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MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2018

SEMINARIO 12

Piruvato Deshidrogenasa -
Ciclo de Krebs
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METABOLISMO OXIDATIVO
Utilización de la energía almacenada en los nutrientes para la generación de ATP

Entonces, ¿para qué comemos? La ingesta de alimentos constituye una necesidad

fisiológica primordial porque cuando comemos ingerimos fuentes de energía. ¿Qué
significa esto? Los alimentos son combustibles, y al quemarlos (u oxidarlos, químicamente
hablando) obtenemos energía, que conservada en forma de ATP, se utiliza para suplir las
necesidades energéticas del organismo.
En todas las células ocurren sistemas complejos de reacciones químicas
“cuidadosamente” reguladas que producen y requieren energía. Todos los procesos que
ocurren en nuestras células son procesos de transformación de energía. Los combustibles
metabólicos (glúcidos, lípidos y proteínas) son moléculas que contienen una gran cantidad
de enlaces C-C y C-H, que al romperse permiten obtener energía. Entre muchos otros,
algunos ejemplos de utilización de energía son el gradiente electroquímico que permite
crear un medio intracelular de composición diferente a la del medio externo, o el
movimiento organizado de grupos de células.
Los procesos de transformación involucrados en la utilización de la energía del
enlace químico de los combustibles pueden dividirse en tres fases: 1) obtención de
energía a partir de la oxidación de las moléculas combustibles, 2) conversión de esa
energía a una forma biológicamente útil, que es la que se encuentra en las uniones de
alta energía del ATP y 3) utilización de la energía contenida en las uniones del ATP. Las
primeras dos fases son parte del proceso de respiración celular.
Al hablar de respiración celular, nos referimos a los procesos celulares que al
oxidar los combustibles biológicos, liberan CO2, consumen oxígeno y generan ATP. Los
procesos que constituyen la respiración celular pueden dividirse en 3 fases (ver figura). En
la Fase 1 se produce la oxidación de los combustibles metabólicos con transferencia de
electrones a las coenzimas aceptoras NAD+ y FAD que se reducen a NADH y FADH2,
respectivamente. En esta Fase, la mayoría de los combustibles metabólicos (glúcidos,
ácidos grasos y muchos aminoácidos) convergen en la generación del grupo acetilo (de 2
C) activado: el acetil-CoA. En la Fase 2 ocurre la oxidación completa del grupo acetilo del
acetil-CoA a CO2 (la forma más estable del carbono) en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos (o CAT, o ciclo de Krebs, o ciclo del ácido cítrico) y también aquí la
energía se almacena principalmente como NADH y FADH2. La Fase 2 ocurre
exclusivamente en las mitocondrias. En la Fase 3, la energía obtenida a partir de la
oxidación de los combustibles (en forma de coenzimas reducidas) es convertida en la
energía de las uniones del ATP a través del proceso de fosforilación oxidativa. Los
electrones se transfieren desde el NADH y el FADH2 (las coenzimas se reoxidan) al
oxígeno, a través de la cadena de transporte de electrones. Este proceso genera un
potencial electroquímico en la forma de un gradiente de protones a través de la
membrana mitocondrial interna que puede utilizarse para la síntesis de ATP a partir de
ADP y fosfato inorgánico (Pi).

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Representación esquemática de las fases de la respiración celular

La velocidad de las reacciones involucradas en la oxidación de los combustibles

está coordinada en forma ajustada con la velocidad de utilización del ATP por un
mecanismo de retroalimentación (feedback). Como consecuencia de este mecanismo de
regulación, los combustibles que no se van a utilizar inmediatamente se almacenan en
vez de oxidarse.
Se denominan vías catabólicas a las reacciones metabólicas a través de las cuales
los combustibles ingeridos o almacenados son degradados secuencialmente para obtener
energía. Las reacciones catabólicas resultan generalmente en la conversión de moléculas
grandes y complejas en moléculas pequeñas y simples (finalmente a CO 2 y H2O), en la
producción de energía y generalmente son reacciones de oxidación). La única vía que
puede generar ATP sin consumo de oxígeno es la glucólisis anaeróbica. Por el contrario,
las vías metabólicas involucradas en la biosíntesis de macromoléculas se denominan vías
anabólicas y generalmente resultan en la síntesis de moléculas grandes y complejas a
partir de precursores pequeños. A diferencia de las reacciones catabólicas, los procesos
anabólicos son reductivos (reacciones de reducción) y consumen energía.
Los ácidos grasos son el principal combustible metabólico del organismo.
Luego de una ingesta rica en glúcidos (por ejemplo, pastas, pan, azúcar, o papas), su
exceso se almacena en las unidades glucosilo del glucógeno. Sin embargo, esta forma de
almacenamiento es relativamente limitada, de manera que el exceso de glúcidos, que
sobrepasa la capacidad de ser convertido en glucógeno, se transforma en triacilglicéridos
(“depósitos lipídicos”) que se almacenan en el tejido adiposo. Obviamente, también el
exceso de lípidos de la dieta se almacena de esta forma.
Entre las comidas se liberan ácidos grasos de estos depósitos, circulan por la
sangre unidos a albúmina y se oxidan a acetil-CoA en el músculo, hígado y muchos otros
tejidos, por la vía de la -oxidación. Uno de los principales destinos metabólicos del acetil-
CoA es el tema de esta clase. Las vías de oxidación de ácidos grasos utilizan NAD+ y
FAD como aceptores de electrones.
Todas las células requieren ATP en forma continua. Sin embargo, el aporte de
combustibles para obtener energía no es un proceso continuo. La disponibilidad constante
de combustibles a pesar de la discontinuidad de las ingestas alimenticias y de la variación
en la velocidad de su utilización se denomina homeostasis metabólica y se logra a
través de la regulación hormonal de las vías de almacenamiento y de movilización de
combustibles metabólicos, principalmente mediada por las hormonas metabólicas,
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esencialmente la insulina y las hormonas contrarregulatorias de la insulina: el glucagon, la
adrenalina y el cortisol.
La glucosa tiene un rol central en la homeostasis metabólica debido a que el
cerebro y algunos otros tejidos no pueden usar ácidos grasos como combustibles
metabólicos. Los niveles sanguíneos de glucosa en personas sanas se mantienen en
alrededor de 80 mg%. Niveles inadecuados de insulina o resistencia de los tejidos a los
efectos de la insulina ocasionan la hiperglucemia característica de la Diabetes Mellitus.
El ciclo de Krebs constituye la etapa intermedia del metabolismo. Además de ser la
vía final de oxidación de los combustibles metabólicos, también provee de intermediarios
para procesos anabólicos. Este rol central en el metabolismo hace de la comprensión de
su funcionamiento y regulación, un tema clave para el estudio del metabolismo normal y
de su alteración en diferentes patologías.

PIRUVATO: ¿DE DONDE PROVIENE Y CUÁL ES SU DESTINO METABÓLICO?

Antes de empezar a hablar en detalle del ciclo de Krebs vamos a analizar primero
una de las reacciones que generan acetil-CoA. Nos referimos a la reacción de
descarboxilación oxidativa del piruvato, catalizada por el complejo de la piruvato
deshidrogenasa. Esta reacción NO FORMA PARTE DEL CICLO DE KREBS pero la
mayor parte de los libros de texto la incluyen en esta unidad, posiblemente porque no
forma parte de ninguna otra vía metabólica. Esta reacción también ocurre en las
mitocondrias y el complejo enzimático que la cataliza es similar a uno que interviene en
una de las reacciones del ciclo, como veremos más adelante. Sin embargo, no
confundirse, esta reacción NO ES LA UNICA FUENTE DE acetil-CoA para el ciclo de
Krebs y su importancia como fuente de acetil-CoA depende de cada tejido. El piruvato es
el producto final de la glucólisis aeróbica que ocurre en el citosol y también de la
degradación de algunos aminoácidos como alanina, serina y cisteína. El destino del
piruvato depende del tejido en el que se produce y de su estado metabólico. Además de
ser sustrato del complejo de la piruvato deshidrogenasa, el piruvato puede ser utilizado en
otras vías metabólicas como por ejemplo: a) transaminación a alanina, b) carboxilación
para generar oxaloacetato (sustrato gluconeogenético) y c) reducción a lactato (glucólisis
anaeróbica).

PIRUVATO DESHIDROGENASA
Como ya hemos dicho, el piruvato se transforma en acetil-CoA por
descarboxilación oxidativa, en una reacción catalizada por un complejo multienzimático
denominado piruvato deshidrogenasa. La reacción es la siguiente:

Piruvato + NAD+ + CoA-SH acetil-CoA + CO2 + NADH + H+ Gº’= -8 kcal/mol

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Esta enzima se localiza exclusivamente en mitocondrias, en altas concentraciones
en tejidos como el músculo cardíaco y el riñón. Dado el alto valor negativo del Gº’ de la
reacción, en condiciones fisiológicas la reacción es esencialmente irreversible, y este
hecho es la principal razón por la cual la conversión neta de ácidos grasos a
carbohidratos no puede ocurrir en nuestro organismo.
El peso molecular del complejo enzimático de riñón, corazón o hígado varía entre 7
y 8,5 x 106 y en mamíferos consta de tres tipos diferentes de subunidades catalíticas:

Número de Tipo Peso Estructura

subunidades Molecular
20 ó 30 piruvato deshidrogenasa (E1) 154.000 22
tetrámero
60 dihidrolipoil transacetilasa (E2) 52.000 idénticas
6 dihidrolipoil deshidrogenasa (E3) 110.000 2
dímero

El complejo de la piruvato deshidrogenasa está compuesto por tres actividades

enzimáticas, denominadas: piruvato deshidrogenasa propiamente dicha (E1), dihidrolipoil
transacetilasa (E2) y dihidrolipoil deshidrogenasa (E3). Cinco coenzimas o grupos
prostéticos participan en la reacción de la piruvato deshidrogenasa: pirofosfato de tiamina,
ácido lipoico, coenzima A, FAD y NAD+. La E1 tiene covalentemente unido pirofosfato de
tiamina, la E2 tiene covalentemente unido ácido lipoico y la E3 tiene covalentemente
unido FAD.
En las siguientes figuras se indican las estructuras del pirofosfato de tiamina y del
ácido lipoico y su modificación en la reacción catalizada por el complejo de la piruvato
deshidrogenasa.

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Mecanismo de la reacción
1) El piruvato interactúa con el pirofosfato de tiamina de la subunidad piruvato
deshidrogenasa (E1) y sufre una descarboxilación convirtiéndose en un grupo hidroxietilo.
2) A continuación, se transfiere el grupo acetilo y 2 electrones al grupo lipoico
unido a la dihidrolipoil deshidrogenasa (E2) para formar el acetil-tioéster del ácido lipoico
en su forma reducida.
3) En el siguiente paso, se transfiere el grupo acetilo desde el ácido lipoico a la
coenzima A. Noten que en ambos casos se trata de tioésteres.
4) El ácido lipoico reducido es reoxidado en una reacción catalizada por la
dihidrolipoil deshidrogenasa (E2) que cataliza la transferencia de dos átomos de
hidrógeno del ácido lipoico reducido a la coenzima FAD, su grupo prostético.
5) El último paso consiste en la transferencia de un ion hidruro al NAD +,
regenerando la forma oxidada del FAD. El complejo se encuentra ahora en condiciones
de producir la transformación de una nueva molécula de piruvato.

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De la descripción del mecanismo de la reacción se desprende que existe una activa
participación de grupos tioles en el mecanismo catalítico de la enzima y por lo tanto
agentes que oxiden o formen complejos los grupos tioles serán potentes inhibidores del
complejo enzimático, por ejemplo, el arsenito.

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD PIRUVATO DESHIDROGENASA

La actividad del complejo de la piruvato deshidrogenada presenta dos tipos de
regulación. En primer término, dos de los productos de la reacción, el acetil-CoA y el
NADH la inhiben en forma alostérica. Por otra parte, el complejo existe en dos formas:
una forma activa (desfosforilada) y otra forma inactiva (fosforilada). La inactivación del
complejo es catalizada por una proteína quinasa dependiente de ATP-Mg2+ que está
fuertemente unida al complejo. La reactivación del complejo está catalizada por una
fosfoproteína fosfatasa que cataliza la desfosforilación del complejo en forma dependiente
de Mg2+ y de Ca2+. Tres residuos diferentes en la subunidad  de la piruvato
deshidrogenasa se fosforilan por la proteína quinasa, pero la fosforilación de solo uno de
ellos está relacionada con la actividad del complejo. La regulación diferencial de la
quinasa y de la fosfatasa es la clave de la regulación de la actividad del complejo.
La formación de acetil-CoA está coordinada con la velocidad de utilización del ATP.
Esto es consecuencia del efecto que tienen en su actividad las variaciones en las
concentraciones de ADP, piruvato, CoA-SH, NAD+, acetil-CoA y Ca2+ intramitocondrial.
Todos estos compuestos regulan la conversión de la enzima a la forma inactiva
(fosforilada). La quinasa es inhibida por ADP, cuyos niveles aumentan cuando aumenta el
consumo de ATP. Esta inhibición mantiene a la piruvato deshidrogenasa en la forma
activa, no fosforilada. En algunos tejidos, el aumento de la concentración de Ca 2+
intramitocondrial, que estimula la fosfatasa, contribuye al incremento de la forma
desfosforilada y, por lo tanto, la forma activa. El acetil-CoA y el NADH, productos de la
reacción, inhiben a la forma desfosforilada (activa) de la enzima, y también activan a la
quinasa, llevando a un desplazamiento del complejo a su forma inactiva. Además, la CoA-
SH y el NAD+ inhiben a la quinasa. Por lo tanto, cuando se produce un aumento en las
relaciones NADH/NAD+ o acetil-CoA/CoA-SH (como por ejemplo durante la -oxidación
de ácidos grasos), la actividad del complejo enzimático disminuye marcadamente.
Además, el piruvato es un poderoso inhibidor de la quinasa y, por lo tanto, en presencia
de altas concentraciones de piruvato, la quinasa estará inhibida y el complejo tendrá su
máxima actividad. Finalmente, se ha demostrado que la administración de insulina puede
activar a la piruvato deshidrogenasa del tejido adiposo y que las catecolaminas (como la
adrenalina) pueden activar a la enzima del tejido cardíaco. Los mecanismos aún no están
completamente aclarados, pero podría estar involucrada una alteración en la distribución
intracelular de calcio, que afecta a la fosfoproteína fosfatasa. Estos efectos hormonales no
están mediados directamente por alteraciones en los niveles de AMPc dado que tanto la
quinasa como la fosfatasa del complejo son independientes de AMPc.

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En conclusión, la actividad del complejo enzimático aumenta cuando se requiere un

aporte de acetil-CoA al CAT o cuando aumenta la concentración de sus sustratos, aunque
en ese último caso, el destino final del acetil-CoA no será únicamente el ciclo.

Acetil-CoA
Como ya dijimos, la mayor parte de las principales vías catabólicas genera la
unidad de dos carbonos del acetil-CoA. El catabolismo de los glúcidos almacenados o
ingeridos, a través de la vía glucolítica, el de los ácidos grasos de cadena larga
provenientes de la lipólisis de los triacilglicéridos a través de la -oxidación, la oxidación
de cuerpos cetónicos y de etanol o el catabolismo de ciertos aminoácidos producto de
proteólisis, luego de su transaminación o desaminación y posterior oxidación proveen
precursores para la formación de acetil-CoA.

En la figura se muestra la estructura de la coenzima A (CoA-SH). Es un nucleótido

que se compone de -mercaptoetilamina, la vitamina ácido pantoténico y un nucleótido de
adenina, adenosina 3’fosfato 5’-difosfato. Su grupo tiol (-SH) se encuentra reducido y está

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involucrado en muchas reacciones de transferencia de grupos acilo en las que la CoA-SH
alternativamente funciona como el aceptor y luego el dador de la función acilo.
En muchas vías metabólicas, los intermediarios son compuestos donde participa la
CoA-SH, por ejemplo, en la -oxidación de ácidos grasos y en la degradación de
aminoácidos ramificados. Como muchos otros nucleótidos, los derivados de la CoA-SH no
se transportan libremente a través de las membranas celulares, sino que lo hacen a
través de transportadores o mecanismos específicos. También es importante señalar que
el enlace tioéster del acetil-CoA es un enlace rico en energía, y por lo tanto estos
compuestos pueden servir como dadores eficientes de grupos acilo en reacciones de
transferencia de acilo.
En la síntesis de acetil-CoA catalizada por la enzima acetato tioquinasa debe
utilizarse una molécula de ATP y la reacción se produce con gasto de 2 enlaces de alta
energía:
acetato + CoA-SH + ATP acetil-CoA + AMP + PPi

Los destinos metabólicos del acetil-CoA generado en las mitocondrias pueden ser:
a) oxidación completa del grupo acetilo en el CAT, con generación de energía.
b) conversión a cuerpos cetónicos (en determinadas situaciones metabólicas y
exclusivamente en el hígado): acetoacetato y -hidroxibutirato.
c) transferencia de acetilos al citosol y la subsecuente biosíntesis de moléculas
complejas como ácidos grasos de cadena larga y esteroles.

CICLO DE LOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS (CAT) O CICLO DE KREBS O

CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO
Como ya mencionamos, en la mayoría de las vías de oxidación de combustibles
metabólicos se produce acetil-CoA. Su destino principal es la oxidación completa a CO2
en una serie de reacciones oxidativas cíclicas, denominadas ciclo de los ácidos
tricarboxílicos (CAT). También se lo conoce como ciclo de Krebs, en homenaje al
investigador que postuló las características esenciales del ciclo en el año 1937. Todas las
enzimas del ciclo se localizan en la mitocondria, lo que coincide con la localización del
complejo de la piruvato deshidrogenasa y de las enzimas de la β-oxidación, las dos
fuentes principales de acetil-CoA. Una de las funciones principales del ciclo es la
generación de equivalentes de reducción, que se utilizan para generar energía (ATP), en
la secuencia de transporte de electrones y fosforilación oxidativa, procesos que también
ocurren en las mitocondrias.
La oxidación del acetil-CoA ocurre en cuatro reacciones que transfieren electrones
a las coenzimas aceptoras NAD+ o FAD. En otras reacciones del ciclo se rearreglan los
enlaces para facilitar esta transferencia. Inicialmente la porción acetilo del acetil-CoA se
combina con el intermediario de cuatro carbonos, el oxaloacetato, para formar citrato (6
carbonos). Un rearreglo subsecuente de enlaces en el citrato es seguido por dos
descarboxilaciones oxidativas. Estas reacciones transfieren los electrones al NAD + y
liberan 2 carbonos como 2 CO2. En el siguiente paso, se genera un enlace de alta energía
del GTP por un mecanismo de fosforilación a nivel de sustrato. En la porción remanente
del ciclo hay dos reacciones de transferencia electrónica adicionales y se regenera el
oxaloacetato. El proceso completo ocurre con la conservación de la mayor parte de la
energía de los enlaces químicos del grupo acetilo dando como productos finales 3 NADH,
1 FADH2 y 1 GTP. Aproximadamente 2/3 del NADH y del FADH2 generados en todas las
vías de oxidación de combustibles provienen del CAT. La velocidad del ciclo está
fuertemente coordinada a la velocidad de utilización de ATP a través de la regulación de
enzimas individuales por compuestos relacionados con el ATP, por el estado de reducción
del NAD+ y por la concentración mitocondrial de Ca2+.
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OXIDACIÓN DE ACETIL-CoA EN EL CICLO DE LOS ACIDOS

TRICARBOXÍLICOS
La primera reacción del CAT involucra la condensación del grupo acetilo con la
función α-ceto del ácido dicarboxílico oxaloacetato, para formar citrato, un intermediario
de 6 carbonos. Esta reacción es catalizada por la enzima citrato sintasa que se localiza
en la matriz mitocondrial. Es una reacción altamente exergónica (Gº’= -9 kcal/mol) que
se encuentra desplazada hacia la formación del citrato, considerablemente desplazada
del equilibrio en condiciones fisiológicas, lo que hace a este paso un candidato ideal para
la regulación. Sin embargo, no se ha demostrado que la enzima tenga reguladores
alostéricos. El regulador principal de la enzima sería el aporte de sus sustratos: acetil-CoA
y oxaloacetato.

En el siguiente paso, catalizado por la enzima aconitasa, se forma isocitrato por la

transferencia de un grupo hidroxilo a un carbono adyacente, que posee un enlace C-H.
Esta reacción involucra la generación de un intermediario unido a la enzima, el cis-
aconitato. En el equilibrio existe un 90% de citrato, 3% de cis-aconitato y un 7% de
isocitrato. Por lo tanto, en el equilibrio, predomina el citrato. Aunque la reacción no
requiere cofactores, si requiere hierro (Fe2+) y existe evidencia de que éste estaría
involucrado en un centro Fe-S, componente esencial de la actividad hidratasa de la
aconitasa.

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La isocitrato deshidrogenasa cataliza la primera reacción de deshidrogenación

del ciclo. El isocitrato se convierte en -cetoglutarato en una reacción de descarboxilación
oxidativa. En este paso del ciclo se produce el primero (de los dos) CO 2 y se genera el
primero (de los tres) NADH + H+.

La enzima requiere NAD+ como aceptor de los equivalentes de reducción. Si bien

existe otra actividad de isocitrato deshidrogenasa en el citosol que requiere NADP +, no es
ésta la que participa del ciclo y su función en el citosol es la de proveer equivalentes de
reducción para procesos reductivos citosólicos. El equilibrio de la reacción está muy
desplazado hacia la formación de -cetoglutarato, con un Gº'= -5 kcal/mol. La enzima
tiene un peso molecular de 380.000 y está constituida por 8 subunidades idénticas. Se
requiere un metal divalente (Mn2+ o Mg2+) para la descarboxilación de la posición β del
isocitrato. La enzima se activa por ADP y en algunos casos por AMP y se inhibe por ATP
y NADH. Por lo tanto, se inhibe en condiciones de alta disponibilidad de energía (alta
relación ATP/(ADP + Pi) y NADH/NAD+). En situaciones de baja energía, la actividad de la
enzima se estimula, lo que permite acelerar la generación de energía por el ciclo.

La conversión de -cetoglutarato a succinil-CoA es catalizada por el complejo

multienzimático de la -cetoglutarato deshidrogenasa que está compuesto por 3
actividades enzimáticas diferentes: -cetoglutarato deshidrogenasa, dihidrolipoil
transuccinilasa y dihidrolipoil deshidrogenasa. Su peso molecular es de varios millones de
daltons y pertenece a una familia de complejos similares que descarboxilan
oxidativamente al -cetoglutarato, al piruvato, al -cetobutirato y a los -cetoácidos de los
aminoácidos de cadena ramificada (valina, leucina e isoleucina).

-cetoglutarato succinil-CoA
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Este complejo es casi idéntico al de la piruvato deshidrogenasa en cuanto al tipo de
reacción que cataliza y a algunas de sus características estructurales. También en este
caso, el pirofosfato de tiamina, el ácido lipoico, la CoA-SH, el FAD y el NAD+ participan del
mecanismo catalítico. El equilibrio está desplazado hacia la formación de succinil-CoA con
un Gº’= -8 kcal/mol. En esta reacción se genera la segunda molécula de CO 2 y el
segundo equivalente de reducción del ciclo (NADH + H+). El otro producto, el succinil-
CoA, es un ejemplo de tioéster rico en energía, similar al acetil-CoA. A diferencia del
complejo de la piruvato deshidrogenasa, la actividad de este complejo no está regulada
por fosforilación. Los nucleósidos trifosfato ATP y GTP, NADH y succinil-CoA inhiben su
actividad, mientras que el aumento en la concentración de Ca2+ lo activa. La energía del
enlace tioéster del succinil-CoA se conserva en una reacción de fosforilación a nivel de
sustrato en el siguiente paso del ciclo. Nota: la “fosforilación a nivel de sustrato” consiste
en la formación de un nuevo enlace de fosfato de alta energía en una reacción en la que
no participa directamente el oxígeno.

La reacción catalizada por la succinil-CoA sintetasa o succinato tioquinasa

convierte el succinil-CoA en succinato y resulta en la fosforilación del GDP para generar
GTP. La reacción es libremente reversible con un Gº’= -0,7 kcal/mol.

Dada la presencia de la nucleósido difosfato quinasa, el grupo -fosfato del GTP

puede generar ATP por transferencia al ADP.
NDQ (Mg2+)
ADP + GTP ATP + GDP

El succinato se oxida a fumarato en la reacción catalizada por la succinato

deshidrogenasa. Se transfiere un electrón de cada grupo metileno adyacente del
succinato a un FAD unido a la succinato deshidrogenasa, formándose entonces el doble
enlace del fumarato.

Gº’ = 0 kcal/mol

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Del FAD reducido unido a la enzima, los electrones pasan a la cadena de
transporte de electrones. La enzima, compuesta por dos subunidades, está fuertemente
unida a la membrana mitocondrial interna. La mayor de las subunidades contiene el sitio
de unión del sustrato, el FAD covalentemente unido a una lisina, varios átomos de hierro
no-hémico y de azufre lábiles, mientras que la subunidad menor contiene hierro no-
hémico y azufre lábil. Esta enzima es un ejemplo típico de una proteína hierro-azufre en la
cual el hierro no-hémico sufre un cambio de valencia durante la remoción de los
electrones y de los protones del succinato y la subsecuente transferencia de estos
equivalentes de reducción por el FAD covalentemente unido a la cadena de transporte de
electrones a nivel de la coenzima Q-citocromo b. La succinato deshidrogenasa es inhibida
fuertemente por malonato y oxaloacetato y activada por ATP y succinato. Dada su
similitud estructural con el succinato, el malonato es un inhibidor competitivo de la enzima.

En el siguiente paso del ciclo, el fumarato se hidrata para formar L-malato, en una
reacción catalizada por la enzima fumarasa. Un grupo OH- y un protón del agua se
agregan al doble enlace del fumarato transformándolo en malato. La fumarasa es
estereoespecífica para la forma trans del sustrato (la forma cis, el maleato o ácido
maleico, no es sustrato de esta enzima) y el producto de la reacción es solamente L-
malato (no su isómero, el D-malato). La reacción es libremente reversible en condiciones
fisiológicas.

La última reacción del ciclo, catalizada por la malato deshidrogenasa, genera el

último (de tres) de los equivalentes de reducción como NADH + H +. El grupo alcohol del
malato se oxida a grupo ceto cediendo sus electrones a la coenzima. En el equilibrio
predomina el malato, dado que para esta reacción el Gº’= + 7,0 kcal/mol. La reacción es
por lo tanto fuertemente endergónica en la dirección de formación de oxaloacetato. Sin
embargo, las reacciones siguientes catalizada por la citrato sintasa y otras, permiten la
formación del oxaloacetato pues mantienen sus niveles muy bajos, ya que es utilizado en
las siguientes reacciones. Además, el NADH producido se oxida rápidamente en la
cadena de transporte de electrones.

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El oxaloacetato que es imprescindible para la oxidación del acetil-CoA siempre se
regenera: en cada ciclo, 2 carbonos se incorporan en la forma del grupo acetilo, 2 se
eliminan como CO2, y la unidad de 4 carbonos está presente en el succinato, fumarato,
malato y oxaloacetato.

Es importante destacar que la secuencia de las últimas reacciones del CAT:

oxidación por formación de un doble enlace, adición de agua al doble enlace y oxidación
del alcohol resultante a cetona, se encuentra en muchas vías metabólicas tales como la
oxidación de los ácidos grasos y de aminoácidos ramificados.

Coenzimas
Diferencias entre NAD+ y FAD
En la oxidación del succinato a fumarato y en la oxidación del lipoato reducido a
lipoato disulfuro, el FAD es el aceptor de electrones. En las otras oxidaciones esa función
la cumple el NAD+. ¿Por qué? Estas coenzimas tienen diferentes propiedades y cumplen
funciones diferentes.

Las diferencias en la estructura química de las dos coenzimas determinan que

ambas cumplan roles fisiológicos diferentes. El FAD puede aceptar electrones individuales
(H•) y formar un intermediario semi-reducido con un electrón. Por lo tanto, participa en
reacciones donde se transfieren electrones individuales desde dos átomos diferentes tales
como los dos C-H adyacentes en el succinato o los dos grupos SH del ácido
dihidrolipoico. El NAD+ se reduce luego de aceptar un ión hidruro (H-) en reacciones tales
como la conversión de un alcohol a cetona.
La forma radical libre del FAD, con un electrón extra, es muy reactiva y el FADH•
puede perder su electrón por exposición a agua o por iniciación de reacciones en cadena.
Sin embargo, esto no ocurre porque el FADH• permanece unido fuertemente (a veces
covalentemente) a la enzima mientras acepta y transfiere electrones a otro grupo de la
enzima. El FADH2 en la succinato deshidrogenasa está covalentemente unido y no se
disocia de la enzima que se encuentra en la membrana mitocondrial interna donde los
electrones del FADH2 son cedidos a la coenzima Q, un intermediario de la cadena de
transporte de electrones. Todas las otras enzimas del CAT se encuentran en la matriz
mitocondrial. A diferencia del FAD, el NAD+ está generalmente libre en solución, se une a
la deshidrogenasa y acepta electrones y luego se libera y difunde. Por lo tanto, el NAD+ y
el NADH funcionan más como sustratos y productos que como coenzimas. Esta
característica le permite al NADH ser un regulador de la función celular. El NADH
generado por una deshidrogenasa puede inhibir a otra si no es reoxidado por la cadena
de transporte de electrones. La regulación del ciclo por la relación NADH/NAD + es parte
del mecanismo que permite coordinar la oxidación de combustibles con la utilización de
ATP.

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Coenzima A
La CoA-SH es una coenzima de acilación y participa en reacciones en las que se
forma un enlace tioéster con un grupo acilo (acetil-CoA, succinil-CoA). El carbono
carbonílico, el carbono α y el carbono β del grupo acilo se activan en diferentes tipos de
reacciones por la formación del enlace tioéster con el grupo sulfhidrilo de la coenzima A.
La hidrólisis de este enlace tiene un alto valor negativo de Gº’ (aprox. -13 kcal/mol). El
enlace tioéster es mucho menos estable que un enlace éster, pues el azufre no comparte
sus electrones en estados de resonancia. La energía liberada por la ruptura del tioéster
cumple dos funciones en el CAT: provee la energía para la generación de GTP y hace
que la entrada del acetil-CoA al ciclo sea más favorable termodinámicamente.
En la condensación de la porción acetilo con oxaloacetato para formar citrato, la
ruptura del enlace tioéster del acetil-CoA ocurre con un Gº’= -7,7 kcal/mol. Cuando este
valor negativo se agrega al gran valor positivo para la reacción de la malato
deshidrogenasa, se obtiene un valor neto cercano a 0 para la conversión de malato a
citrato. Por lo tanto, la entrada del acetil-CoA al ciclo se facilita por la ruptura del enlace
tioéster.
Dado que el enlace tioéster del acetil-CoA tiene un Gº’ de hidrólisis de -13 kcal, su
formación requiere energía, como ya se mencionó. La energía es aportada por la
descarboxilación oxidativa del piruvato en la reacción catalizada por el complejo de la
piruvato deshidrogenasa o de reacciones de oxidación y ruptura de enlaces C-C de ácidos
grasos o aminoácidos.
El acetato también puede convertirse directamente en acetil-CoA utilizando la
energía aportada por ATP, en una reacción catalizada por la acetato tioquinasa, como ya
se describió.

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BALANCE ENERGÉTICO DEL CICLO DE KREBS
¿Qué transformación neta ocurre en el ciclo?
En primer lugar, el grupo acetilo de dos carbonos del acetil-CoA se oxida
generando 2 moléculas de CO2. Una función del ciclo es conservar la energía de esta
oxidación en forma de coenzimas transportadoras de electrones en estado reducido. El
balance global del ciclo muestra que el grupo acetilo funciona como fuente de carbonos
para el CO2 y como fuente de electrones para la transferencia a las coenzimas.

Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O

2 CO2 + CoA-SH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP

El acetil-CoA es el combustible del CAT, su oxidación no involucra O 2

directamente, y se lleva a cabo removiendo electrones como hidrógeno o ión hidruro y
agregando H2O. Los 4 oxígenos de los 2 CO2 provienen del grupo carbonilo del acetil-
CoA, 2 H2O. Las diferentes reacciones del ciclo involucran el rearreglo de los carbonos y
los electrones donados por el grupo acetilo de modo que los mismos carbonos y
electrones no entran y salen del ciclo en una sola vuelta.

En el esquema anterior se muestran (marcados en rojo) los C que provienen del

acetil-CoA y, como se observa, en la primera vuelta del ciclo, estos C no abandonan el
ciclo como CO2 sino que quedan en el oxaloacetato.

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El rendimiento completo en compuestos que contienen energía es de 3 NADH, 1

FADH2 y 1 GTP. Las reacciones rédox son catalizadas por 4 deshidrogenasas: isocitrato
deshidrogenasa, -cetoglutarato deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa y malato
deshidrogenasa. El enlace de alta energía del GTP se origina en una reacción de
fosforilación a nivel de sustrato catalizada por la succinato tioquinasa o succinil-CoA
sintetasa.
Los 4 equivalentes de reducción se usan subsecuentemente para generar energía.
Como se discutirá más adelante, la oxidación de cada mol de NADH + H + resulta en la
formación de 2,5 moles de ATP mientras que la de FADH2 en 1,5.
Por lo tanto la ganancia neta para la oxidación de cada mol de acetil-CoA en el
CAT es de 10 moles de ATP.

Tres reacciones del ciclo (las catalizadas por la citrato sintasa, la isocitrato
deshidrogenasa y la -cetoglutarato deshidrogenasa) tienen valores muy negativos de
Gº’. En condiciones fisiológicas, estas reacciones son irreversibles debido a sus altos
valores (negativos) de Gº’ y porque las enzimas involucradas catalizan las reacciones
inversas muy lentamente. Estas reacciones realizan la contribución principal al elevado
Gº’ negativo del ciclo.

Las reacciones del ciclo son extremadamente eficientes en la conversión de la

energía a partir de las uniones químicas del acetato. La energía total contenida en el
acetato, liberada como calor en la combustión completa de un mol de acetato a CO 2 en un
calorímetro, es de 243 kcal/mol. Para activar el acetato a acetil-CoA se requiere el
equivalente a dos enlaces de alta energía o alrededor de 15 kcal/mol, de modo que la
energía máxima que podría obtenerse a partir de la oxidación del acetato en condiciones
aisladas es de 228 kcal/mol de acetato. Los productos del ciclo almacenan alrededor de
206 kcal/mol, por lo tanto, las reacciones del ciclo son capaces de conservar
alrededor del 90% de la energía accesible de la oxidación del acetil-CoA.

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Gº
Enzima (kcal/mol)
Citrato Sintasa -7,7
Aconitasa + 1,5
Isocitrato Deshidrogenasa -5,3
-Cetoglutarato Deshidrogenasa -8,0
Succinato Tioquinasa -0,7
Succinato Deshidrogenasa 0
Fumarasa 0
Malato Deshidrogenasa + 7,1

REGULACIÓN DEL CICLO DE LOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS

La oxidación del acetil-CoA y la conservación de la energía en las coenzimas
reducidas que permite la generación de ATP son esenciales en todos los tejidos que
contienen mitocondrias. La velocidad de utilización de ATP es, por lo tanto, la fuerza
fisiológica primaria impulsora del ciclo. Existen dos señales principales de la velocidad de
utilización de ATP: a) el estado de fosforilación de los nucleótidos de adenina, que se
refleja en los niveles de ATP y ADP, y b) el estado de reducción del NAD +, reflejado en la
relación NADH/NAD+. Dentro de la célula y aún dentro de la mitocondria, la suma de la
concentración de nucleótidos de adenina (AMP, ADP y ATP) y la de NAD+ (NAD+ y
NADH) son relativamente constantes. Sin embargo, la velocidad de interconversión de los
nucleótidos de adenina y la velocidad de oxidación y reducción de las coenzimas varían
considerablemente entre distintas situaciones metabólicas. Por lo tanto, un aumento en la
utilización de ATP resultaría en una pequeña disminución en sus niveles y un aumento en
la concentración de ADP. Análogamente, un aumento en la oxidación de NADH por la
cadena de transporte provocaría un aumento en el contenido de NAD+ y una disminución
en el de NADH.
Dado que las deshidrogenasas principales son dependientes del aporte continuo de
+
NAD y de FAD, sus actividades están estrictamente controladas por la cadena
respiratoria que es responsable de su oxidación y que está obligatoriamente acoplada a la
generación de ATP. De este modo, la actividad del ciclo es muy dependiente del control
respiratorio, que a su vez está afectado por el aporte de ADP + Pi y de oxígeno. Un
agente inhibitorio o una condición metabólica que interrumpa el aporte de oxígeno, el
aporte continuo de ADP o la fuente de equivalentes de reducción, inhibirán la actividad del
ciclo. Este tipo de control se conoce como “control grueso”. Hay también un número de
interacciones mediadas por efectores entre intermediarios, nucleótidos y las enzimas del
ciclo que pueden ejercer un “control fino” de su actividad.
Los conceptos generales con respecto a los mecanismos de regulación que se
aplican a todas las vías metabólicas pueden ser aplicados también en este caso. La
regulación de la velocidad de una vía metabólica ocurre sobre las enzimas que catalizan
los pasos limitantes de la velocidad, o sea los más lentos. Se puede hacer una analogía
considerando la velocidad promedio en una autopista cuando en alguna zona hay un
bloqueo que sólo deja libre un carril. En ese caso, el tránsito en esa zona se hace más
lento y esta disminución de la velocidad se transmite hacia el principio de la autopista.
Suponiendo que el lugar del bloqueo constituya la etapa limitante de la velocidad, una
modificación en el mismo, por ejemplo, la apertura de un nuevo carril para el tránsito,
aumentará significativamente la velocidad global en la autopista. En forma semejante, la

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velocidad de toda una vía metabólica está determinada por la de la reacción más lenta y
por lo tanto la regulación de la actividad de la vía ocurre principalmente a ese nivel.
Otro de los conceptos generales que también se aplica aquí, es que las vías que
deben mantener un nivel constante de un producto final, como el ATP se regulan por un
feedback de ese producto o un metabolito relacionado. En este caso, ATP, ADP, NADH y
NAD+ participan en la regulación por feedback (o retroalimentación).
La regulación del ciclo ocurre a nivel de dos enzimas: la isocitrato deshidrogenasa
y la -cetoglutarato deshidrogenasa. La capacidad de ambas enzimas es relativamente
baja en condiciones fisiológicas y por lo tanto constituyen los pasos limitantes. La
isocitrato deshidrogenasa es una enzima oligomérica (formada por varias subunidades)
activada alostéricamente por ADP e inhibida por NADH. En ausencia de ADP exhibe
cooperatividad positiva, cuando el isocitrato se une a la primera subunidad, las otras
subunidades se convierten a una conformación activa. En presencia de ADP cambia la
conformación de todas las subunidades de modo que el isocitrato se une más
rápidamente y el Km aparente cambia a un valor mucho menor. Por lo tanto, a la
concentración de isocitrato encontrada en la matriz mitocondrial, un pequeño cambio en la
concentración de ADP puede producir un gran cambio en la velocidad del ciclo. Pequeños
cambios en la concentración del producto NADH y del cosustrato NAD + también afectan la
velocidad de la enzima más de lo que lo harían en una enzima no alostérica.
La -cetoglutarato deshidrogenasa es inhibida por los productos de la reacción:
NADH y succinil-CoA.
Ambas enzimas, la isocitrato deshidrogenasa y la -cetoglutarato deshidrogenasa,
se activan por aumento en la concentración de Ca 2+ mitocondrial. En el músculo
esquelético en contracción y posiblemente en otros tejidos musculares, la liberación de
Ca2+ del retículo sarcoplásmico y el aumento en la concentración mitocondrial de Ca 2+
durante la contracción puede proveer una activación adicional de estas enzimas en una
situación metabólica en la que el ATP se está hidrolizando rápidamente (contracción
muscular).
Ninguna de estas enzimas cataliza la primera reacción del ciclo, y por lo tanto no
afectan directamente la velocidad de entrada del acetil-CoA. La citrato sintasa es una
enzima simple en tejidos de mamíferos y no se regula alostéricamente. Cuando la
isocitrato deshidrogenasa se activa, la concentración de citrato disminuye. Dado que el
equilibrio malato-oxaloacetato favorece al malato, la concentración de oxaloacetato es
muy baja dentro de la mitocondria, por debajo del Km aparente para la citrato sintasa.
Cuando la relación NADH/NAD+ disminuye, la relación de oxaloacetato/malato aumenta.
El aumento en los niveles de oxaloacetato aumenta la velocidad de la reacción de la
citrato sintasa.
Además de lo ya mencionado, otros factores están involucrados en la regulación de
la actividad del CAT. Por ejemplo, el aporte de sustratos como las unidades de acetilo que
provienen del piruvato o de ácidos grasos, es un factor crucial para determinar la
velocidad del ciclo. Por lo tanto, la regulación de la piruvato deshidrogenasa tendrá un
efecto importante en la velocidad del ciclo. De modo similar, cualquier mecanismo que
regule los procesos de transporte y la -oxidación de ácidos grasos será un determinante
efectivo de la actividad del ciclo.
En conclusión, la regulación de la actividad del ciclo le permite a la célula adaptarse
frente a diferentes situaciones metabólicas, es decir, en aquellas donde se requiera una
gran actividad para producir la oxidación completa de moléculas combustibles, las
enzimas funcionarán con su máxima capacidad y en aquellas donde el requerimiento sea
menor, disminuirá la oxidación del acetil-CoA que se desviará hacia la formación de
triacilglicéridos. De este modo, el organismo logra mantener la homeostasis calórica a
pesar de las variaciones en el aporte de combustibles y en su utilización.

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CUESTIONARIO DE CICLO DE KREBS

1) ¿La malato deshidrogenasa mitocondrial cataliza una reacción en la que, en

condiciones estándar, la concentración de sustratos es mayor que la de productos?
¿Produce un compuesto de alta energía? ¿Cataliza una reacción anaplerótica? ¿Utiliza
NADH como sustrato?
2) ¿Cuál de las enzimas del ciclo de Krebs (CAT) cataliza la síntesis de un
compuesto de alta energía?
3) Relacione con flechas los intermediarios (de la columna de la izquierda) con
sus posibles productos biosintéticos (columna de la derecha).
-cetoglutarato ninguno
succinil CoA grupo hemo
cis-aconitato glutamato
piruvato ácidos grasos
citrato oxaloacetato
4) Con respecto a la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa responda:
¿cataliza una reacción en la que, en condiciones estándar, la concentración del producto
es menor que la del sustrato? ¿el producto de la reacción es sustrato de la fumarasa?
¿cataliza una reacción anaplerótica? ¿utiliza pirofosfato de tiamina como cofactor?
5) Con respecto a la lanzadera del glicerol-3-fosfato responda: ¿en qué
compartimiento se reducen la dihidroxiacetona fosfato y el NAD +? ¿en la mitocondria se
oxida el FAD y se reduce el glicerol-3-P?
6) Indique la secuencia de eventos que ocurre en la reacción catalizada por la
piruvato deshidrogenasa, las coenzimas que intervienen y la composición del complejo
enzimático. ¿De dónde proviene el sustrato?
7) Nombre los compuestos del ciclo de Krebs que tiene 4C, 5C y 6C.
8) Aunque el O2 no participa directamente en las reacciones del ciclo de Krebs,
éste sólo funciona en condiciones aeróbicas. ¿Por qué?
9) Con respecto a la actividad de enzima -cetoglutarato deshidrogenasa,
responda: ¿en qué dirección ocurrirá la reacción en condiciones estándar? ¿De qué
reacción es sustrato el producto de esta reacción? ¿Cataliza una reacción anaplerótica?
¿Utiliza pirofosfato de tiamina como cofactor?
10) Describa la lanzadera de malato-aspartato e indique: ¿Cuál es su función?
¿Qué procesos se producen en el citosol y cuáles en la mitocondria? ¿Cuál es el balance
energético?
11) ¿Cuál/es de las enzimas del ciclo de Krebs cataliza la transformación de un
sustrato en un producto con menor número de C?
12) ¿En cuál/es de las reacciones de oxidación del ciclo de Krebs NO se utiliza
NAD+ como sustrato?
13) Nombre 3 reacciones anapleróticas e indique su función. ¿Por qué no se
considera la reacción catalizada por la glutamato-oxaloacetato transaminasa como una
reacción anaplerótica?
14) Explique la regulación de la actividad del complejo de la piruvato
deshidrogenasa indicando el efecto de: a) relación de coenzimas NADH/NAD, b) relación
ATP/ADP, c) niveles de Ca2+, d) relación CoA-SH/acetil-CoA. Explique el efecto de la
fosforilación/desfosforilación en la actividad del complejo e indique las enzimas que lo
catalizan.
15) ¿Qué característica tiene la enzima que cataliza la síntesis de oxaloacetato
del resto de las enzimas del ciclo de Krebs?
16) Explique cómo se regula la actividad del CAT e indique las principales
reacciones regulables y los mecanismos de regulación involucrados.

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17) Indique el balance energético de la oxidación de 1 mol de acetil-CoA en el
CAT.
18) ¿Cuáles son las fuentes de acetil-CoA del CAT? Indique las vías
metabólicas involucradas.
19) Indique 3 compuestos que puedan sintetizarse a partir de intermediarios del
CAT (nombre los compuestos y los intermediarios).
20) ¿Se puede sintetizar glucosa a partir de acetil-CoA? ¿Por qué?

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