción. Para la región del infrarrojo
medio se obtienen buenos resultados con películas delgadas de silicio o germanio. Para trabajar en
el infrarrojo cercano se utiliza una película de oxido de hierro que se deposita sobre fluoruro de
cesio.

Fuentes y detectores

Por lo general, los detectores térmicos no se adaptan fácilmente a los instrumentos de transformada
de Fourier debido a su tiempo de respuesta lento. Los detectores piroelectricos de sulfato de
triglicina se utilizan ampliamente para la región del infrarrojo medio. Cuando se necesitan mejores
sensibilidades o tiempos de respuesta más rápidos se emplean los detectores de fotoconductores
de telururo de cadmio/mercurio.

Instrumentos dispersivos

Los espectrofotómetros de infrarrojo dispersivos que se encuentran en el comercio son por lo

general instrumentos de doble haz con registrador, que utilizan redes de reflexión para la dispersión
de la radiación.

Por lo general estos tipos de espectrofotómetros incorporan un cortador de baja frecuencia (de 5 a
13 ciclos por minuto) que permite al detector discriminar entre la señal de la fuente y las señales de
radiación extraña. En general, los diseños ópticos de los instrumentos dispersivos no difieren
demasiado de los espectrofotómetros UV/visible.

Instrumentos no dispersivos

Para el análisis cuantitativo en el infrarrojo se han diseñado algunos instrumentos sencillos y

robustos, entre de los cuales existen los fotómetros de filtro y fotómetros sin filtro.

24
Fotómetros de filtro

La figura siguiente muestra un esquema de un fotómetro de infrarrojo portátil (peso= 8 kg) diseñado
para el análisis cualitativo de distintas sustancias orgánicas en la atmosfera. La fuente es una varilla
de cerámica rodeada de un alambre de nicromo; el detector es un dispositivo piroelectrico. La
muestra gaseosa se introduce en la cubeta por medio de una bomba accionada por una batería. El
camino óptico de la cubeta es de 0,5 m, una serie de espejos reflectantes permiten aumentar la
longitud de la cubeta hasta 20 m en incrementos de 1,5 m.

2.3.3 Manejo de muestras para la generación de espectros de absorción IR

Muestras de gases

Se pueden obtener espectros de un líquido de bajo punto de ebullición o gas permitiendo que la
muestra se expanda en una celda especial y adecuada. Este tipo de celdas puede variar desde
centímetros hasta metros en la longitud de la trayectoria de la luz. Las mayores longitudes de
trayectoria se obtienen en celdas compactas proporcionando superficies reflectoras internas de
modo que el haz hace numerosas pasadas por la muestra antes de salir de la celda. Por lo general
las celdas son de 10 cm de longitud. Las celdas se vacían y se llena a través de una válvula de aguja.

Muestras liquidas

Al trabajar con soluciones diluidas en el infrarrojo ofrece ventajas como la reproductividad de los
datos, y además, eligiendo bien la concentración y la longitud de la celda puede hacerse clara y
evidente la forma y estructura de las bandas que aparecen en el espectro de absorción y que son de
mayor importancia. A pesar de estas ventajas es difícil y a veces imposible encontrar un líquido con
la capacidad de disolvente deseada que no sea absorbido fuertemente en la región espectral de
interés y además puede ser que haya alguna reacción entre muestra y disolvente por lo que es obvio
evitar esta técnica.

Entre los disolventes usados se encuentran: acetona, acetonitrilo, benceno, ciclohexano,

cloroformo, el disulfuro de carbono, el tetracloruro de carbono estos dos últimos son volátiles,
tóxicos y deben ser usados con precaución.

Cuando se necesario usar disolventes polares que afectarían la celda de sal por que la disuelve se
usan celdas de Irtran.

25
Los disolventes usados en el infrarrojo deben ser previamente desecados para evitar las bandas de
absorción del agua y prevenir el ataque a las ventanas de la celda.

Las celdas infrarrojas suelen ser de 0.015 a 1 mm y son un poco más estrechas que las usadas en la
región del UV -Visible. La trayectoria de la luz en esta gama normalmente requiere concentraciones
de muestras de 0.1 a 10%. Generalmente las celdas son desmontables con espaciadores para
permitir variación en la longitud de la trayectoria. Celdas de longitud fija de trayectoria son llenadas
o vaciadas con una jeringa hipodérmica.

Generalmente las celdas son de cloruro de sodio; estas finalmente se velan debido a la absorción
de humedad (Guardarlas en el desecador).

Cuando la cantidad de muestra es pequeña o cuando se dispone del disolvente apropiado es común
correr el espectro de líquido puro, la manera de llevar a cabo el experimento es comprimir una gota
de liquido puro entre dos placas de sal de roca de 0.015 mm o menos de espesor. Las dos placas
unidas por capilaridad se montan en la trayectoria de la luz, este proceso no da datos de
transmitancia muy reproducibles, pero es satisfactoria para investigaciones cualitativas.

Los líquidos puros o volátiles los podemos trabajar en las celdas desmontables.

Vista extendida de una celda desmontable de infrarrojo para muestras líquidas. Se dispone de
espaciadores de teflón con grosores de 0.015 a 1 mm.

Muestras solidas

Cuando los sólidos no pueden disolverse en disolventes trasparentes en el IR pueden ser

suspendidos en un medio trasparente apropiado formando una mezcla de dos fases. Una
característica importante es que el tamaño de partícula del sólido suspendido debe ser menor que
la longitud de onda de la radiación ya que si no se cumple esta condición se pierde parte de la
radiación por dispersión. Las técnicas comunes son dos:

Técnica del Amasado. Consiste en triturar finamente de 2 a 5 mgrs. de la muestra en estudio

(tamaño de partícula menor de 2 ), colocar en un portaobjetos una cantidad mínima de estos
cristales y agregar de 1 o 2 gotas de aceite pesado de hidrocarburo (Nujol). Si interfieren las bandas
de hidrocarburos, puede usarse fluoroluble o perfluorkerosena, y con la esquina del portaobjetos o

26
con una espátula hacemos una “masa”. Se toma una gota de la muestra y se pone en la ventana de
NaCl.

Lo que hace el aceite es bloquear la refracción de los cristales de la muestra.

Técnica de Pastillaje. Un miligramo de la muestra finamente triturada se mezcla íntimamente con

100 mgr. de polvo de KBr desecado. La mezcla puede hacerse en un mortero de ágata. Después se
vierte con una espátula y con mucho cuidado la cantidad suficiente de muestra para cubrir la matriz,
para uniformar la superficie cubierta se le pueden dar golpecitos. Después se cubre con el émbolo
y se le lleva a una prensa hidráulica a 240 Kgr/cm2 para obtener un disco trasparente, al llegar a esa
presión se deja unos 2 minutos y se descomprime lentamente para evitar la ruptura de la pastilla.
Se saca la matriz de la prensa y se desliza delicadamente el émbolo, para separar la pastilla y pasarla
cuidadosamente al portamuestras. Se obtienen mejores resultados si se forma el disco en el vacío
para eliminar el aire ocluído, para eso es la boquilla.

Después el portamuestras que contiene la pastilla se coloca en el paso del haz del instrumento
colocando el atenuador al 80% de transmitancia se corre el espectrograma y se obtiene el espectro
de absorción.

Film. Se recorta una cartulina de 4.9 cm de ancho por 7.6 cm de largo. A 2 cm de uno de los extremos
se dibuja una ranura exactamente centrada de 0.9 cm de ancho por 2 cm de largo y se recorta. Sobre
esta base se monta el polímero: poliestireno, celofán, etc.

Se pone frente al haz del aparato colocando el atenuador de tal manera que el graficador quede al
80% de transmitancia y se corre el espectrograma.

2.3.4 Interpretación de espectros de absorción IR de compuestos sencillos

Para la interpretación de espectros de absorción con IR de compuestos sencillos se puede decir que:

Cuanto mayor son los enlaces químicos, mayor son las frecuencias observadas

Las masas atómicas menores tienden a originar frecuencias observadas con menor
intensidad.

Sin embargo, los datos de estructura y composición obtenidos exclusivamente del análisis de un
espectro de absorción rara vez proporcionan material suficiente para una identificación absoluta de
un compuesto desconocido. Es por ello, la identificación de espectros se ha hecho más factible
debido a los adelantos tecnológicos, tales como la aplicación de computadoras a problemas
químicos.

En general, para una identificación se combinan los datos de absorción en el infrarrojo con los que
proporcionan otros métodos, por ejemplo, los que se obtienen del análisis elemental, de la
resonancia magnética nuclear, de la absorción en el ultravioleta y de la espectroscopia de masas. En
algunos casos los datos pueden concordar para más de una estructura posible para el compuesto
desconocido.

27
Interpretación de Espectros

Mirar el espectro en su conjunto para ver de que tipo de muestra se trata.

Observar las diferentes regiones del espectro para identificar los diferentes grupos
funcionales (química orgánica).

Ejemplo:

Interpretación del espectro de infrarrojo del aire.

Entre los componentes mayoritarios de la atmosfera terrestre, los gases de N2 y O2 no producen

absorción de radiación infrarroja, ya que son moléculas diatómicas apolares.

En cambio, el vapor de agua y el dióxido de carbono absorben radiación infrarroja y por tanto serán
observados siempre que se realicen medidas de absorción de infrarrojo en presencia de aire, y
deben corregirse (espectro de referencia) a la hora de estudiar una muestra problema.

La molécula de agua tiene una estructura no lineal y por tanto presenta tres modos vibracionales:
una tensión simétrica (v1), una flexión simétrica (v2) y una tensión asimétrica (v3). Generalmente
se requiere menos energía para deformar un ángulo entre tres átomos que para estirar un enlace,
por lo que la banda v2 debe aparecer a menores frecuencias que v1 y v3. Las vibraciones v1 y v3
cambian el modulo del momento dipolar (vibraciones paralelas) mientras que la vibración v2 cambia
la orientación de dicho momento (vibración perpendicular).

Como consecuencia, estas tres vibraciones deben dar lugar a bandas vibracionales activas en
infrarrojo. La molécula de CO2 presenta una estructura lineal y por tanto sus grados de libertad
vibracionales son cuatro. Dado que el momento dipolar permanente de la molécula es nulo, la
vibración de tensión simétrica no será activa en el espectro de infrarrojo. En cambio, la vibración de
tensión asimétrica (vibración paralela) producirá una banda de absorción, así como las dos
vibraciones de flexión (vibraciones perpendiculares), que son degeneradas en energía y por tanto
aparecen como una sola señal en el espectro.

Por otra parte, como las moléculas de H2O y CO2 pueden girar libremente en su estado gaseoso,
sus absorciones de infrarrojo implican transiciones entre los distintos niveles rotacionales de los
estados vibracionales implicados. De ahí que las bandas de infrarrojo de estos compuestos sean
bandas de vibración - rotación, es decir, que sus bandas de vibración presentan estructura fina de
rotación. Así una molécula poliatómica como H2O o CO2 presenta bandas paralelas con un contorno
PR, mientras que sus bandas perpendiculares tienen contornos PQR.

28
2.3.5 Instrumentación del equipo

La espectroscopia de reflexión en el infrarrojo ha encontrado varias aplicaciones, particularmente

en el caso de muestras solidas difíciles de manipular, como películas de polímeros y fibras,
alimentos, gomas , productos agrícolas y muchos otros.

Instrumentación

Actualmente, la mayoría de los fabricantes de instrumentos FTIR disponen de unos adaptadores que
se colocan en los compartimientos de las cubetas y permiten realizar las medidas de reflectancia
difusa. La Figura 17.9 ilustra un tipo de adaptador.

Espectrometría de reflectancia total atenuada.

La espectroscopia de reflexión interna es una técnica que permite la obtención de espectros de

infrarrojo de muestras que presentan alguna dificultad, como solidos de limitada solubilidad,
películas, fibras, pastas, adhesivos y polvos.

Instrumentación

La Figura 17.11 muestra un aparato para las medidas de la reflectancia total atenuada. Como se
puede apreciar en la figura superior, la muestra (en este caso, un sólido) se coloca sobre las caras
opuestas de un material cristalino transparente con un alto índice de refracción; a menudo se
emplea una mezcla cristalina de bromuro de talio/ yoduro de talio, y también placas de seleniuro
de germanio y zinc. Ajustando adecuadamente el ángulo incidente, la radiación experimenta
múltiples reflexiones internas antes de pasar del cristal al detector. En cada una de esas reflexiones
tiene lugar la absorción v la atenuación.

29
En la figura se muestra un esquema de la óptica de un adaptador, disponible comercialmente, que
se sitúa en el compartimiento de las cubetas de la mayoría de los espectrómetros de infrarrojo y
que permite las medidas de la reflectancia total atenuada. Observese que se puede leegir el angulo
de incidencia entre 30°, 45° o 60°. Tambien se puede disponer de cubetas para muestras liquidas.

Instrumentación

La instrumentación utilizada en la región del infrarrojo cercano es semejante a la utilizada en la

espectroscopia de absorción ultravioleta / visible. Como fuentes se utilizan las lámparas de
wolframio con ventanas de cuarzo; por lo general, las cubetas son de cuarzo o sílice fundida que son
transparentes hasta aproximadamente 3.000 nm. La longitud de las cubetas varia de 0,1 a 10 cm.
Los detectores normalmente son fotoconductores de sulfuro de plomo. Varios espectrofotómetros
comerciales están diseñados para trabajar desde 180 a 2.500 nm, y de este modo se pueden utilizar
para obtener espectros en el infrarrojo cercano.

Comercialmente se dispone de una multitud de fotómetros y espectrofotómetros diseñados

específicamente para la región del infrarrojo cercano. La variedad de instrumentos es enorme. Los
más sofisticados son instrumentos de doble haz con red de difracción, diodos en serie, o
transformada de Fourier. También se puede disponer de instrumentos más sencillos que constan de
uno o mas filtros de interferencias.

30
En los estudios realizados en la región del infrarrojo cercano se utilizan varios disolventes. En la
figura se enumeran algunos de ellos. Obsérvese que el tetracloruro de carbono y el bisulfuro de
carbono son los únicos disolventes transparentes en toda la región de infrarrojo cercano.

2.4 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear.

La espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN), más comúnmente conocida como

espectrometría RMN, es una técnica que explota las propiedades magnéticas de ciertos núcleos. Las
aplicaciones más importantes para su uso en química orgánica son la espectrometría RMN de
protones y la de carbono-13. En principio, la RMN es aplicable a cualquier núcleo que posea espín.

Pueden obtenerse muchos tipos de información mediante un espectro RMN. Al igual que se utiliza
la espectrometría de infrarrojos para identificar grupos funcionales, el análisis de un espectro RMN
unidimensional proporciona información sobre el número y tipo de entidades químicas en una
molécula.

31
El impacto de la espectrometría RMN en las ciencias naturales ha sido sustancial. Puede utilizarse,
entre otras cosas, para estudiar mezclas de analitos, para comprender efectos dinámicos como el
cambio en la temperatura y los mecanismos de reacción, y es una herramienta de valor incalculable
para la comprensión de la estructura y función de las proteínas y los ácidos nucleicos. Este tipo de
espectrometría se puede aplicar a una amplia variedad de muestras, tanto en solución como en
estado sólido.

2.4.1 Principio de la resonancia magnética nuclear

Cuando se sitúan dentro de un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como el 1 H, o el 13
C) absorben a una frecuencia característica del isótopo. La frecuencia de resonancia, la energía de
la absorción y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por
ejemplo, en un campo magnético de 21 Tesla, los protones resuenan a 900 MHz. Es común referirse
a un imán de 21 T como imán de 900 MHz, aunque distintos núcleos resuenan a una frecuencia
diferente en este campo.

En el campo magnético terrestre, los mismos núcleos resuenan en frecuencias de audio. Este efecto
se utiliza en los espectrómetros RMN y otros instrumentos. Debido a que estos instrumentos son
fáciles de transportar y baratos, a menudo se utilizan para la enseñanza y el trabajo de campo.

2.4.2 Protones equivalentes e Integración

Protones equivalentes e integración

Denominamos protones químicamente equivalentes a aquellos que poseen el mismo

desplazamiento químico (también se denominan isócronos).

Curvas de integración

La intensidad relativa de una señal en la espectroscopia de RMN de 1H es proporcional al número

de protones que contribuyen a la señal. Es una medida del área bajo las señales.

La altura del escalón permite calcular el número de átomos de hidrógeno que dan origen a cada
señal. en la figura del espectro anterior se mide una altura para cada escalón 7.0 cm y 1.6 cm.

Para calcular el número de átomos de hidrógeno que originan cada señal.

32
 1. Se suman las dos integraciones y se divide por el número total de hidrógenos de la
estructura:

7.0 𝑐𝑚 + 1.6 𝑐𝑚 = 8.6 𝑐𝑚

2. Calculamos el total de hidrógenos
3. 1-bromo-2,2-dimetilpropano = 11 H
4. Por lo tanto
5. 11 H /8.6 cm = 1.28 H/cm
6. 3.- para saber el numero de hidrógenos de cada señal se multiplica su integración por el
valor de la grafica.
7. 7.0 cm x 1.28 H/cm = 9 H
8. 1.6 cm x 1.28 H/cm = 2 H
9. Los datos de lá integración se informan junto con el desplazamiento químico

2.4.3 Teoría del desplazamiento químico

Dependiendo del entorno químico local, los diferentes protones en una molécula resuenan a
frecuencias ligeramente diferentes. Dado que tanto este desplazamiento como la frecuencia de
resonancia fundamental son directamente proporcionales a la fuerza del campo magnético, el
desplazamiento de frecuencia se convierte en un campo independiente de valor adimensional
conocido como desplazamiento químico. El desplazamiento químico se reporta como una medida
relativa de algunas frecuencias de resonancia de referencia. (Para los núcleos 1 H, 13 C, y 29 Si, se
usa como referencia el tetrametilsilano o TMS.) Esta diferencia entre la frecuencia de la señal y la
frecuencia de la referencia se divide por la frecuencia de la señal de referencia para obtener el
desplazamiento químico. Los desplazamientos de frecuencia son muy pequeños en comparación
con la frecuencia RMN fundamental. Un desplazamiento de frecuencia típico podría ser de 100 Hz,
en comparación con una frecuencia RMN fundamental de 100 MHz, por lo que el desplazamiento
químico se expresa generalmente en partes por millón (ppm).

Mediante la comprensión de los diferentes entornos químicos, el desplazamiento químico puede

ser utilizado para obtener información estructural sobre la molécula en una muestra. La conversión
de los datos en bruto a esta información se llama asignación del espectro. Por ejemplo, para el
espectro 1H-RMN del etanol (CH3CH2OH), cabría esperar tres señales específicas en tres
desplazamientos químicos específicos: uno para los grupos CH3, uno para el grupo CH2 y otro para
el grupo OH. Un grupo CH3 típico tiene un desplazamiento de alrededor de 1 ppm, un CH2 adjunto
a un OH tiene un desplazamiento de alrededor de 4 ppm y un OH tiene un desplazamiento en torno
a 2-3 ppm, dependiendo del disolvente utilizado.

A causa del movimiento molecular a temperatura ambiente, los tres protones metilo alcanzan un
promedio durante el curso del experimento RMN (que normalmente requiere unos pocos
milisegundos). Estos protones se degeneran y forman un pico al mismo desplazamiento químico.

La forma y el tamaño de los picos son indicadores de la estructura química. En el ejemplo anterior -
el espectro de protones de etanol-, el pico de CH3 sería tres veces más grande que el OH. Del mismo
modo, el pico de CH2 sería el doble en tamaño al pico de OH, pero sólo 2/3 del tamaño del pico de
CH3.

33
El software de análisis moderno permite analizar el tamaño de los picos para comprender cómo
muchos protones dan lugar al pico. Esto se conoce como integración, un proceso matemático que
calcula el área bajo un gráfico (lo que, en esencia, es un espectro). El analista debe integrar el pico
y no medir su altura, porque los picos también tienen anchura y, por ende, su tamaño depende de
su área y no de su altura. Sin embargo, cabe mencionar que el número de protones, o cualquier otro
núcleo observado, es sólo proporcional a la intensidad, o integral, de la señal RMN, en los
experimentos RMN unidimensionales más simples. En experimentos más elaborados, como los que
suelen utilizarse para obtener el espectro RMN del carbono-13, la integral de las señales depende
de la tasa de relajación del núcleo, y de sus constantes de acoplamiento escalar y dipolar. Muy a
menudo, estos factores son poco conocidos, por lo que la integral de la señal RMN es muy difícil de
interpretar en los experimentos más complicados.

2.4.4 Multiplicidad y constantes de acoplamiento

La regla general de que el numero de picos en una banda desdoblada en un espectro de primer
orden es igual al numero n de protones equivalentes magnéticamente en los átomos vecinos mas
uno. El numero de tales picos se conoce como multiplicidad.

Los espectros de primer orden son aquellos en que el desplazamiento químico entre los grupos de
núcleos que interaccionan es grande con respecto a su constante de acoplamiento J.

Un comportamiento de primer orden requiere que J/δ sea menor que 0.05

El acoplamiento espin-espin es ocasionado por la presencia de protones vecinos (protones en

carbonos adyacentes, no equivalentes al protón en cuestión), se observa cuando dos grupos de
protones no equivalentes producen desdoblamiento mutuo de sus señales. Se puede predecir el
número de señales resultantes del acoplamiento espin-espin de un protón determinado (o grupo
de protones equivalentes), sumando 1 al número total (n) de protones vecinos y no equivalentes al
protón en cuestión (multiplicidad).

Un protón que carezca de protones no equivalentes en su vecindad, origina en el espectro un pico

sencillo, llamado singulete. Un protón vecino a otro no equivalente a él da origen a una señal
desdoblada en dos picos, esto es, un doblete. La separación entre los picos de un doblete se llama
constante de acoplamiento J. Para cualquier par de protones acoplados, el valor de J es idéntico al
medirlo en uno u otro doblete. Cuando un protón se encuentra en la vecindad inmediata de otros
dos, equivalentes entre sí pero distintos de él mismo, su señal en el espectro es un triplete (2+1=3).

Parte de la información más útil para determinar la estructura en un espectro RMN unidimensional
proviene del acomplamiento-J o acoplamiento escalar (un caso especial de acoplamiento espín-
espín) entre los núcleos activos de RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de los diferentes
estados espín a traves de los enlaces químicos de una molécula, y resulta en la división de señales
RMN. Estos patrones de división pueden ser complejos o simples y, del mismo modo, pueden ser
interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la
conectividad de los átomos en una molécula.

El acoplamiento a núcleos equivalentes n (espín ½) divide la señal en un multiplete n + 1 con ratios

de intensidad que siguen el triángulo de Pascal. El acoplamiento a espines adicionales conducirá a
nuevas divisiones de cada uno de los componentes del multiplete; por ejemplo, el acoplamiento a

34
dos núcleos diferentes de espín ½ con constantes de acoplamiento muy distintas, conducirá a un
doblete de dobletes (abreviatura: dd). Hay que tener en cuenta que el acoplamiento entre núcleos
que son químicamente equivalentes (es decir, que tienen el mismo desplazamiento químico) no
tiene efecto de los espectros RMN, y los acoplamientos entre núcleos que son distantes (por lo
general más de 3 enlaces en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños para observar
divisiones. Los acoplamientos de largo alcance, de más de tres enlaces, se observan a menudo en
compuestos aromáticos y cíclicos, conduciendo a patrones de división más complejos.

Por ejemplo, en el espectro de protones para el etanol que se ha descrito anteriormente, el grupo
CH3 se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1:2:1 mediante los dos protones CH2
vecinos. Del mismo modo, el CH2 se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1:3:3:1
mediante los tres protones CH3 vecinos. En principio, los dos protones CH2 también se dividen de
nuevo en un doblete para formar un doblete de cuartetos mediante el protón hidroxilo, pero el
intercambio intermolecular del protón hidroxilo acídico a menudo resulta en una pérdida de
información del acoplamiento.

El acoplamiento a cualquier núcleo de espín ½, tal como el fósforo-31 o el flúor-19, funciona de esta
manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes).
Pero los patrones de división difieren de los descritos anteriormente para los núcleos con espín
superior a ½ debido a que el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por
ejemplo, para el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) divide la señal en un triplete 1:1:1,
porque el espín 1 tiene tres estados de espín. Del mismo modo, un núcleo de espín 3/2 divide una
señal 1:1:1:1 en un cuarteto y así sucesivamente.

El acoplamiento combinado con el desplazamiento químico (y la integración de protones) nos dice

no sólo el entorno químico de los núcleos, sino también el número de núcleos activos RMN vecinos
en la molécula. En los espectros más complejos, con múltiples picos en desplazamientos químicos
similares, o en el espectro de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento es a menudo la única
manera de distinguir núcleos diferentes.

Acoplamiento de segundo orden (o fuerte)

La descripción anterior asume que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con

la diferencia en frecuencias RMN entre los espines inequivalentes. Si la separación del
desplazamiento disminuye (o la fuerza del acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad del
multiplete se distorsionan, y luego se vuelven más complejos y difíciles de analizar (especialmente
si más de dos espines están involucrados). La intensificación de algunos picos en un multiplete se
logra a expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de fondo, aunque el área
integrada bajo los picos se mantenga constante. En la mayoría de RMN de alto campo, sin embargo,
las distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones características (techo) pueden ayudar a
identificar los picos.

Los efectos de segundo orden disminuyen cuando la diferencia de frecuencia entre multipletes
aumenta, por lo que el espectro RMN de alto campo (es decir, de alta frecuencia) muestra menos
distorsión que los espectros de frecuencia menor. Los primeros espectros a 60 MHz eran más
propensos a la distorsión que los espectros de máquinas posteriores que operan en frecuencias de
200 MHz o superiores.

35
2.4.5 Elucidación estructural de compuestos orgánicos

La determinación estructural de una sustancia orgánica siempre comenzará con la compra, síntesis
o aislamiento de “un producto puro”.

Deberíamos, por tanto, comenzar (en el planteamiento más general) por recordar los métodos
físicos de “separación, aislamiento y purificación” de los compuestos orgánicos:

 Cristalización.
 Destilación en sus distintas modalidades: simple, fraccionada, a vacío, con arrastre de
vapor.
 Sublimación.
 Extracción.
 Cromatografía, también en sus diversas modalidades: de reparto, de absorción, de
gases, de exclusión o de intercambio iónico.
 Electroforesis.
 Etc..

Una vez aislado (o purificado) el producto orgánico deberíamos caracterizarlo tanto por sus
propiedades físicas como por métodos químicos, así en la CARACTERIZACIÓN FISICA,
deberíamos/podríamos determinar:

 Propiedades organolépticas: olor, color, sabor

 Punto de fusión (si el producto es sólido)
 Punto de congelación
 Punto de ebullición si es líquido
 Densidad
 Peso Molecular
 Índice de refracción
 Rotación óptica (si el producto es de origen natural)
 Etc..

En la CARACTERIZACIÓN QUÍMICA, podríamos considerar:

 Análisis elemental cualitativo y cuantitativo.

 Clasificación por solubilidad
 Determinación de acidez o basicidad.
 Identificación de grupos funcionales.
 Preparación de derivados.

Una vez realizada dicha caracterización químico-física deberíamos comparar los datos obtenidos
con los que se recogen en la bibliografía (Tablas de datos o bibliografía especializada).

2.5 Espectroscopia de absorción atómica.

Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas se utilizan para el estudio y caracterización
de moléculas o iones en su entorno cristalino, la espectroscopía de emisión y absorción atómica se

36
usa casi exclusivamente para el análisis de átomos. Por consiguiente, la técnica resulta casi
insuperable como método de análisis elemental de metales. En principio, la espectroscopía de
emisión puede utilizarse para la identificación y para la determinación cuantitativa de todos los
elementos de la tabla periódica.

Cuando la transición se produce desde el estado fundamental hasta un estado excitado del átomo
mediante la absorción de radiación de una determinada frecuencia (característica para cada átomo),
estamos en el caso de las técnicas de absorción. En el caso en que los átomos se lleven previamente
a un estado excitado y se mide la intensidad de la radiación emitida a la frecuencia característica
correspondiente a la transición desde el estado excitado al estado fundamental, hablamos de
técnicas espectrofotométricas de emisión. A continuación, se tratan las técnicas
espectrofotométricas de absorción atómica, de fotometría de llama y de emisión por plasma.

Pueden identificarse tres clases diferentes de procesos de emisión que difieren en cómo la sustancia
alcanza el estado excitado previo a la emisión.

a) Emisión a partir de una excitación electromagnética.

b) Emisión a partir de excitación térmica.
c) Emisión a partir de excitación eléctrica.

Los tipos más importantes de espectros de emisión se basan en la utilización de energía no

electromagnética para llevar a un átomo o a una molécula al estado excitado.

La espectroscopia de absorción atómica (a menudo llamada AA) es un método instrumental de la

química analítica que determina una gran variedad de elementos al estado fundamental como
analitos.

Los principios teóricos de la absorción atómica fueron establecidos en 1840 por Kirchhoff y Bunsen
en sus estudios del fenómeno de autoabsorción en el espectro de los metales alcalinos y alcalinos
térreos.

La base de la espectroscopia de absorción atómica (EAA) la entregó Kirchhoff al formular su ley

general: «cualquier materia que pueda emitir luz a una cierta longitud de onda también absorberá
luz a esa longitud de onda». El significado práctico de esto fue recién desarrollado en 1955 por el
australiano Walsh, apareciendo los primeros instrumentos comerciales a principios de 1960.

El átomo consiste de un núcleo y de un número determinado de electrones que llenan ciertos niveles
cuánticos. La configuración electrónica más estable de un átomo corresponde a la de menor
contenido energético conocido como “estado fundamental”.

Si un átomo que se encuentra en un estado fundamental absorbe una determinada energía, éste
experimenta una transición hacia un estado particular de mayor energía. Como este estado es
inestable, el átomo regresa a su configuración inicial, emitiendo una radiación de una determinada
frecuencia.

La frecuencia de la energía radiante emitida corresponde a la diferencia de energía entre el estado

excitado (E1) y el estado fundamental (Eo) como se encuentra descrito en la ecuación de Planck:

h = constante de Planck

37
υ = frecuencia

c = velocidad de luz

λ = longitud de onda

Según la teoría atómica, el átomo puede alcanzar diferentes estados (E1, E2, E3,…) y de cada uno de
ellos emitir una radiación (λ1, λ2, λ3,…) característica, obteniéndose así un espectro atómico,
caracterizado por presentar un gran número de líneas discretas. En absorción atómica es relevante
solamente aquella longitud de onda correspondiente a una transición entre el estado fundamental
de un átomo y el primer estado excitado y se conoce como longitud de onda de resonancia.

De la ecuación de Planck, se tiene que un átomo podrá absorber solamente radiación de una
longitud de onda (frecuencia) específica. En absorción atómica interesa medir la absorción de esta
radiación de resonancia al hacerla pasar a través de una población de átomos libres en estado
fundamental. Estos absorberán parte de la radiación en forma proporcional a su concentración
atómica. La relación entre absorción y concentración se encuentra definida en la Ley de Lambert-
Beer.

Como la trayectoria de la radiación permanece constante y el coeficiente de absorción es

característico para cada elemento, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración
de las especies absorbentes.

2.5.1 Aplicación

La EAA constituye una de las técnicas más empleadas para la determinación de más de 60
elementos, principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml en una gran variedad de muestras. Entre
algunas de sus múltiples aplicaciones tenemos el análisis de: aguas, muestras geológicas, muestras
orgánicas, metales y aleaciones, petróleo y sus subproductos; y de amplia gama de muestras de
industrias químicas y farmacéuticas.

La espectroscopia de absorción atómica con llama es el método más empleado para la

determinación de metales en una amplia variedad de matrices. Su popularidad se debe a su
especificidad, sensibilidad y facilidad de operación. En este método la solución muestra es
directamente aspirada a una llama de flujo laminar. La llama tiene como función generar átomos en
su estado fundamental, de los elementos presentes en la solución muestra. Temperaturas cercanas
a los 1,500–3,000°C son suficientes para producir la atomización de un gran número de elementos,
los que absorberán parte de la radiación proveniente de la fuente luminosa.

Otros sistemas han sido descritos con el fin de mejorar la eficiencia de la atomización, en los cuales
de deposita la muestra sólida o como suspensión en un accesorio especial para introducirlo a la
llama (navecilla de tantalio, cubeta de Delves).

Desde el inicio, en 1955, de la espectroscopia de absorción atómica como método de análisis, hubo
un nuevo ímpetu de desarrollar sistemas de atomización con llama, además de existir un interés
continuo en conocer el mecanismo mediante el cual la solución muestra es convertida a vapor
atómico en la llama. El resultado fue el desarrollo de un quemador con un cabezal de ranura,
obteniéndose de este modo un camino óptico alargado a través de la llama, lo que proporciona una

38
mayor sensibilidad al método. Estos quemadores emplean generalmente una cámara de
premezclado de combustible/oxidante en combinación con un sistema para aspirar la solución
muestra a la llama.

El número de átomos generados en su estado fundamental en la etapa de atomización determinará

la cantidad de radiación absorbida.

El quemador del premezclado, que consiste en la combinación de un nebulizador con un quemador.

En este sistema continuo la solución muestra es aspirada por arrastre con el gas comburente a través
de un nebulizador para generar un aerosol fino dentro de una cámara donde se mezcla con los gases
combustible y comburente auxiliar. Un deflector de flujo, ubicado en la cámara de premezclado,
permite que las gotitas más grandes impacten contra él, caigan al fondo de la cámara y se escurran
por el tubo de drenaje. El aerosol compuesto por las gotitas más finas es transportado hacia el
cabezal del quemador, donde ocurre la combustión y la atomización de la muestra. Una entrada de
gas oxidante auxiliar directa a la cámara de premezclado permite que los ajustes del flujo del
oxidante sean efectuados por medio de la línea auxiliar, mientras que el flujo a través del
nebulizador permanece constante. De esta forma la velocidad de aspiración de la muestra es
independiente de las condiciones de la llama.

Los nebulizadores pueden ser regulados para variar la velocidad de aspiración de la solución muestra
(1–4 ml/min). Estos están hechos de un material resistente a la corrosión.

Diferentes tipos de cabezales son utilizados dependiendo del tipo de llama a emplear. Estos se
construyen de titanio para darle una resistencia al calor y a la corrosión, siendo los más empleados
de 10 cm de ranura simple (llama acetileno/aire), 10 cm de ranura triple para soluciones con alto
contenido de sólidos y cabezal de 5 cm (llama acetileno/óxido nitroso).

El tiempo necesario para la atomización de una muestra dependerá de la velocidad de entrada de

los gases en la llama y se expresa con altura de la llama, de modo que la medición de la absorbancia
se debe realizar en una zona en que la atomización sea completa.

La llama debe ser en lo posible transparente, es decir, no debe absorber parte de la radiación
proveniente de la lámpara. En general, la llama debe poseer una lata eficiencia en la producción de
átomos libres y ésta debe evitar que ocurran reacciones del elemento a determinar con productos
de la combustión de los gases empleados o con otros componentes de la muestra. Al respecto, la
temperatura de la llama tiene un cierto grado de importancia, siendo a veces más valiosas las
propiedades reductoras u oxidantes (según relación entre gases combustible/comburente) de ella.
La razón óptima combustible/comburente dependerá:

 del tipo de quemador;

 de los gases (combustible/comburente);
 del elemento a determinar.

39
 Tabla 4.1. Temperatura máxima (°C) de distintas llamas

Combustible Aire Oxígeno

Gas alumbrado 1,700 2,700

Propano 1,930 2,800

Butano 1,900 2,900

Hidrógeno 2,100 2,780

Acetileno 2,300 3,100

Cianógeno 2,300 4,300

La llama aire/acetileno es la más empleada, debido a que ofrece para muchos elementos un medio
ambiente y temperatura suficientes para la atomización. La llama es completamente transparente
y solamente muestra autoabsorción bajo los 230 nm.

La introducción de la llama óxido nitroso/acetileno (2,900 – 3,000°C) permite la determinación de

aquellos elementos que nos dejan determinar con llama aire/acetileno como Al, Si, Ti, etc… Como
producto de su baja velocidad de combustión, esta llama energética ofrece un medio ambiente
químico, térmico y óptimo favorable, pero posee dos desventajas: numerosos elementos son
ionizados y muestran una emisión relativamente fuerte.

La llama hidrógeno/argón es utilizada en la determinación de As, Se, Cd y Zn. Su gran ventaja es su

alta transparencia en el ultravioleta ideal para la determinación de As y Se. Sin embargo, se debe
contar con grandes interferencias, debido a la menor temperatura de llama.

En espectroscopia de absorción atómica la concentración de un elemento en una muestra se

determina por comparación de la absorbancia de la solución muestra con la absorbancia de
soluciones estándar de concentración conocida.

Si cualquier constituyente de la muestra altera uno o más pasos en el proceso de formación de

átomos en su estado fundamental en la llama, llevará a un error en la medición de la concentración.
Las interferencias que se pueden producir en espectroscopia de absorción atómica se clasifican en:
físicas químicas, de ionización y espectrales.

2.5.2 Instrumentación

 Instrumentos de un solo haz

Un instrumento típico de haz sencillo consiste de una lámpara de cátodo hueco, una lámpara de
deuterio para corrección por absorción no atómica, un modulador (chopper), un atomizador, un
monocromador y un transductor (ver Figura 50).

40
 Partes principales de un espectrómetro de absorción atómica de un solo haz.

Este instrumento es utilizado y está basado en los mismos principios teóricos que un
espectrofotómetro convencional. Primero se aspira el blanco y se ajusta la lectura a 100%de
Transmitancia; posteriormente se aspira la muestra problema y se hace la lectura de absorbancia o
transmitancia. La radiación de la lámpara de deuterio pasa en forma alterna con la radiación de la
lámpara de cátodo hueco, para que el detector perciba alternadamente las dos señales. El chopper
o cortador, consiste de cuadrantes huecos y cuadrantes con espejos, y es el mecanismo a través del
cual es posible que el detector reciba en forma alterna la señal de la lámpara de cátodo hueco y la
de la lámpara de deuterio, con respecto al tiempo y compara las dos absorbancias.

 Instrumentos de doble haz

En un instrumento de doble haz, la radiación emitida por la fuente es dividida por un modulador
con espejos. Este consiste de una pieza circular con secciones alternadas de espejo y partes huecas;
esta pieza está girando, de manera que el haz de la fuente pasa alternadamente por el hueco del
modulador y llega a la llama o choca con una sección de espejo del mismo y es reflejado. Estos dos
haces son recombinados en un espejo especial (half-silvered mirror) pasan a través de un
monocromador y finalmente la señal es enviada por medio de un fotomultiplicador. Esta señal
recibida por el sistema de lectura es la relación entre la señal de referencia y la señal de la muestra
misma. Aún y cuando no se encuentre la lámpara de deuterio para corrección por absorción no
atómica, el instrumento de doble haz la puede contener como accesorio opcional.

Sistema de doble haz de un espectrómetro de absorción atómica

41
Como se dijo anteriormente los componentes básicos de un espectrómetro de absorción atómica
son:

 Una fuente de radiación que emita la línea espectral del elemento de interés.
 Un sistema de atomización, que suministre energía suficiente para la disociación del analito
y la formación de átomos libres.
 Un monocromador para aislar la línea espectral medida.
 Un detector acoplado con un sistema medidor o de registro de los datos obtenidos.
 Fuentes de radiación

La parte más crítica de un instrumento de absorción atómica es la fuente, ya que es muy difícil medir
con buena exactitud líneas de absorción tan estrechas como las que presentan los átomos. El
problema se ha resuelto aplicando el principio de que cada especie química es capaz en condiciones
adecuadas, de absorber sus propias radiaciones. Bajo esta premisa se han desarrollado las lámparas
de cátodo hueco y las lámparas de descarga sin electrodos.

Lámparas de cátodo hueco

Consiste en un tubo de vidrio conteniendo argón o neón a baja presión (1-5 torr) y dos electrodos.
El ánodo suele ser tungsteno, y el cátodo, de forma cilíndrica, está construido con el metal que se
desea determinar (ver Figura 52).

Lámpara de cátodo hueco.

Cuando se aplica una diferencia de potencial suficiente entre los dos electrodos tiene lugar la
ionización del gas y los cationes gaseosos son acelerados hacia el cátodo, adquiriendo la suficiente
energía cinética para arrancar algunos átomos metálicos del material catódico. Algunos de estos
átomos metálicos son excitados al chocar con los iones gaseosos, y al retornar a su estado
fundamental emiten radiación característica (ver Figura 53).

Al apagar la lámpara, los átomos metálicos vaporizados tienden a depositarse sobre las paredes del
cátodo o sobre las paredes de vidrio del tubo, siendo mínima la posibilidad, por el diseño cilíndrico
del cátodo. El hecho de que los diferentes elementos tengan que ser determinados de uno en uno
hace que la absorción atómica sea una técnica de análisis cuantitativo nos siendo efectiva para la
identificación de los elementos presentes en una muestra.

42
 Esquema de la emisión de radiación en el cátodo.

Ordinariamente, para cada elemento se utiliza una lámpara, si bien se han comercializado lámparas
de cátodo hueco multielementales. Estas lámparas se construyen con aleaciones de diferentes
metales procurando que tengan similares puntos de fusión y volatilidad, como, por ejemplo, Ca/Mg,
Ag/Au, Cu/Pb/Zn, Co/Cr/Cu/Fe/Mn/Ni.

Lámparas de descarga sin electrodos

Consisten en un tubo de cuarzo herméticamente cerrado conteniendo unos pocos miligramos del
elemento de interés y un gas inerte a baja presión. La activación se lleva a cabo mediante un intenso
campo de radiofrecuencias (100 kHz - 100 MHz) o radiación de microondas (>100 MHz). Cuando
opera, el gas noble se ioniza, y los iones producidos son acelerados por el campo de radiofrecuencia
hasta que adquieren la energía suficiente para excitar a los átomos del metal.

Sistemas de atomización

Históricamente la llama ha desempeñado un papel importante en absorción atómica para la

generación de vapor atómico a partir de disoluciones, o incluso de muestras sólidas. Actualmente,
y a pesar de sus limitaciones, todavía se utiliza muy extensamente, debido a su sencillez, bajo coste
del equipo y su versatilidad para varios elementos de diferente naturaleza. En cuanto al quemador
el más utilizado es el de pre-mezcla, que opera en régimen laminar y que esquemáticamente se ha
representado en la Figura 53.

Monocromadores

La única finalidad del monocromador es aislar la línea de resonancia del elemento de interés. Para
la mayor parte de los elementos, el problema suele ser sencillo, pues las diferentes líneas suelen
estar bastante separadas. Ello hace que no sea necesario un monocromador de alta resolución, y en
consecuencia, no demasiado costoso, siendo este uno de los factores que han contribuido a que la
técnica sea muy utilizada en la práctica ordinaria del análisis.

Las anchuras de rendija juegan un papel importante, al determinar la fracción del espectro que
incide en el detector. La rendija deberá ser lo más estrecha posible, con objeto de reducir la cantidad
de radiación emitida por la llama que llega al detector. Algunos instrumentos comerciales están
provistos de dos tipos de rendijas, para usarlas con llama o con atomización electrotérmica
respectivamente.

Detectores

43
El detector universalmente usado en absorción atómica es el tubo fotomultiplicador, ya que ningún
otro sistema ofrece la misma sensibilidad en el margen de longitudes de onda utilizado en esta
técnica.

Función y condiciones de las llamas

La llama tiene tres funciones básicas: permite pasar la muestra a analizar del estado líquido a estado
gaseoso; descompone los compuestos moleculares del elemento de interés en átomos individuales
o en moléculas sencillas y excita estos átomos o moléculas.

Las condiciones que debe cumplir una llama para considerarla satisfactoria es que tenga la
temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente gaseoso que permita las funciones
mencionadas. Además, el ruido de fondo de la llama no debe interferir las observaciones a efectuar.

Una llama típica consta de: cono interno, cono externo y zona entre conos como podemos observar
en la siguiente figura.

El cono interno es la zona en que tiene lugar, generalmente, una combustión parcial, es decir sin
equilibrio térmico. Esta zona se calienta por conducción y radiación a partir de la región más caliente
que se encuentra sobre ella. En ella se forman los productos de oxidación intermedios, se produce
una gran emisión de luz (a partir del combustible y no de la muestra), una elevada ionización y una
gran concentración de radicales libres. Es muy poco utilizada para trabajo analítico.

Inmediatamente encima de la región del cono interno se encuentra la zona interconal Es la llamada
parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una combustión completa y se alcanza casi un
equilibrio termodinámico. Esta llama es la que se utiliza prácticamente en análisis por fotometría de
llama y espectroscopía de absorción atómica. La altura de esta zona sobre el quemador varía
considerablemente con el tipo de quemador, la naturaleza de los gases utilizados y su velocidad de
flujo.

La región del cono externo es una zona de combustión secundaria en la que los productos
parcialmente oxidados como el monóxido de carbono pueden completar su combustión. Esta región
se enfría por el aire circundante y es, en general, una región poco útil.

Fenómenos que tienen lugar en la llama

1. - Se evapora el agua o los otros disolventes dejando como residuo diminutas partículas de
sal seca.
2. - La sal seca se vaporiza, es decir, pasa al estado gaseoso.

44
 3. - Las moléculas gaseosas, o una parte de ellas, se disocian progresivamente dando lugar a
átomos neutros o radicales. Estos átomos neutros son las especies absorbentes en
espectroscopía de absorción atómica y son las especies emisoras en fotometría de llama.
4. - Parte de los átomos neutros se excitan térmicamente o se ionizan. La fracción excitada
térmicamente es importante en análisis por fotometría de llama ya que el retorno al estado
fundamental de los electrones excitados es el responsable de la emisión de la luz que se
mide.
5. - Parte de los átomos neutros o de los radicales que se encuentran en la llama pueden
combinarse para formar nuevos compuestos gaseosos. La formación de estos compuestos
reduce la población de los átomos neutros en las llamas y constituye las llamadas
interferencias químicas que se presentan en los métodos de análisis que utilizan llamas.

La eficacia con que las llamas producen átomos neutros tiene mucha importancia. La llama de óxido
nitroso-acetileno, que es más caliente que la de aire acetileno, parece ser más efectiva para la
formación de átomos neutros. Los metales alcalinos son una excepción, probablemente debido a
que la ionización es apreciable en la llama caliente. En cualquier caso, estos dos tipos de llama son
los más adecuados para fotometría de llama y absorción atómica.

A las temperaturas ordinarias de llamas es relativamente baja la fracción de átomos del estado
fundamental que se excita. Únicamente si la temperatura de la llama es muy elevada la fracción de
átomos excitados empieza a ser apreciable. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de controlar
la temperatura de la llama cuidadosamente para fotometría de emisión. Por el contrario, la fracción
de átomos en el estado fundamental es muy elevada y, por lo tanto, pequeñas fluctuaciones en la
temperatura de la llama no son importantes para el análisis por absorción atómica.

La ionización que tiene lugar en las llamas produce normalmente la pérdida de un sólo electrón y se
puede representar:

 A = A+ + e-
 A = átomo neutro
 A+ = su ion positivo
 e- = electrón libre

Este proceso de disociación depende de la concentración o de la presión, ya que una especie se

disocia en dos. Al aumentar la presión parcial de los átomos en la llama, el porcentaje de ionización
disminuye tal como debe esperarse de la aplicación de la ley de Le Chátelier.

A la temperatura de la llama acetileno-oxígeno la mayor parte de los elementos se encuentran

apreciablemente ionizados. El grado de ionización del elemento a analizar puede disminuirse por
adición de una elevada concentración de otro elemento que sea más fácilmente ionizable (tampón
de radiación o supresor de ionización).

Es preferible, por lo general, suprimir de este modo la ionización a utilizar temperaturas de llama
más bajas que hacen aumentar las interferencias químicas.

45
2.5.3 Técnicas analíticas

La espectrometría atómica, en términos generales, está basada en la absorción, emisión o

fluorescencia por átomos o iones elementales. Hay dos regiones del espectro que dan información
atómica: la ultravioleta/visible y la de rayos X. En la primera región tienen su fundamento los
instrumentos disponibles en el Servicio de Espectrometría Atómica de los Servicios de Investigación.

Los espectros atómicos ultravioleta y visible se obtienen mediante un adecuado tratamiento

térmico que convierte los componentes de una muestra en átomos o iones elementales gaseosos.
La emisión, absorción o fluorescencia de la mezcla gaseosa resultante sirve a continuación para la
determinación cualitativa y cuantitativa de uno o varios de los elementos presentes en la muestra.

El espectrómetro de absorción atómica con cámara de grafito (GFAAS) permite trabajar con
muestras de volumen muy reducido (inferior a 100 µL) o directamente sobre muestras orgánicas
líquidas. Habitualmente se analizan muestras de material biológico de origen clínico (sangre, suero,
orina, biopsias hepáticas, etc.). Por su elevada sensibilidad (niveles de ppb), la técnica se aplica en
la detección de metales en productos de alta pureza, como por ejemplo fármacos, alimentos (peces
y carne) y productos industriales, y también en aguas de bebida y de acuíferos (determinación de la
presencia de Cu, Cd, Pb, As, Hg, etc.).

El espectrómetro de absorción atómica de llama (FAAS) permite la detección y determinación de

metales en cualquier tipo de muestra industrial siempre y cuando pueda ser solubilizada. Los límites
de detección en este caso son del orden de la ppm (partes por millón).

Esta técnica analítica está especialmente indicada para determinar elementos alcalinos,
alcalinotérreos y metales pesados presentes en cualquier tipo de muestra susceptible de ser
disuelta. Los niveles de concentración que se pueden analizar van desde % hasta ppb (partes por
billón ó 1 mg/Tm).

Actualmente se dispone de un equipo de absorción atómica de última generación modelo AAnalyst

800 de la firma Perkin-Elmer cuyas características principales son:

 Doble sistema de atomización con intercambio totalmente automatizado.

 Mechero para atomización por llama.
 Horno de grafito para atomización electrotérmica.

46
  Horno de grafito de calentamiento transversal con tecnología de estabilización de
temperatura.
 Corrección de fondo por efecto Zeeman para la atomización electrotérmica.
 Correción de deuterio para la atomización por llama.
 Automuestreador.
 Detector de fotodiodos en fila segmentados.

De pendiendo de las disponibilidades de lámparas de cátodo hueco y de la naturaleza de las

muestras, se pueden desarrollar metodologías de análisis que permiten la determinación, en unl
rango que va desde las ppm (mg/kg) a las ppb (µg/Kg) de un gran número de elementos del sistema
periódico:

Ag, Al, As, Au, B, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ge, Hg, Ho, In, Ir, K, La, Li,
Lu, Mg, Mn, Mo, Na, Nd, Ni, P, Pb, Pd, Pr, Pt, Rb, Rh, Ru, Sb, Se, Si, Sm, Sn, Sr, Te, Ti, Tl, Tm, U, V, Y,
Yb, Zn.

Interferencias:

Se llaman interferencias a la influencia que ejerce uno o más elementos presentes en la muestra
sobre el elemento que se pretende analizar. La clasificación de los distintos tipos de interferencias
se muestra a continuación:

 Interferencias físicas: Efectos causados por las propiedades físicas de la muestra en

disolución.
 Interferencias espectrales: Producida por radiaciones que alcanzan al detector a una
longitud de onda muy próxima del elemento que se investiga.
 Interferencias químicas: Influencia que ejercen unos elementos sobre otros por formar,
entre ambos, compuestos estables.
 Interferencia por efecto de matriz: Debidas a la influencia que tiene el entorno que rodea a
los átomos en estado fundamental que se pretende analizar.
 Interferencias por absorción inespecíficas: Se presenta un aumento de la señal originado
por la dispersión de las radiaciones de la lámpara.
 Interferencias por ionización: Debida a que parte de los átomos pasan al estado excitado.
Para evitar al máximo estas interferencias habrá que optimizar el equipo eligiendo las
condiciones más adecuadas para cada elemento.

Métodos:

Para el análisis de una muestra, lo primero que habrá que hacer será poner las condiciones
específicas del elemento que vamos a analizar. Estas condiciones vienen especificadas por el
fabricante. Una vez elegidas las condiciones de trabajo para el elemento en cuestión habrá que
calibrar el aparato. Parta ello se pueden seguir dos procedimientos, la realización de una curva de
calibrado o bien el método de adición.

Curva de calibrado.

Se utilizan soluciones patrones, que contienen el elemento a determinar de concentraciones

conocidas. Se representan la absorbancia de cada solución patrón frente a la concentración. Se

47
procura trabajar en el intervalo lineal de la curva. Una vez obtenida la curva patrón, se atomiza la
muestra problema y se mide la absorción de la misma, utilizando idénticas condiciones a las usadas
cuando se preparó la curva patrón. De la medida de la absorbancia del problema se puede
determinar su concentración a partir de la curva de calibrado por extrapolación.

Método de adición.

Este método se emplea cuando existen interferencias. El método consiste en añadir un volumen
conocido de la muestra problema a cuatro matraces aforados. Al primer matraz no se le añade nada.
Al segundo se le añade por ejemplo 1ppm.

Al tercer matraz se le añade un volumen doble del mismo patrón, de forma que contenga una
concentración añadida de 2ppm. Y al cuarto matraz se le añade 3ppm.

Una vez hecho esto, se procede a realizar las medidas de absorbancia de cada matraz. El primer
matraz dará una lectura, el segundo matraz dará la misma lectura que el anterior más la señal propia
de 1ppm. Extrapolando sobre el eje negativo de las X se encuentra el valor de la concentración de
la muestra desconocida. Para que este método sea válido se debe obtener una curva de calibrado
perfectamente recta.

2.6 Espectrometría de masas.

La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar

compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y

48
propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con
cantidades realmente pequeñas (algunos pmoles) de muestra y obtener información característica
como el peso y algunas veces la estructura del analito.

En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la
ionización. En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI), algunas de las
moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de
fragmentación resultante, así como los iones residuales constituyen el espectro de masas.

En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado como se “huella
química” para caracterizar el analito.

Los inicios de la espectroscopia de masas

Corría el año 1912 cuando el científico J. J. Thomson (Premio Nobel en 1906) empujado por su afán
de descubrir los secretos más profundos de la química, se las ingenió para crear el primer
espectrómetro de masa y obtener de él los primeros espectros de elementos como O2, N2, CO y
COCl2.

Pero el mérito no fue solo de él, ya que la espectrometría de masas comenzó a ver la luz en el año
1886 cuando Goldstein descubrió los iones positivos, siguió cogiendo forma con W. Wien que
consiguó analizarlos por deflección magnética en 1898 y que dio un paso definitivo cuando W.
Kaufmam consguió analizar los rayos catódicos usando campos eléctricos y magnéticos paralelos en
1901. Todos estos avances permitieron a la privilegiada mente de J. J. Thomson idear el primer
espectrómetro de masas (Skoog, Hiller, Nieman, 2000, 182).

A partir de ese día se comenzó a usar en los laboratorios de química para separar iones atómicos y
moleculares en función del cociente masa/carga con la unidad Thomson (Th) como unidad
fundamental. Y aunque su avance era firme, su uso para analizar macromoléculas no fue posible
hasta la década de los 80, cuando el profesor J. B. Fenn utilizó el método de ionización por
electropulverización ("electrospray") de una solución acuosa de proteínas. De esta forma consiguió
producir pequeñas gotas de una muestra que se reducen de tamaño al evaporarse el agua que las
transporta, mientras los iones de proteínas permanecen en forma de suspensión libre. La relación
masa/carga de los iones así obtenidos permite su análisis en cualquier espectrómetro de masas.
Biólogos y químicos pueden ahora rápidamente identificar las proteínas y obtener su imagen
tridimensional (Rubinson, Rubinson, 2000, pg. 289).

La espectrometría de masas atómicas es una herramienta muy versátil y util para identificar los
elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las materias
que la componen. Esta técnica nos permite determinar prácticamente todos los elementos del
sistema periódico.

Esta técnica ofrece numerosas ventajas frente a las técnicas espectofotométricas ya que:

 Los límites de detección que son, para muchos elementos, tres órdenes de magnitud
más sensibles frente a los métodos ópticos.
 Espectros notablemente más sencillos, generalmente únicos y con frecuencia
fácilmente interpretables.

49
  Capacidad para medir relaciones isotópicas atómicas.
 En cambio, también tienen una serie de desventajas que no podemos obviar como:
 El coste del instrumento es de dos a tres veces el de los instrumentos ópticos atómicos.
 La deriva del instrumento puede ser del orden del 5 o 10%/hora.
 Contiene unas determinadas interferencias.

Con la espectrometría de masas somos capaces de proporcionar información acerca de:

 La composición elemental de las muestras: de esta se encarga la espectrometría de

masas atómico.
 De la composición de las moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas.
 De la composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas.
 De la estructura y composición de superficies sólidas.
 De las relaciones isotópicas de átomos en las muestras.

Hoy en día se continúa avanzando y cabe citar al científico japonés K. Tanaka, que bombardeando
muestras de macromoléculas biológicas en estado sólido o viscoso con rayos láser, consiguió su
dispersión en porciones ionizadas de pequeñísimo tamaño, aptas para su análisis por
espectrometría de masas. Un método para determinar la masa de macromoléculas en
espectrometría es acelerarlas en una cámara de vacío y medir su "tiempo de vuelo". Los blancos del
espectrómetro son alcanzados por las moléculas en un orden determinado por sus unidades
Thomson. Las más rápidas son las más ligeras y de mayor carga (Rubinson, Rubinson, 2000, pg.291)

Estos métodos poseen muchas aplicaciones como son el desarrollo de productos farmacéuticos,
control de sustancias nutritivas y diagnósticos precoces de enfermedades como la malaria, cáncer
de mama, cáncer de próstata, etc.

Hoy en día, esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que en su origen, aunque el
espectrómetro de hoy en día poco tenga que ver con su predecesor.
La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas
por su diferente masa.

El proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:

 Ionización de la muestra.
 Aceleración de los iones por un campo eléctrico.
 Dispersión de los iones según su masa/carga.
 Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica.

50
Esquematización del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de
espectroscopia de masas.

2.6.1 Conceptos de: espectro de masas, ión molecular o progenitor de pico base

Espectro de masas: Un espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como función
de la relación masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un
histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso
molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la fragmentación del
analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores que la molécula
completa ionizada (ion molecular) a partir de estos datos se deduce la estructura y peso molecular
de la molécula completa.

Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion representa
la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones fragmentados que componen el
espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z numéricamente igual al peso
molecular del compuesto.

Pico base: Es el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las
intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.

Relación masa/carga: Esta expresión, abreviada m/z, es la relación del número de masa (m) de una
partícula dada entre el número (z) de unidades cargadas electrostáticamente (e) que posee la
partícula. Así, m/z es una relación adimensional que es el parámetro medido por el analizador de
masas. La masa de una partícula dada es igual a la suma de sus masas atómicas (en Daltons) de
todos los elementos que componen la partícula. El símbolo para las unidad de masa es u, y
corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por
convención.

51
Iones doblemente cargados: Es posible para una molécula perder dos electrones durante el proceso
de ionización. Estos iones que están doblemente cargados producirán un pico en el espectro de
masas en un valor m/z numéricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion. Los iones
doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayoría de los compuestos.
Sin embargo, para aquellas moléculas que los produzcan en forma estable, los picos
correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretación de datos.

Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparación con

el pico base. Se representa como % respecto al pico base que es 100%. Por convención, este dato
se indica en la izquierda del espectro de masas.

Porcentaje total de ionización: Este término expresa la abundancia de un ion individual comparado
con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico. La escala de
porcentaje total de ionización esta representada a la derecha del espectro de masas con el símbolo
(%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de masas de diferentes
compuestos.

2.6.2 Partes fundamentales de un espectrómetro de masas

Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes:

 Sistema de entrada de muestras.

 Cámara de ionización.
 Acelerador.
 Analizadores.
 Detector.
 Sistema de entrada de muestras.

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierte al estado

gaseoso por calentamiento a unos 400ºC y se introduce lentamente en la cámara de ionización.

La finalidad del sistema de entrada es permitir la introducción de una muestra representativa en la

fuente de iones con la mínima perdida de vacío. En los espectrómetros de masas más modernos
encontramos diferentes tipos de sistemas de entrada:

Sistemas indirectos de entrada: es el sistema más clásico y el más simple, en el cual la muestra se
volatiliza externamente y se introduce en la región de ionización que esta a baja presión. El sistema
de entrada es normalmente de vidrio para evitar posibles pérdidas por adsorción.

Entrada por sonda indirecta: los líquidos y los sólidos no volátiles se pueden introducir en la región
de ionización mediante un soporte para muestra o sonda, el cual se inserta a través de un cierre de
vacío. El sistema de cierre se utiliza para controlar la cantidad de aire que entra después de la
inserción de la sonda en la región de ionización. Las sondas también se usan cuando la cantidad de
muestra es limitada ya que se pierde mucha menos cantidad.

Sistemas de entrada cromatrográficos y de electroforesis capilar 1: es un tipo de sistema de entrada

especial, esta indicado su uso cuando al espectrómetro de masa va acoplado un sistema de

52
cromatrografía de gases o de líquidos de alta eficacia o a columnas de electroforesis capilar que
permiten la separación y determinación de los componentes de mezclas complejas (Métodos, 2006)

53
Cámara de ionización

Las fuentes de iones de los espectrómetros de masas, tienen todas unas características comunes,
pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una
muestra en iones.

En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinados en un único

componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente
positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema
separador a través del acelerador.(Skoog, Hiller, Hieman, 2000, 212).

La formación de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un análisis por

espectrometría de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares,
depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Estos métodos los
podemos dividir en dos categorías:

Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza.

Están generalmente restringidas a compuestos térmicamente estables que tengan puntos de

ebullición menores de unos 500ºC. En la mayoría de los casos, estos requerimientos limitan la
utilización de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos
103 Daltons.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente
los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos
tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000
Daltons.

Fuentes de desorción 2: es estas la muestra en estado sólido o líquido, se transforman directamente

en iones gaseosos.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente
los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos
tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000
Daltons.

Las fuentes de iones se pueden clasificar también en fuentes duras y fuentes blandas.

Fuentes duras: comunican suficiente energía a las moléculas para que estén en un estado de energía
altamente excitado. La relajación posterior, implica la rotura de las uniones produciendo iones
fragmentados. Su espectro da lugar a muchos picos y nos da información acerca de la naturaleza de
los grupos funcionales e información estructural de los analitos.

54
Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación y el resultado es un espectro con muy pocos picos
dándonos información útil ya que nos permite la determinación exacta del peso molecular de la
molécula o moléculas

TIPO NOMBRE Y ACRÓNIMO AGENTE IONIZANTE

Impacto de electrones (EI) electrones energéticos
Fase
Ionización química (CI) iones gaseosos reactivos
Gaseosa
electrodo de elevado
Ionización por campo (FI)
potencial
electrodo de elevado
Desorción por campo (FD)
potencial
Ionización por electronebulización (ESI) campo eléctrico elevado
Desorción/ionización asistida por una matriz
haz de láser
(MALDI)
fragmentos de fisión del
Desorción Desorción por plasma (PD)
252Cf
Bombardeo con átomos rápidos (FAB) haz de átomos energéticos
Espectrometría de masas de iones
haz de iones energéticos
secundarios (SIMS)
Ionización por termonebulización (TS) elevada temperatura
Clasificación de los distintos tipos de camaras de ionización, indicando
sus nombres y acrónimos y especificando cada sus agentes ionizantes.

Sistema acelerador.

En el sistema acelerador las partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son
obligados a atravesar una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial.
Entre esta primera y una segunda ranura existe una diferencia de potencial muy elevada que
imprime a las partículas su velocidad final. Una tercera ranura actúa como colimador del haz de
partículas.

Analizadores de masa.

Para la separación de iones con diferente relación m/e se dispone de varios dispositivos. Lo ideal es
que el analizador fuera capaz de distinguir entre diferencias muy pequeñas de masa. Además, los
analizadores deberían de permitir el paso del número suficiente para producir corrientes iónicas
fáciles de medir. Al igual que sucede con los monocromadores 4 ópticos, a los que los analizadores
son análogos, estas dos propiedades no son compatibles y se debe de llegar a un equilibrio que esta
regido por la resolución del espectrómetro de masa (Skoog D., Holler J., Nieman T., 2000, pág. 412).

Existen diferentes tipos de analizadores de masas:

Analizadores de sector magnético: los analizadores de sector magnético utilizan un imán

permanente o un electroimán para hacer que el haz procedente de la fuente de iones se desplace
con una trayectoria circular de 180, 90 o 60º. Estos analizadores también son llamados de enfoque
simple.

55
Diagrama esquemático de un analizador de masas de sector magnético equivalente a los utilizados
en espectrometría de masas, recalcar la ubicación del sector magnético (laminated magnet).

Espectrómetros de doble enfoque: este término se usa en los espectrómetros en los cuales las
aberraciones direccionales y las aberraciones de energía de una población de iones se minimizan
simultáneamente. El doble enfoque se consigue utilizando combinaciones de campos magnéticos y
electrostáticos cuidadosamente seleccionados.

Espectrómetro de masa cuadrupolar: son normalmente menos caros y más robustos que los de
sector magnético, además también ofrecen la ventaja de emplear tiempos de barrido pequeños
(<100ms), lo cual es particularmente útil para realizar barridos de picos cromatrográficos en tiempo
real. Son, con diferencia los más utilizados hoy en día (Plasencia, 2003, 15).

Diagrama de un espectrómetro de masa cuadrupolar, que es uno de los tipos de analizadores de

masa más utilizados en espectrometria de masas dado su bajo precio y robustez.

56
Analizadores de masas de tiempo de vuelo (TOF): en estos aparatos se producen los iones positivos
periódicamente por bombardeo de la muestra con impulsos de electrones, de iones secundarios o
de fotones generados por láser. Los iones producidos de esta forma son acelerados en un tubo
analizador libre de campo mediante un campo eléctrico pulsante de 103 a 104 V. La separación de
los iones en función de la masa se produce durante su recorrido hacia el detector, situado al final
del tubo. Estos aparatos presentan ventajas como la robustez, simplicidad, fácil acceso a las fuentes
de iones y el virtualmente ilimitado intervalo de masas, pero tienen no obstante una sensibilidad y
una resolución limitadas.

Analizadores de trampa de iones: es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden
formarse y quedar confinados durante largos periodos de tiempo por la acción de campos eléctricos
y/o magnéticos. Los espectrómetros de trampa de iones son más robustos, compactos y más
económicos que los anteriores.

Transformada de Fourier (FT): Como sucede con los instrumentos de infrarrojo y de resonancia
magnética nuclear, los espectrómetros de masas de transformada de Fourier proporcionan mejores
relaciones señal/ruido, velocidades mayores y sensibilidad y resolución más elevadas.

La parte fundamental de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la

cual los iones circulan en órbitas bien definidas durante largos periodos. Tales cavidades se
construyen aprovechando el fenómeno de resonancia iónica ciclotrónica.

La resolución es espectrometría de masas de transformada de Fourier está limitada por la precisión

en la medida de la frecuencia más que por las rendijas o las medidas de campo (Plasencia, 2003, 16-
17).

Es posible alcanzar una resolución extremadamente elevada (superior a 106) dado que las medidas
de frecuencia se pueden realizar con elevada precisión.

Detectores.

Los iones procedentes del sistema acelerador llegan al detector el cual generalmente esta
constituido por un cátodo emisor que al recibir el impacto producido por las partículas cargadas
emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dínodo el cual emite varios electrones
más al recibir el impacto de cada electrón. Este proceso se repite varias veces hasta obtenerse una
cascada de electrones que llega al colector lográndose una corriente fuertemente amplificada, por
un procedimiento muy similar al que se utiliza en los tubos fotomultiplicadores. La corriente
obtenida puede amplificarse de nuevo por procedimientos electrónicos y se lleva a un sistema
registrador.

2.6.3 Determinación del peso molecular y de la formula molecular por espectrometría

de masas

Análisis cualitativo: identificación de compuestos puros

El espectro de masas de un compuesto puro proporciona diversos tipos de datos que son útiles para
su identificación. El primero es el peso molecular del compuesto y el segundo es su fórmula.
Además, el estudio de los modelos de fragmentación que se pone de manifiesto en el espectro de

57
masas a menudo proporciona información sobre la presencia de varios grupos funcionales.
Finalmente, la identidad real de un compuesto puede establecerse a menudo por comparación de
su espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta llegar a una total coincidencia.

Determinación del peso molecular

Para aquellos compuestos que pueden ionizarse por uno de los métodos descritos anteriormente,
dando el ion molecular o un ion molecular protonado, el espectrómetro de masas es una
herramienta insuperable para la determinación del peso molecular. Esta determinación,
naturalmente, requiere la identificación del pico del ion molecular, o en algunos casos, del pico (M
+ 1) + o (M - 1)+. La localización del pico en la abscisa da entonces el peso molecular con una
precisión que no puede alcanzarse por ningún otro método.

Una determinación del peso molecular por espectrometría de masas requiere conocer con
seguridad la identidad del pico del ion molecular. Por esta razón es siempre aconsejable ser
precavido, en particular con fuentes de impacto de electrones, donde el pico del ion molecular
puede estar ausente o ser pequeño en relación con los picos debidos a impurezas. Cuando existen
dudas, son particularmente útiles los espectros adicionales usando otras técnicas blandas de
ionización.

Determinación de fórmulas moleculares

Las fórmulas moleculares se pueden determinar a partir del espectro de masas de un compuesto,
siempre que el pico del ion molecular pueda ser identificado y su masa exacta determinada.
Fórmulas a partir de instrumentos de alta resolución. A menudo puede asignarse una única fórmula
para un compuesto a partir de la masa exacta del pico del ion molecular. Esta aplicación, sin
embargo, requiere instrumentos de alta resolución capaces de detectar diferencias de masas de
unas pocas milésimas de unidad de masa. Considérese, por ejemplo, las relaciones masa/carga de
los siguientes compuestos:

purina, C5H4N4 (m = 120.044); benzamidina, C7H8N2 (m = 120.069); etiltolueno, C9Hl2 (m =

120.096) y acetofenona, C8H80 (m = 120.058). Si la masa medida del pico del ion molecular es
120.070 (±0.005), entonces todos menos C7H8N2 deben excluirse como fórmulas posibles. Han sido
compiladas tablas que listan todas las combinaciones razonables de C, H, N y O para un peso
molecular que varía en la tercera o cuarta cifra decimal.

Fórmulas a partir de relaciones isotópicas.

Los datos de un instrumento de baja resolución que puede sólo discriminar entre iones que difieren
en masa por un número entero de masa pueden dar información útil sobre la fórmula de un
compuesto, con tal que sólo el pico del ion molecular sea suficientemente intenso para que su altura
y las alturas de los picos de los isótopos (M + 1)+ y (M + 2)+ puedan determinarse con precisión. El
uso de las alturas relativas de los picos de isótopos para la determinación de fórmulas moleculares
se facilita mucho con tablas. Si se puede llevar a cabo una determinación experimental con una
precisión razonable, se puede determinar fácilmente una fórmula probable. Por ejemplo, un pico
de ion molecular a la masa 84 con valores de (M + 1)+ y (M + 2)+ de 5.6 y 0.3% de M+ sugiere un
compuesto que tenga la fórmula C5H8O.

58
59
Unidad III. Métodos cromatográficos
3.1 Introducción.

Es difícil definir rigurosamente el término cromatografía, ya que se ha aplicado ese nombre a varios
sistemas o técnicas. Sin embargo, todos estos métodos tienen en común el uso de la fase
estacionaria y una fase móvil, y las fases se basan en las diferencias de velocidad de migración entre
los distintos componentes de la mezcla.

“La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de
las diferencias de velocidad a las que son transportados a través de una fase fija o estacionaria por
una fase móvil gaseosa o líquida.”

Cromatograma y su interpretación.

Un cromatograma es un grafico que representa la respuesta del detector en función del tiempo.
Muestra lo que podrá observarse cuando una mezcla y un componente desconocido se separan por
cromatografía de gases.

Los siguientes términos son los utilizados en un cromatograma típico y recomendados por la IUPAC:

 Line Base
 Pico Cromatográfico
 Base del Pico
 Área del Pico
 Altura del Pico
 Ancho del Pico
 Ancho del Pico a la mitad de la Altura

Altura del Pico.

Medida que se efectúa, para cada pico de interés, desde la línea base hasta el máximo del pico.

Los errores de malas mediciones se pueden atribuir a:

 Insuficiente Resolución.
 Variaciones en la línea base.
 Picos extremadamente pequeños.

Las desviaciones en la línea base se pueden compensar por interpolación de ésta entre el principio
y el final del pico.

Área del Pico.

Existen varias técnicas para la determinación del Área de un Pico Cromatográfico Integración
Manual

 Métodos Geométricos
 Triangulación. En esta técnica se trazan líneas tangentes a cada lado del pico. La altura se
mide desde la línea base hasta la intersección de las dos tangentes. El ancho se mide

60
 tomando la intersección de las dos líneas tangentes con la línea base. Luego se utiliza la
fórmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las limitaciones de esta técnica están en el
trazado de las líneas tangentes, un pequeño error al trazar las tangentes puede afectar la
medida de la altura.
 Altura por ancho a la mitad de la Altura.
 Métodos Mecánicos
 Planimétricos
 Corte y Pesada: Esta técnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en
una balanza analítica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operador.
Pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos
del operador, homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia
del cromatograma para no destruir el original.
 Integración Automática
 Electromecánica
 Electrónica

3.1.1 Concepto y desarrollo histórico de la cromatografía

La cromatografía es un poderoso método de separación que tiene aplicación en todas las ramas de
la ciencia. La cromatografía en columna fue denominada así, a principios del siglo XX por el botánico
ruso Mikhail Tswett. Él empleó la técnica para separar varios pigmentos vegetales, tales como
clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de estos compuestos a través de una columna
de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían como
bandas coloreadas en la columna lo que justifica el nombre que eligió para el método (del griego
chroma que significa color y graphein que significa escribir).

Las aplicaciones de la cromatografía han aumentado en gran manera en los últimos cincuenta años,
debido, no sólo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de técnicas cromatográficas, sino también
a las necesidades crecientes, por parte de los científicos, de mejores métodos para la caracterización
de mezclas complejas. El tremendo impacto de esto en la ciencia se confirmó al otorgarse el Premio
Nobel de 1952 a A.J.P. Martin y R.L.M. Synge por sus descubrimientos en este campo. Más
impresionante es, quizás, la lista de doce Premios Nobel concedidos entre 1937 y 1972, los cuales
se basaron en trabajos en los que la cromatografía tenía un papel vital.

Por este motivo, la cromatografía es un método muy utilizado y que permite la separación,
identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro
método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.

3.1.2 Conceptos de fase estacionaria y de fase móvil

Una fase fija o estacionaria se refiere a que esta se encuentra posicionada en un lugar, ya sea una
columna o en una superficie plana, mientras que la fase móvil se mueve sobre la fase estacionaria
(ya que es inmiscible con esta) o a través de ella arrastrando consigo la mezcla de analitos. Esta fase
puede ser un gas, un lí quido o un fluido supercrítico.

61
Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo
distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueve lentamente con el flujo de la fase móvil: por el contrario,
los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas
discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente

3.1.3 Clasificación de los métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se
basa en la forma en que la base estacionaria y móvil se ponen en contacto.

 Cromatografía en columna. Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable

en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya
sea por gravedad o por aplicación de presión.
 Cromatografía plana. La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel
y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad. Esta
a su vez se divide en :
 Cromatografía en papel. En la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria
(cromatografía de partición).
 Cromatografía en capa fina. En la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía
de partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.
 Una clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el tipo de
fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases. Estos son:
 Cromatografía de gases. Gas –liquido. Gas –solido.
 Cromatografía de líquidos. Liquido-liquido. Liquido- sólido. Intercambio iónico.

Exclusión molecular.

 Cromatografía de fluidos supercríticos. Cualquier sustancia que se encuentre en condiciones

de presión y temperatura superiores a su punto crítico.

Es digno de mencionarse que solamente la cromatografía de líquidos puede llevarse a cabo en

columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografía de gases como de fluidos
supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna, de tal manera que las paredes de
la columna contienen la fase móvil.

3.2 Cromatografía de gases.

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica que se emplea para separar compuestos
orgánicos volátiles, siendo el método más rápido y sencillo para la identificación de los
constituyentes de una mezcla. Implica el uso de una columna cromatográfica especial en cuyo inicio
se inyecta la muestra vaporizada que se transporta a lo largo de la columna impulsada por una fase
móvil gaseosa inerte. Los componentes de dicha muestra se separan debido a las diferencias en su
perfil de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria.

62
Tipos de cromatografía de gases.

Dependiendo del estado de la fase estacionaria, podemos distinguir:

 Cromatografía gas-liquido. La fase estacionaria es un líquido no volátil inmovilizado sobre la

superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de migración de un analito está
determinada por su distribución entre la fase liquida inmovilizada y la fase gaseosa. La
temperatura, la volatilidad del analito y su solubilidad en la fase en la fase estacionaria son
los factores que regulan su retención.
 Cromatografía gas – sólido. Se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies
sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en el caso
de la cromatografía gas – líquido. Debido a esto, la cromatografía gas – sólido es útil para la
separación de especies que no se retienen en la anterior, tales como los componentes del
aire, Sulfuro de hidrógeno, Disulfuro de carbono, Óxidos de Nitrógeno, Monóxido de
Carbono, Dióxido de carbono y gases nobles.

3.2.1 Instrumentación

Todos los elementos necesarios para realizar la cromatografía de gases están integrados en un
dispositivo llamado cromatógrafo de gases, que consta de:

 Suministrador de fase móvil gaseosa. El gas portador se mezclará con la muestra vaporizada
impulsándola por el interior de la columna cromatográfica. Los gases más empleados son:
nitrógeno, helio, argón y dióxido de carbono.
 Puerto de inyección.
 Inyector. Dispositivo que permite la introducción de la muestra vaporizada en la corriente
de gas portador. El método más común de inyección implica el uso de una microjeringilla
que inyecta la muestra líquida o gaseosa a través de un septo de goma de silicona en una
cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna. Al inyectar con
microjeringillas el sistema debe asegurar, que la muestra se vaporice en la cabeza de la
columna sin distorsión del gas portador y que la muestra ocupe la mínima longitud posible
de la columna. Esta cámara normalmente está a unos 50 ºC por encima del punto de
ebullición del componente menos volátil de la muestra para asegurar la vaporización total
de la muestra.
 Columna cromatográfica. Tanto el material de construcción de las columnas
cromatográficas como su longitud varían, pudiendo ser de acero inoxidable, vidrio, sílice
fundida o teflón y abarcando una altura de 2-60 m. A la hora de seleccionar el tipo de
columna se deben tener en cuenta varios parámetros como son el diámetro interno de la
columna, el espesor de la fase estacionaria, el tipo de muestra, el tipo de fase estacionaria
y la longitud de la columna. La temperatura óptima de la columna depende del punto de
ebullición de la muestra y del grado de separación requerido.
 Horno. Dispositivo de regulación de la temperatura en cuyo interior se dispone la columna.
La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del
grado de separación requerido.
 Detector. Dispositivo situado a la salida de la columna que permite medir de una manera
continúa una propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con la

63
 presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar. Su función básica es
producir respuestas muy rápidas a pequeñas concentraciones de soluto.

Características ideales de un detector en cromatografía de gases son:

1. Sensibilidad adecuada. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se

encuentran en el intervalo de 10−8 a 10−15 g de analito/s.
2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud.
3. Buena estabilidad y reproducibilidad.
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta al menos 400 °C.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y fácil manejo.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva
y altamente predecible para una o más clases de analitos.
8. No ser destructivo de la muestra. Los más comunes en CG comercial son:
 Detectores de conductividad térmica (TCD). Es totalmente universal y muy sencillo,
aunque no es muy sensible. Se emplea básicamente en el análisis de gases. Su baja
sensibilidad impide usarlo con columnas capilares. Los gases que salen de la columna
entran en un compartimiento en el que se encuentra un filamento caliente, cuya
temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en disipar calor, esto es, su
conductividad térmica. En el momento en que se eluye de la columna un compuesto
con diferente conductividad térmica un compuesto con diferente conductividad térmica
que el gas portador, la temperatura del filamento varía, y por tanto su resistencia
eléctrica, que es registrado en forma de aumento o disminución de la corriente.
 Detectores de ionización de llama (FID). Es el más usado, debido a que es prácticamente
universal para los compuestos orgánicos, donde es bastante sensible y tiene un
comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en
una llama formada por H2 y aire cuya conductividad eléctrica está permanentemente
registrada. En el momento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se
quema y durante la reacción de combustión se generan electrones y otras especies
cargadas que alteran la conductividad eléctrica de la llama.
 Detector de nitrógeno-fósforo. Consiste básicamente en un detector de ionización de
llama que porta un alambre de platino recubierto de NaOH o silicato de rubidio, los más
modernos, que incrementa la volatilidad de compuestos que contienen nitrógeno,
fósforo, halógenos, sulfuro, arsénico, estaño y plomo, produciendo un incremento en la
corriente de ionización y con ello un aumento de respuesta de los componentes de la
muestra que contienen esos elementos.

3.2.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CG/EM

3.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución.

Dentro de los tipos de cromatografía que se han desarrollado, y englobada dentro de las
cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de
Alta Resolución (HPLC, High Perfomance Liquid Chromatography), también denominada de Alta

64
presión. Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida o sólida
disuelta en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna
cromatográfica. Esa columna se caracteriza por encontrarse muy empaquetada, por lo que es
necesario ejercer elevadas presiones para que el proceso no se alargue excesivamente en el tiempo.

La separación de los componentes de la mezcla se efectúa gracias a interacciones de éstos con la

fase móvil y estacionaria. Dependiendo del tipo de columna y de la interacción de los solutos con la
fase estacionaria podemos distinguir:

 Cromatografía de adsorción líquido-sólido.

 Cromatografía de reparto líquido-líquido.
 Cromatografía de intercambio iónico.
 Cromatografía de exclusión molecular.

3.3.1 Instrumentación

El disolvente elegido ha de ser compatible con la muestra a analizar y ofrecer unas buenas
características de separación, para ello pueden utilizarse eluciones isocráticas, un solo disolvente o
una mezcla fija de ellos, o variar su composición a lo largo del proceso en las llamadas eluciones con
gradiente. En ambos casos se necesitan depósitos adecuados para albergar los disolventes.
Generalmente, estos reservorios se encuentran asociados a una serie filtros y mecanismos de
eliminación de gases que excluyen posibles partículas y gases que pueden afectar al proceso
cromatográfico obstruyendo la columna y/o alterando los registros.

Estos reservorios van a parar a una cámara de mezcla de disolventes y un sistema de bombeo capaz
de generar elevadas presiones. Esta bomba se caracteriza por trabajar con amplios rangos de flujo,
proporcionar una velocidad de flujo adecuada y reproducible, amortiguar los pulsos de presión y ser
resistentes a la corrosión y químicamente inertes. El sistema de bombeo más utilizado es el de pistón
recíproco o vaivén, que consiste en una pequeña cámara cilíndrica que se llena del disolvente y se
vacía por oscilación de un pistón. La asociación de una nueva bomba de pistón que opera desfasada
con la primera evita en gran medida las pulsaciones. Aún así, muchos de los equipos llevan asociados
atenuadores de pulsos.

Los disolventes impulsados por la bomba han de ser introducidos a la columna cromatográfica
gracias a un sistema de inyección. Anticipando a ésta, encontramos la llamada precoluma o
guardacolumna, columna de menor longitud, pero con las mismas características que la columna
(mismo material empaquetado y misma fase estacionaria) que tiene como objetivo protegerla de la
contaminación y alargar su vida media.

Las columnas suelen estar fabricadas en acero inoxidable. Poseen una longitud de 3-30 cm, un
diámetro interno de –10 mm y partículas empaquetadas de 5-10μm lo que les confieren un número
de platos de 40.000-60.000 por metro. Estas columnas pueden adoptar tamaños menores, junto
con su material empaquetado, en las llamadas microcolumnas, de mayor eficiencia.

La fase estacionaria en HPLC presente en la columna se ha caracterizar por ser estable y resistente
a altas presiones. Generalmente estos rellenos suelen ser inorgánicos como partículas de sílice,

65
alúmina (óxido de aluminio, Al2O3) o vidrio. En el caso de cromatografía líquido-líquido la fase
estacionaria es una película líquida que reviste el material empaquetado.

En la salida de la columna podemos encontrar un dispositivo de detección que nos identificará los
solutos presentes en la fase móvil. Han de ser sensibles a pequeñas variaciones, deben tener un
mínimo ruido y deriva, rápida respuesta en un amplio rango lineal y ser insensibles a cambios de
flujo y temperatura. Dependiendo de la naturaleza de la muestra el dispositivo de detección elegido
variará. Los detectores empleados comúnmente son aquellos que miden la absorción de radiación
UV/visible o bien los detectores electroquímicos (amperométrico, conductimétrico o
potenciométrico). Otros detectores usados pueden ser aquellos que registran el índice de refracción
o fluorescencia, pero encuentran mayores problemas ya que pueden ser menos precisos y el soluto
analizado puede no presentar las características más adecuadas para su detección.

Actualmente, el más utilizado es el espectrómetro de masas que presenta unos límites de detección
buenos y nos proporciona información tanto cuantitativa como cualitativa que permite identificar
fácilmente al analito. El principal problema que encuentra el acoplamiento de la espectrometría de
masas a la cromatografía líquida es la incompatibilidad de la fase móvil líquida con las condiciones
de alto vacío de espectrómetro, que no permite recibir los grandes volúmenes de disolvente que
acompañan al analito. El uso de columnas de menor diámetro y menor caudal, junto a los últimos
avances en espectrometría de masas, han permitido generalizar el uso de este tipo de detectores.

3.3.2 Sistema de Bombeo

La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase móvil a

través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en cabeza de columna, ya que ésta
puede variar por obstrucción de las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:

- Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil.

- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de éstas, ya que
las pulsaciones, aunque no afectan a la separación en sí, pueden contribuir al ruido de fondo
del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.
- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de caudales para
las columnas que se utilizan habitualmente varía desde los 10 l/min hasta los 10 ml/min
(columnas microbore, analíticas y semipreparativas).
- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de él depende la
reproducibilidad de los tiempos de retención.

3.3.3 Columnas y fases estacionarias

La columna

La columna es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto que es en ella

donde tiene lugar la separación; por lo tanto, resulta fundamental una correcta elección de la
columna adecuada para cada separación, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad se
nunca se obtendrán buenos resultados, aunque se disponga del mejor instrumental.

66
Las columnas más utilizadas en cromatografía de líquidos son las de relleno; estas columnas
consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo
separación que se pretende llevar a cabo. El diámetro interno varía entre 2 y 60 mm dependiendo
su utilización, a escala analítica o semipreparativa, y su longitud varía entre 5 y 30 cm.

También se encuentran hoy en día en el mercado columnas de pequeño diámetro (microbo-re), con
diámetros comprendidos entre 2 y 0,5 mm y longitudes entre 25 y 100 cm. Este tipo de columnas
permite reducir el consumo de disolventes y, por lo tanto, facilitan la posibilidad de acoplar la
cromatografía líquida a otras técnicas analíticas (fundamentalmente espectrometría de masas). Por
otro lado, se empieza a introducir la denominada cromatografía de líquidos capilar, en la que se
utilizan como columnas tubos (de sílice fundida generalmente) de un diámetro interno muy
pequeño (entre 200 y 500 m) y de gran longitud (varios metros); en este tipo de columnas, la
característica más importante es que la fase estacionaria se encuentra ligada químicamente a las
paredes del tubo, por lo que se hace innecesaria la utilización de partículas de fase estacionaria
como en los dos casos anteriores. Las características de la columna que influyen sobre su capacidad
de separación son:

- Diámetro interno
- Longitud
- Conexiones (reducciones)
- Relleno
- Tamaño de partícula del relleno

Diámetro de la columna

La elección del diámetro interno de la columna se realiza en función de la cantidad de muestra a

separar. Para las separaciones a escala analítica (algunos microgramos de muestra por inyección) se
suelen usar columnas de pequeños diámetros (1 a 6 mm) mientras que en los trabajos a escala
preparativa se superan los 10 mm de diámetro interno. Esta selección de diámetros se debe a la
pérdida de eficacia, por sobrecarga de la columna, cuando se inyecta una masa excesiva de solutos
a separar. Se ha comprobado empíricamente que en fase normal, la sobrecarga comienza a partir
de 50 g de muestra por gramo de relleno, mientras que en fase reversa es necesario sobrepasar los
100 g/gr de relleno; parece lógico, por tanto, pensar que mayores diámetros de columna,
manteniendo iguales los restantes parámetros, permitan separar mayores cantidades de muestra
sin variación de la eficacia del sistema. El inconveniente de las columnas de gran diámetro consiste
en el elevado consumo de disolventes, puesto que se necesitan flujos eleva dos para conseguir la
misma velocidad lineal de eluyente que en las de pequeño diámetro. Las columnas analíticas de más
amplio uso suelen tener 4,6 mm de diámetro interno.

Longitud de la columna

Como se puede comprobar en las ecuaciones que rigen los procesos cromatográficos, la eficacia de
la columna depende, entre otros factores es, de la longitud de la columna y, a igualdad de otros
parámetros, mayores longitudes de la columna permitirán obtener mayores eficacias.

Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la presión en cabeza
se eleva considerablemente, por lo que hay que alcanzar un compromiso, a la hora de seleccionar
la columna, entre eficacia y caída de presión. Las columnas de cromatografía líquida en ningún caso

67
pueden tener longitudes extremadamente grandes; se ha comprobado que para tamaños de
partícula de 10 a 5 m, resulta difícil conseguir empaquetar buenas columnas de longitud superior a
30 cm; para tamaños de partícula de 3 m, la longitud de la columna no podrá ser superior a 20 cm
sin riesgo de que la presión en cabeza de columna sea excesivamente elevada.

Conexiones

En los extremos de la columna se montan los sistemas de conexión para poderlas unir al detector y
a los sistemas de inyección y bombeo de eluyentes. La conexión, en este caso, es realmente una
unión reductora de compresión radial, que permite una perfecta unión del tubo de la columna con
el capilar que la conecta a los restantes dispositivos del cromatógrafo. Estas uniones no deben
presentar volumen muerto, deben permitir el paso de secciones anchas de tubo

a capilares, y deben ser fácilmente montables y desmontables.

Por otra parte, y como cierre del tubo que contiene el relleno se colocan los llamados fritados, que
son mallas con un tamaño de poro inferior al diámetro de la partícula de relleno; de esta forma, se
deja pasar al eluyente evitando que el relleno se salga de la columna.

Relleno

Todas las separaciones cromatográficas tienen lugar sobre la fase estacionaria. Las fases
estacionarias en cromatografía de líquidos, están constituidas generalmente por partículas de
materiales rígidos o semirígidos, y en la gran mayoría de los rellenos se suele utilizar sílice con este
fin, aunque también es posible encontrar rellenos basados en polímeros sintéticos.

En la mayoría de los rellenos de columnas de cromatografía líquida, la sílice utilizada realiza una de
las tres funciones siguientes:

- Superficie adsorbente. En este caso los propios grupos activos de la superficie de la sílice (grupos
silanol) son los responsables de la separación.
- Soporte de la fase estacionaria. Esta, o bien impregna la superficie de la sílice, o bien se
encuentra ligada químicamente a ella (sílice modificada químicamente).
- Actuación como substrato microporoso.

En este caso, la sílice permite la selección de moléculas en función de su tamaño. Los grandes
avances técnicos en la preparación de sílices de estructura conocida, con modificaciones químicas
en la superficie, con poros y formas controladas y con una buena granulometría, han permitido que
este material, en multitud de formas de presentación, sea el relleno más utilizado en las columnas
de cromatografía de líquidos. La sílice ha terminado por desplazar como relleno a los polímeros
sintéticos que, debido principalmente a su gran inercia química y a la facilidad de modificar
químicamente su superficie, estaban tomando un cierto auge en cromatografía líquida. En este
sentido, la sílice se está introduciendo en campos de la cromatografía líquida en los que la base del
relleno era por excelencia polimérica, como es los casos de la cromatografía de exclusión molecular
y la cromatografía de intercambio iónico. Las propiedades de la sílice que propician su utilización
como soporte se pueden resumir en:

68
- Gran resistencia mecánica. Lo que permite a las columnas empaquetadas con sílice resistir mayores
presiones de trabajo. En general, los polímeros sintéticos no permiten trabajar a presiones por
encima de los 18 Bar (1.800 psi).

- Amplia gama de formas, tamaños y diámetros de poro, lo que permite conseguir una gran variedad
de estructuras. En la actualidad, es posible preparar una sílice

prácticamente a conveniencia; así, es posible encontrar sílices esféricas, irregulares o poligonales,

lo que puede tener gran importancia en el empaquetado de la columna (presiones resultantes y
permeabilidad del relleno al paso del eluyente) y en la posterior eficacia de ésta.

- Gran variedad de sílices en cuanto a superficie específica. Este hecho, permite encontrar sílices de
gran reactividad o de relativa inercia y, por lo tanto, es posible tener una amplia gama de
capacidades de separación y de posibilidades de ligar químicamente moléculas a su superficie.

Como en el caso de la cromatografía líquido-sólido, la naturaleza de la fase estacionaria influye en

la selectividad del sistema cromatográfico. En la cromatografía de fases ligadas, la polaridad de la
fase estacionaria puede ser seleccionada entre una mayor variedad, atendiendo al grupo funcional
que se liga químicamente al soporte, cadenas cortas (C-8), cadenas largas (C-18) u otros grupos
funcionales.

Si bien es cierto que con las fases ligadas se dispone de más versatilidad en la elección de fases
estacionarias, las más habitualmente utilizadas son:

- Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.

- Cadenas con extremos amino para fase normal. Al igual que en cromatografía sólido-líquido, la
cantidad de grupos activos y la distribución de éstos sobre la superficie del soporte condicionan la
calidad de la fase estacionaria. Para las fases ligadas, existen varios parámetros indicativos de la
cantidad de grupos activos: la concentración superficial, el grado de conversión de silanoles y el
porcentaje de carbono total relativo a la superficie especifica. En todos los casos no son valores que
permitan comparar fases estacionarias aparentemente iguales, pero son un indicativo de la
actividad de la fase estacionaria.

No hay que olvidar que el soporte de la fase estacionaria juega un importante papel, no sólo por sus
características de superficie y porosidad, que influyen en la cantidad de fase ligada, sino también
porque, como ya se ha mencionado, puede presentar puntos activos de adsorción específica que
pueden modificar los resultados de retención esperados para el sistema cromatográfico; este hecho
es lógico, pues la mayor parte de los soportes para cromatografía de líquidos están basados en la
sílice que, si bien tiene la ventaja de presentar una gran resistencia mecánica, no es un soporte
inerte

La fase móvil

La fase móvil para cromatografía de fase normal recibe las mismas consideraciones que en el caso
de cromatografía sólido-líquido, utilizándose por regla general disolventes de polaridad baja (n-
hexano por lo general); también en este caso se suelen utilizar modificadores para ampliarlos rangos
de polaridad (alcoholes, cloruro de metileno, etc).

69
Es necesario hacer una puntualización en este caso; debido a que algunas de las fases estacionarias
utilizadas en este tipo de cromatografía pueden ser químicamente activas, debe cuidarse la
compatibilidad química de la fase estacionaria con las fases móviles utilizadas y con las muestras a
separar. Así, por ejemplo, cuando se utilizan columnas con fase amino ligada, es necesario extremar
las precauciones para evitar la posible presencia de cetonas y/o aldehídos, que pueden reaccionar
con los grupos amino dando bases de Schiff, siendo muy importante en este caso la pureza de los
disolventes a utilizar, que deben estar libres de compuestos que presenten grupos carbonilo.

En cromatografía de fase inversa la fase móvil vuelve a jugar un papel importante, por ser la variable
que más influye en la selectividad. En cromatografía de fase reversa, la fase móvil contiene, en la
mayoría de los casos, grandes proporciones de agua, que es sin duda el eluyente principal, junto con
un modificador orgánico que completa la composición del eluyente. Como ya se ha mencionado, la
presencia de agua permite la variación del pH de la fase móvil o la adición de otras substancias que
permiten modificar al soluto para realizar una separación concreta.

El agua es el disolvente menos fuerte para la elución de solutos en cromatografía de fase reversa,
dando origen a tiempos de retención muy elevados; por este motivo, se tiene la necesidad de utilizar
modificadores orgánicos (los más usados son metanol y acetonitrilo) que deben de cumplir las
siguientes condiciones:

a) Ser compatible con el detector utilizado.

b) Ser miscible con el agua en un amplio margen de proporciones.
c) No reaccionar ni con la fase estacionaria ni con la muestra a separar.
d) Ser poco tóxico.
e) Sus vapores no deben producir mezclas inflamables con el aire.
f) No deben impedir la detección de los solutos. El caso más frecuente de interferencia se
presenta cuando se utiliza un detector de UV, en el que muchos disolventes presentan
una absorción excesiva a longitudes de onda bajas (longitud de onda de corte).

Otro aspecto importante a considerar en las fases móviles, es la viscosidad de las mezclas
agua/modificador orgánico que, en caso de ser demasiado alta, puede dar lugar a problemas de
presión elevada en cabeza de columna, así como a ensanchamiento de los picos.

Otra de las características de la cromatografía de fase inversa, es la rapidez con la que se alcanzan
los equilibrios en el sistema cromatográfico, lo que permite obtener resultados muy reproducibles
cuando se trabaja con gradientes de polaridad de la fase móvil. La utilización de gradientes de
polaridad, permite realizar se paraciones muy complejas, siempre y cuando el instrumental permita
la realización de los gradientes con una gran precisión y reproducibilidad

3.3.4 Detectores

Detectores

Un detector para cromatografía es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una
propiedad física del eluyente, que deberá depender de la composición de éste. La detección en
cromatografía se realiza, habitualmente, en continuo, aunque es posible la utilización de colectores
de fracciones para la identificación y cuantificación de pequeñas fracciones del eluyente.

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Las características de un detector para cromatografía, son principalmente:

Características que no afectan a la eficacia de la separación.

- Respuesta.- Es la señal ofrecida por el detector ante una determinada variación de la propiedad
física del eluyente que es medida. Esta propiedad debe ser proporcional a la variación de masa
del soluto que sale de la columna o a su concentración. La respuesta de un detector suele ser
lineal (en un rango más o menos ancho según el tipo de detector), lo que implica que la señal
generada por el detector varía linealmente con la concentración o la masa de soluto que, por
unidad de tiempo, sale de la columna.
- Ruido.- Es cualquier perturbación de la señal generada por el detector y que no es originada por
la salida de un soluto de la columna. El ruido de fondo del detector, se compone a su vez de
otros dos tipos de ruido: ruido de corto alcance (perturbaciones de una frecuencia mayor que
la inversa del ancho del pico de soluto) y ruido de largo alcance (perturbaciones con una
frecuencia del mismo orden que la inversa del ancho del pico del soluto).
- Deriva.- Es la variación de la señal de base a lo largo del tiempo, que origina una variación lenta
y progresiva de la línea de base.
- Sensibilidad.- La sensibilidad se define como la mínima concentración o cantidad de soluto que
debe pasar por el detector para que la señal a que éste da lugar sea dos veces mayor que la del
ruido de fondo. Este parámetro indica la cantidad mínima de soluto que es posible detectar, y
es dependiente del ruido del detector.
- Rango dinámico.- Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce
una respuesta dependiente de la concentración de soluto a la salida de la columna. El valor
mínimo, se corresponde con la sensibilidad del detector, y el máximo, con la concentración de
soluto a partir de la cual la respuesta del detector es constante (saturación). El rango dinámico
lineal, es la zona del anterior en el que la respuesta del detector es lineal frente a la
concentración de soluto.

3.3.5 Fase Normal y Fase Inversa Instrumentación

Fase Normal

La cromatografía de fase normal o también llamada "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los
compuestos en base a su polaridad.

Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el
compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase
estacionaria.

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen
con el soluto son especificas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un solido adsorbente
(sílice o alúmina) o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que
presentan grupos funcionales de alta polaridad.

La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción
entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el
tiempo de retención.

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La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los
compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de
retención.

Fase Inversa

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de
polaridad moderada.

Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica químicamente
modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos.

Se utilizan solventes polares: Agua, acetato de etilo, acetona, etc.

El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas
de carácter polar eluyen más rápidamente.

La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones
hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un
compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.

La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente.

El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar.

Instrumentación

Si bien es cierto que para realizar una cromatografía liquida tan solo es necesario disponer de las 2
fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografía de líquidos de alta
eficiencia, debido al pequeño diámetro de las partículas de la fase estacionaria que se utilizan
requiere de la utilización de unos equipos que constituyan el cromatografo.

• Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado)

• Dispositivo de inyección

• Conducciones y conexiones

• Detector y registrador

• Columna

Sistema de suministro de fase móvil

Todos los equipos de HPLC incluyen un sistema de bombeo de fase móvil de alta presión para forzar
el paso de la fase móvil a través de una columna, cuyo relleno muy compacto es responsable de una
importante sobrepresión.

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3.3.6 Derivatización.

Los grupos polares N-H y O-H en los cuales un determinado enlace con el hidrógeno puede ser
convertido en un grupo relativamente no polar de un compuesto relativamente no volátil. El
producto resultante, puede ser menos polar, y por lo tanto más volátil, permitiendo el análisis por
medio de cromatografía gaseosa. Para este propósito se utilizan con frecuencia grupos sililo no
polares y voluminosos.

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