Transferencia de embriones en bovinos

Transferencia de embriones en bovinos_172976 / ABC

Color

La transferencia de embriones es una técnica para el

mejoramiento genético del ganado que actualmente
está siendo muy difundida en nuestro país, debido a
los buenos resultados obtenidos. En un material
realizado en la Granja Guarapí de Yaguarón, el Dr.
José Frutos nos explicó cómo se realiza el trabajo y su
importancia para el mejoramiento tanto del ganado
lechero como del de carne.
En condiciones normales, cada vaca produce una
sola cría al año, lo cual significa que cuando mucho
producirá de 6 a 8 terneros en su vida. A través de la
inseminación artificial, se pueden obtener
innumerables crías de un toro. Con la transferencia de
embriones, se ha llegado a obtener más de cien crías
de una vaca durante su vida productiva, lo cual
facilita el mejoramiento genético, con el consecuente
incremento de la producción de carne y/o leche.

QUÉES
La transferencia de embriones está dentro de un
marco de mejoramiento genético y se puede hacer
tanto en fresco como también en forma congelada.
El trabajo consiste en superovular vacas élite de alta
producción, para poder multiplicar esa genética.

La superovulación de la vaca permite que ésta, en

vez de ovular una sola vez y producir un embrión por
año, con la estimulación produzca mayor cantidad
de óvulos, que puede así llegar a los 10 ó 12.
Posteriormente, se insemina a las vacas, y 7 a 8 días
después, los profesionales encargados del protocolo
de trabajo se encargan de realizar la colecta de
embriones.

EQUIPOS NECESARIOS

Los equipos utilizados para la transferencia de

embriones son sencillos y la mayoría son descartables.
Básicamente son: sueros enriquecidos, catéter, vía,
estilete, filtros, guantes de hule y de goma,
micropipeta de manipulación de embriones. En tanto
que para realizar los trabajos de laboratorio, se utilizan
lupas estereoscópicas, congeladora de embriones y
algunos medios.

HEMBRAS DONANTES

Tenemos que definir que hay dos tipos de vaca que

se necesitan para desarrollar el trabajo de
transferencia de embriones. Por un lado están las
donantes, que son vacas élite y que son las dadoras
de genética. El proceso de selección de donantes es
uno de los procesos más importantes, porque aunque
se pueda tener la vaca más productora de leche, o
la mejor en un juzgamiento, puede ser que a la hora
del trabajo ella no responda a un proceso de
superovulación hormonal que permita colectar la
mayor cantidad de óvulos. Una vez seleccionadas, a
las hembras se les efectúa un chequeo reproductivo,
ginecológico; también ecografía a los ovarios y del
útero para ver si está en condiciones de ser tratada.

HEMBRAS RECEPTORAS

Por otro lado, están las hembras receptoras, que son

vacas que no aportan nada genéticamente dentro
del proceso de la transferencia, sino que sirven como
recipientes. Sin embargo, las mismas tienen que estar
libres de enfermedades reproductivas, y ser
candidatas a buenas madres porque van a tener que
amamantar y destetar después a los terneros.

LAVADO
Para realizar el lavado o colecta de embriones, se
utilizan sueros enriquecidos con proteínas y nutrientes
junto con medios de colecta, los cuales deben dar un
confort al embrión que es colectado. Para realizar el
trabajo, se utiliza una vía que es de circuito cerrado,
que actúa de la siguiente forma: por uno de los
catéteres hay que introducir el medio dentro del
útero, y por el otro catéter, se debe extraer el medio
que fue preparado para colectar el líquido, que a su
vez es pasado por un filtro. Este catéter tiene un cinto
que deja pasar el medio que viene del útero, dejando
aprisionados a los embriones que luego van a ser
evaluados en el laboratorio.

EN EL LABORATORIO

Una vez colectados los embriones, éstos son llevados

al laboratorio, ubicados y preparados en un lugar
limpio dentro del establecimiento. Los filtros que
fueron utilizados para el lavado son llevados al
laboratorio para luego trasladar los embriones
atrapados a las placas de petri.
La persona encargada de realizar la selección o
búsqueda de los embriones utiliza un microscopio y
una placa de petri grande cuadriculada, para poder
hacer campo y buscar los embriones. Una vez que
encuentra un embrión, la persona pasa el cuerpo
encontrado de la placa de petri grande a otra placa
que tiene un medio que almacena y mantiene el
embrión y evita su contaminación. Luego, los
embriones son clasificados en buenos o malos. Los
embriones buenos son lavados nuevamente y son
cargados en unas pajuelitas parecidas a las utilizadas
para semen, que se utilizan para la transferencia en
fresco.

FRESCO Y CONGELADO
Es importante recordar que el trabajo de transferencia
de embriones se puede realizar en fresco, como
también mediante embriones congelados. En este
caso, el procedimiento descripto corresponde al que
se realiza en fresco y, como siempre decimos, el mejor
lugar donde puede estar un embrión es el útero de la
vaca. Desde que obtenemos el embrión hasta el
momento de la aplicación a la vaca receptora, no
deben transcurrir más de dos horas, ya que el embrión
sigue viviendo, pero va disminuyendo su
supervivencia.

Lo mismo sucede cuando se va a congelar. En este

caso, el embrión no puede pasar más de una hora
fuera de su ambiente, y rápidamente debe ser
llevado a otro medio de preservación que es para
mantener a los embriones latentes.
PORCENTAJE DE PREÑEZ

De cada 100 vacas transferidas en fresco, los

porcentajes de preñez oscilan normalmente entre el
50% y 60%, y cuando son embriones congelados,
estamos hablando de 40% a 50%.
Durante el proceso de congelado, los embriones van
perdiendo células germinales y sufren daños durante
dicho proceso; por eso los porcentajes son más bajos.

Normalmente se dice que la transferencia de

embriones es el mejor método para avanzar en
genética, porque a diferencia de la inseminación
artificial, se avanza a través del toro padre que se
utiliza a través de la pajuela y se avanza en un 100%,
ya que la vaca es buena y el toro es superior.

TERMINADA
LA TRANSFERENCIA

Una vez realizado el trabajo de transferencia de

embrión a la vaca receptora, ésta es enviada a un
buen potrero en donde se le suministra buena
alimentación, cuidando de que sufra el menor estrés
posible, porque se encuentra en el primer período de
preñez, en el cual se da la mortalidad embrionaria.

Después, a los 30 días, se hace una primera ecografía,

para detectar las preñeces, pero más importante que
esto es detectar las vacías, que son aquellas que no
quedaron preñadas, ya que a causa de ellas podría
retrasarse todo el esquema de producción existente
en el tambo. Entonces se busca preñar nuevamente
a la vaquilla o utilizarla como donante.

Posteriormente, a los 90 días, se vuelve a chequear las

preñeces para ya dar un diagnóstico final de preñez.
En ese momento, se aprovecha para aplicar al animal
una vacuna viral reproductiva, para evitar tener
pérdidas.

RESULTADO FINAL
En este trabajo hay muchos factores que pueden
influir en el éxito del trabajo, como por ejemplo el
protocolo, la calidad de las donantes, las receptoras;
y la calidad del semen, pues se debe utilizar semen
de altísima fertilidad.
Tal vez los resultados finales de una transferencia de
embrión se vean recién una vez que nazcan los
terneros, y luego cuando les llegue la edad de
expresar su potencial productivo, como por ejemplo
al quedar preñadas, empezar a parir y obtener
buenos ejemplares.

(*) Especialista en
reproducción animal.
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Introducción

Hasta hace algunos años la colección y transferencia de

embriones en bovinos se realizaba en forma quirúrgica por lo
que se hacía muy difícil su aplicación en terreno (Rowson y
col, 1969). El desarrollo de nuevos instrumentos, métodos de
colección y colocación de los embriones en hembras
receptoras, abrió la posibilidad de usarla como una técnica
más en los programas reproductivos en animales de alto
pedigree en los criaderos (Rowe y col, 1976; Eldsen y col, 1976,
Rowe y col, 1980a).

Hoy, la técnica de transferencia de embriones, se practica en

forma rutinaria en muchos países en el mundo. Es así como en
U.S.A., solamente, en el año 1983 se transfirieron 71.637
embriones en forma comercial (Embryo Transfer Newsletter,
1984).

La aplicación de la transferencia de embriones a nivel de

criaderos en Chile comenzó en 1981 (Del Campo, 1983),
aproximadamente 3 años después de haberse comunicado
el primer nacimiento de una cría obtenida por esta técnica
(Correa y col, 1980).

En Chile, desde junio 1981 hasta diciembre 1983 se realizaron

310 transferencias con resultados de preñez similares a los
obtenidos en otros países más avanzados. En su gran mayoría
las donantes de embriones han sido de razas de leche
provenientes de criaderos ubicados en diferentes lugares del
país.

Las razones principales de su aplicación en los criaderos

nacionales han sido: 1) mejorar la calidad genética del
criadero usando donantes importados de alta producción o
hijas de animales importados nacidas en el país, 2) Obtener
crías de hembras seniles de alta calidad que no son capaces
de llevar a término una preñez, 3) El deseo del criador de
tratar algo novedoso.

Este trabajo tiene como objetivo presentar una revisión

general sobre la forma de realizar un programa de
transferencia de embriones en bovinos, en condiciones de
terreno dando énfasis principalmente a una técnica no
quirúrgica de colección y a las técnicas quirúrgica y no
quirúrgica de colocación de los embriones en las receptoras.

Generalidades

Antes de comenzar un programa de transferencia de

embriones es recomendable analizar una serie de detalles
relacionados con el criadero en general y especialmente con
las donantes y receptoras que se usarán. Por ejemplo el usar
donantes subalimentadas o con problemas reproductivos,
éstas no responderán en forma óptima al ser sometidas a
grandes dosis de gonadotrofinas (superovulación). Al igual
receptoras de dudosa calidad reproductiva o sanitaria
(muchas veces sucede que el criador compra hembras a
terceros para usarlas como receptoras) disminuirán las
posibilidades de obtener un alto porcentaje de preñez.
También, un semen de mala calidad dará como resultado
una alta proporción de oocitos no fertilizados. Además de lo
anteriormente mencionado, debe tenerse presente el equipo
de colección y transferencia, las hormonas, esquema de
tratamientos, etc.

Definiciones

CICLO ESTRAL

La vaca tiene un ciclo estral de 21 días aproximadamente

durante el cual se suceden una serie de cambios fisiológicos,
endocrinos, morfológicos y psíquicos en el animal (Hansel,
1959). Debido a que estos cambios ocurren en ciertos días
específicos del ciclo, éste se ha dividido en períodos,
designados como: estro, metaestro y proestro. Este ciclo
puede ser interrumpido o prolongado por una preñez o una
situación anormal.

Las hormonas que controlan el ciclo estral son producidas

fundamentalmente por la glándula hipófisis y ovarios (Fig. 1).
 Figura 1. Hormonas y estructuras ováricas
durante el ciclo estral de la vaca.

ESTRO, CELO, CALOR (día 0)

Tiene una duración aproximada de 24 horas y se caracteriza

por presentar manifestaciones externas en la hembra que
pueden ser fácilmente distinguidas (inquietud, mugidos,
edematización y enrojecimiento vulvar, montan o se dejan
montar por otros animales del rebaño, etc.). En los ovarios se
desarrolla un folículo por la acción de la hormona folículo
estimulante (FSH), este folículo alcanza un tamaño
aproximado de 20–25 mm. en diámetro. La hormona
predominante en este período es el estrógeno producido por
los folículos. Treinta horas después de haber comenzado las
manifestaciones de estro se producirá la ovulación por la
acción de la hormona luteinizante (LH) producida por la
hipófisis.

METAESTRO (día 1–4)

Los niveles de estrógeno y progesterona son bajos y el útero

se prepara para recibir el embrión.

DIESTRO (día 5–17)

Se forma el cuerpo lúteo (CL) a partir del folículo que dio

origen al oocito. La hormona predominante es la
progesterona producida por el CL. Esta hormona prepara al
útero para la futura anidación del embrión.
En el caso de no haber fertilización, el día 16
aproximadamente se producirá la regresión del CL, lo que
traerá una baja en los niveles de progesterona, una alza en
los niveles de FSH, la formación de un nuevo folículo, una alza
de estrógeno, aumento de los niveles de LH y una nueva
ovulación.

PROESTRO (día 18–20)

Es el período en que la hembra se prepara para ser cubierta.

Los niveles de estrógeno aumentan rápidamente.

FOLICULOS Y OOCITOS

Los ovarios de una hembra bovina al nacer tienen

aproximadamente 200 mil oocitos primarios que teóricamente
al ser fertilizados pueden dar origen a un ser (Callesen y
Greve, 1983).

Sin embargo, sólo un oocito es eliminado desde un folículo

cada 21 días.

Como se observa, los ovarios contienen 1.000 veces más

oocitos que los que maduran y ovulan durante la vida
productiva de un animal.

SUPEROVULACION

Haciendo tratamientos en base a grandes dosis de

gonadotrofinas durante la fase luteal del ciclo se logra
producir una maduración mayor de folículos que
potencialmente darán origen a oocitos, esto se conoce
como superovulación.

En transferencia de embriones se utiliza la superovulación

para obtener mayor cantidad de oocitos, a partir de hembras
genéticamente superiores y así, aumentar su capacidad
reproductiva.

Las gonadotrofinas más comúnmente usadas para inducir

superovulación en bovinos son la hormona folículo
estimulante porcina (FSH–P) y la gonadotrofina sérica de
yeguas preñadas (PMS–G).

Un tratamiento de superovulación con estas hormonas se

comienza generalmente durante los días 8–14 del ciclo estral
en animales que presentan un CL bien desarrollado (Fig. 2).

Figura 2. Esquema representando los eventos

que suceden durante el tratamiento de
superovulación, inseminación y colección en
la vaca. El tratamiento con FSH-P comienza el
día 10 del ciclo estral, el celo está indicado
como día 0, la inseminación es múltiple y la
colección se realiza 6-8 días después del celo.

Esquema representando los eventos que suceden durante el

tratamiento de superovulación, inseminación y colección en
la vaca.

El tratamiento con FSH–P comienza el día 10 del ciclo estral, el

celo está indicado como día O, la inseminación es múltiple y
la colección se realiza 6–8 días después del celo.

Comúnmente la FSH se usa en dosis totales que varían entre

30–50 mg divididas en 8–10 inyecciones que son colocadas
cada 12 hrs. en forma subcutánea (SC) o intramuscular O M)
M) Cincuenta y seis a 72 hrs. después de haber sido inyectada
la primera dosis de FSH, se inyecta Prostaglandina F–2 alfa
(25–30 mg) para inducir la regresión del CL del ciclo. La
presentación del celo ocurre aproximadamente 48–56 horas
más tarde (Alcivar y col, 1983; Murphy y col, 1984).
La PMS–G se inyecta en dosis única que varían entre 1500 y
2800 UI (IM), 48 hrs. después, se inyecta Prostaglandina F–2
alfa. El celo se presenta aproximadamente 48–56 hrs. más
tarde (Critser y col, 1980).

INSEMINACION

Al celo, la donante se insemina cada 12 hrs. por 2–4 veces

usando una o más dosis de semen en cada inseminación.
Esto se realiza para aumentar las posibilidades de fertilización
de los oocitos liberados. Aproximadamente 7 a 8 días más
tarde estos oocitos o embriones son recuperados desde el
útero de la donante, ya sea utilizando métodos quirúrgicos o
no quirúrgicos de colección (ver más adelante).

MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios de cultivo (TCM–199), PBS,

HAM–F10, etc.) que pueden utilizarse para recolectar oocitos,
el más usado actualmente es el Dulbecco's fosfato buffer
salino (PBS) (Gibco, Grand Island N.Y.). Este medio tiene la
particularidad que su buffer es fosfato lo que lo hace más
estable a los cambios de pH. Además, es un medio de fácil
preparación, sus componentes son encontrados sin mayores
problemas en el comercio y son de relativo bajo costo.

Comúnmente se habla de 2 tipos de medios de cultivos. El

medio de colección o de lavado (flushing) y el medio de
mantención (Cuadro 1). La diferencia fundamental entre
ambos radica en la cantidad de proteína agregada,el
primero posee 1–2% de proteína (suero fetal, albúmina
bovina, etc.), en cambio el medio de mantención posee 10–
20% de proteína y a veces se enriquece con glucosa (1
mg/ml) y piruvato de sodio (0,33 mM).

CUADRO I .

Composición del medio Dulbecco's Fosfato Buffer Salino (PBS),

para colección y mantención de embriones.

Substancia Colección Mantención

NaCI 8.00 gr/It 8.00 gr/It

KCI 0.20 gr/It 0.20 gr/It

CaCI 0.10 gr/It 0.10 gr/It

MgCI2 6H2O 0.10 gr/It 0.10 gr/It

Na2 HPO4 1.15 gr/It 1.15 gr/It

2H2O

KH2 PO4 0.20 gr/It 0.20 gr/It

Penicilina 100 U.I. 100 U.I.

Estreptomicina 100 ug 100 ug

Fungizona 25 ug 25 ug

Suero Fetal 1 -2% 10-20%

Piruvato de 0.33 mM
Sodio

Glucosa 1 mg/ml

Para preparar 1 litro de medio:

Use agua bidestilada. Agregue los componentes previamente

mezclados (polvo) en un matraz con el agua bidestilada
(menos el CaCI) a 15–30° C (temperatura ambiente) y agítelo
constantemente. Una vez que todo el material está en
solución agregue el cloruro de calcio (0.10 gr.). Esterilice
inmediatamente usando un filtro de 0.22 um.

Los medios preparados se esterilizan usando un filtro de 0.22μ

y se mantienen en refrigeración (4o C). Al momento de usarse
se les agrega antibióticos (penicilina potásica: 100 UI/ml y
sulfato de estreptomicina 100 mg/ml y antihongos (fungizona
25 mg/ml).

COLECCION DE OOCITOS

Todo el equipo (catéter, jeringas, material de vidrio, etc.) que

se usa en la colección y transferencia de embriones, se lava
cuidadosamente con agua destilada y se esteriliza
adecuadamente.

En un principio los oocitos eran colectados haciendo un

lavado del útero una vez que la donante era sacrificada.
Posteriormente se usó el Método quirúrgico a través de la
línea media con el animal bajo anestesia general (Rowson y
col 1969), el cual es impracticable en terreno ( no se discutirá
en este trabajo), y actualmente se utiliza el método no
quirúrgico a través de la vagina. Este último puede realizarse
por medio de un circuito cerrado de circulación (por
gravedad) o por aspiración interrumpida (Rowe y col, 1976;
Rowe y col, 1980b).

Para la colección no quirúrgica de oocitos se han inventado

variedades de instrumentos (Drost y col 1976; Eldensen y col
1976; Greve y col 1977; Rowe y col 1976) pero los más
comúnmente usados son los catéteres Foley de 2 vías y el
modelo Neustadt/Aish (Shneider y Hahn 1979). Las diferencias
fundamentales entre ellos redica en el largo y en la
consistencia. El modelo Neustadt/Aish es 27 cm. más largo y
es más duro que el Foley.

COLECCION NO QUIRURGICA POR ASPIRACION

INTERRUMPIDA

A continuación se describe brevemente la colección no

quirúrgica por aspiración interrumpida (Fig. 3) por ser una
técnica bastante utilizada actualmente en terreno.
 Figura 3. Método de
recuperaciónpor aspiración
interrumpida. Se lavan los cuernos
con pequeñas cantidades de medio
de cultivo (20-60 ml).

Una vez colocada la donante en un brete se procede a la

palpación rectal para estimar el número de CL. Se lava
cuidadosamente la región perineal y labios vulvares con
agua y jabón, luego se saca y se coloca alcohol.
Posteriormente se inyecta una anestesia epidural baja (3–5
ml).

A continuación el catéter se introduce a la vagina y se pasa

a través del cérvix para finalmente ser colocado en uno de
los cuernos. Muchas veces es recomendable en vaquillas,
previo a la introducción del catéter, dilatar el canal cervical
por medio de un dilatador de cérvix (Fig. 4) en esta forma se
facilita posteriormente la introducción de éste. La fijación del
catéter al cuerno se realiza por medio de un globo que va
adosado en el extremo. Este se llena con aire (5–15 ml) o
suero salino hasta que se sienta que no hay deslizamiento,
para esto se recomienda traccionarlo suavemente. Hay que
tener presente que la poca o alta presión pueden producir
pérdida de líquido y de embriones o desgarros del Debe
existir un delicado balance entre ambas presiones.
 Figura 4. Diferentes formas de
dilatadores de cérvix. a) diámetro
menor 3 mm. (extremo), b) diámetro
mayor 8 mm., c) largo 50 cm.

Ubicado el catéter y asegurándose que no existen

torcimientos del cuerno que podrían resultar en desgarros por
alta presión de líquido en pequeñas porciones de éste se
procede a realizar el lavado (flushing).

El medio se introduce previamente entibiado (37° C) en

pequeños volúmenes que van desde 20 a 60 ml cada vez, por
5 a 8 veces, a través de una jeringa que se adosa al extremo
libre del catéter. Debe procurarse que el medio alcance
todas las áreas del endometrio. Muchas veces, este es
agitado con la misma jeringa haciendo movimientos de
entrada y salida por un par de veces. Así en esta forma se
producirán turbulencias y los embriones que se encuentran
ubicados en los pliegues de la mucosa uterina pueden ser
arrastrados más fácilmente. Terminado el lavado de un
cuerno se repite la maniobra en el otro cuerno.

El medio de cultivo colectado (probetas, bulbos, etc.) se deja

reposar aproximadamente por 30 minutos para que los
oocitos que flotan en él decanten (Fig. 5).

Finalizado los lavados es recomendable colocar una solución

antibiótica dentro del útero de la vaca para prevenir posibles
metritis. También es una práctica común inyectar (IM)
Prostaglandina F–2 alfa ya sea inmediatamente después de la
colección u 8 a 10 días más tarde, para producir luteolisis de
los CL presentes. Esto permitirá inducir celo en la donante y
volver al programa reproductivo del predio más rápidamente,
o podría continuar como donante en un programa de
transferencia, superovulándola nuevamente 60–90 días más
tarde.

Figura 5. Medio de cultivo con

embriones (lavado del útero)
colectado en bulbos y probetas. Se
deja decantar por 30 min. y se vacia
en copas abriendo la pinza (A) en el
caso de ser colectado en bulbos o
en el caso de usar probetas, el
líquido restante se coloca en copas
o placas Petri para posteriormente
realizar la búsqueda de los oocitos.

BÚSQUEDA, IDENTIFICACION Y CLASIFICACION DE LOS

OOCITOS

Cuando los lavados han sido colectados en probetas la parte

superior del medio se extrae por medio de sifonaje dejando
aproximadamente 100 a 200 ml en el fondo. Este medio
restante se coloca posteriormente en placas petri y se
observa bajo el estereoscopio, generalmente usando un
aumento de 10x. En el caso de usar bulbos la extracción del
medio a observar se realiza a la inversa (Fig. 5).

Los oocitos que se encuentran son retirados de la placa con

una pipeta Pasteur o cánula plástica y colocados en un
medio de cultivo fresco. Posteriormente se observan a mayor
aumento (40x ó 70x) para ser identificados y clasificados.

Existen diferentes técnicas para clasificar los oocitos en

viables y no viables, por ejemplo tinciones vitales
(Kardymowicz, 1972), cultivos (Renard y col 1980), técnicas
que miden el metabolismo (Schilling y col 1979) etc., pero
estas son difíciles de realizar en condiciones de terreno.
Actualmente la forma más popular de clasificación se basa
en una apreciación subjetiva, utilizando el microscopio
estereoscópico.

IDENTIFICACION Y CLASIFICACION MORFOLOGICA A TRAVÉS

DEL ESTEREOSCOPIO.

IDENTIFICACION

La identificación se realiza tomando como base el estado de

desarrollo de los oocitos (para mayores detalles ver Lindner y
Wright 1983).

En un lavado (día 5–9) se pueden encontrar oocitos de

diferentes estados, por ejemplo (Fig. 6):

Oocito no fertilizado

Zona pelúcida vacía

Oocitos de 8 células: 1 x 8

Oocitos de 16 células: 1 x 16

Mórula

Mórula compacta

Blastocisto
Blastocisto expandido

Blastocisto eclosionado o por eclosionar.

Figura 6. Algunos ejemplos de oocitos

bovinos de 7-8 días de edad.

Definiciones (continuación)

CLASIFICACION

Con la clasificación se pretende evaluar la calidad del

embrión (viabilidad) basándose en la comparación de una
serie de parámetros, como número, tamaño y forma de las
blastómeras, número de vacuolas espacio perivitelino, color,
forma de la zona, etc.

Los oocitos son clasificados de acuerdo a la apreciación

subjetiva de estos parámetros en: EXCELENTES, BUENOS,
REGULARES (incluye oocitos fertilizados = embriones) y MALOS
(no fertilizados y fertilizados degenerados, Cuadro 2).

CUADRO II
Clasificación de Oocitos colectados entre los días 5–9
después del estro.

Puntaje

Transferible EXCELENTE 1

(incluye BUENO 2
oocitosfertilizados) REGULAR
3
No Transferible
(incluye oocitos
MALO 4
nofertilizados
dege-nerados),

Distinguir entre oocitos fertilizados y no fertilizados no es difícil.

Sin embargo, clasificar los oocitos fertilizados requiere de
cierta experiencia. El problema fundamental radica en saber
con seguridad si el embrión clasificado como transferible es
viable y si es clasificado como no transferible es realmente no
viable. Quizás la única forma de saberlo será transfiriéndolo
en una receptora y esperar el resultado.

Aún así, esto no es totalmente 'seguro ya que hay otra serie

de factores ajenos al embrión que influenciarán en la
viabilidad, como por ejemplo: técnica de transferencia
(quirúrgica o no quirúrgica), sincronización
donante/receptora, medio de cultivo, etc.

Los oocitos fertilizados y clasificados como 1, 2, 3 son

colocados en medios de cultivo de mantención y guardados
en incubador a 37º C para luego ser transferidos a las
receptoras.

RECEPTORAS

La inducción de celo con Prostaglandina F–2 de las

receptoras debe estar de acuerdo con el programa de
superovulación de la o las donantes. Estas recibirán una
inyección de Prostaglandina F–2 veinticuatro horas antes o en
el mismo momento que la recibe la donante. Comúnmente la
relación es 10 receptoras por cada donante. Lo más
recomendable en condiciones de terreno es realizar 2 o más
donantes en el mismo día, así la utilización de las receptoras
se realiza en mejor forma.

Las receptoras que presenten celo (en forma natural o

inducido) con una diferencia de ± 24 horas con respecto al
celo de la donante serán las receptoras (sincronizadas)
seleccionadas prioritaria mente para recibir los embriones.

En el caso que hubiese más embriones que receptoras

sincronizadas se puede recurrir a receptoras que han
presentado celo ± 36 6 ± 48 hrs. del celo de la donante,
lógicamente las posibilidades de preñez serán menores.

Un programa práctico de sincronización y colección es por

ejemplo: realizar 6 donantes con 60 receptoras. Comenzar el
tratamiento de superovulación en 3 donantes (Grupo A) y
preparar 30 receptoras –(PGF 2 alfa) el próximo día comenzar
el tratamiento de las donantes y receptoras restantes (Grupo
B, Fig. 7).

Figura 7. Programa práctico de T. de E.

utilizando 3 donantes y 30 receptoras en
cada grupo (A y B). Se considera que todas
las donantes manifestaron celos (antes del
 tratamiento) el mismo día. Las donantes A
comienzan el tratamiento de superovulación
el día 10 del ciclo estral, en cambio las
donantes B comienzan el día 11. Las
receptoras reciben 1 dosis única de
Prostaglandina F-2 alfa un día antes o el
mismo día que la reciben las donantes.

En este ejemplo se maximiza la utilización de las receptoras,

ya que estas pueden intercambiarse con las donantes del
Grupo A ó B.

Las 6 donantes pueden ser colectadas el mismo día

(calendario) o pueden ser colectadas con un día de
diferencia, pero el programa de sincronización no cambia. Es
recomendable palpar todas las donantes antes de colectar
para tener una estimación del número de CL, esto reflejará en
forma apróximada el número de oocitos a colectar. En base
a estos datos se distribuyen las receptoras. Programas como
éste pueden realizarse con mayor número de donantes.

COLOCACION DE LOS EMBRIONES EN RECEPTORAS

Los embriones pueden ser transferidos quirúrgicamente,

realizando una laparatomía ventral bajo anestesia general
(Rowson y col 1969) o a través del flanco, con anestesia local
(Evans y col 1979) o no quirúrgicamente: a través de la vagina
(Rowe y col 1980a). Es recomendable para un técnico que
recién comienza a transferir los embriones, utilizar la técnica
quirúrgica por el flanco ya que requiere menos experiencia,
que la no quirúrgica, esto lo familiarizará con el trabajo y
obtendrá seguramente, mejores resultados de preñez.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA QUIRÚRGICA A TRAVÉS DE LA

LAPARATOMIA LATERAL.

La receptora es colocada en un brete que permita

posteriormente realizar la laparatomía lateral izquierda o
derecha. Primero se procede a realizar un examen rectal de
la receptora para constatar la presencia de CL (Evans y col
1979; Del Campo y col 1976).

Una incisión paralela a la última costilla y de no más de 10

cm. de longitud se realiza al lado adyacente del ovario que
posee el CL, lo más posterior que sea posible
(aproximadamente a una mano de distancia de las apófisis
de las vértebras lumbares y a una mano del borde de la
última costilla).

Los preparativos de asepsia de la operación son similares a

cualquier intervención quirúrgica (corte de pelo en el área,
lavado y desinfección). Una vez hecho ésto, se procede a
inyectar anestesia local (xilocaína al 2%) por infiltración, se
incide la piel y las capas de tejido. El músculo oblicuo
abdominal interno y el músculo recto son separados con los
dedos o una pinza roma. Luego se introduce una mano a la
cavidad abdominal y se procede a identificar nuevamente el
CL palpando los ovarios directamente o visualizándolo a
través de la incisión si es posible. Después se exterioriza el
cuerno adyacente al CL traccionando el ligamento ancho a
la altura del tercio distal de éste. Para una mejor sujeción del
cuerno se usan compresas de gasa entre los dedos pulgar e
índice. Luego el cuerno es puncionado aproximadamente a
5–8 cm. de la unión útero–tubárica con la parte roma de una
aguja de sutura o estilete pequeño hasta alcanzar el lumen.
Inmediatamente después el embrión, es depositado en el
lumen uterino usando una cánula de plástico (Fig. 8) o una
pipeta Pasteur, la que ha sido cargada previamente con el
embrión de tal forma que éste se ubique entre 2 espacios de
aire y medio de cultivo (Fig. g). Posteriormente la cánula es
retirada lentamente y el cuerno es devuelto a la cavidad
abdominal. Luego la herida operatoria es suturada.
 Figura 8. Técnica de
transferencia quirúrgica a
través de la laparatomía lateral.
El extremo del cuerno es
sostenido traccionando el
ligamento ancho a la altura del
tercio distal del cuerno. Se abre
un orificio pequeño en el
cuerno con un estilete y se
introduce la cánula cargada
con el embrión hasta estar
seguro que está su extremo en
el lumen, luego el embrión se
deposita en el lumen.

Figura 9. Forma de cargar una cánula con el

 embrión para transferir en forma quirúrgica.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA NO QUIRURGICA

TRANSCERVICAL

Una vez realizado el examen rectal de la receptora y

constatada la presencia de un CL se inyecta una anestesia
epidural baja (solución de xilocaína al 2%). La región perineal
y vulva se lavan con jabón desinfectante y agua y, se secan
(Rowe y col 1980a).

El embrión es entonces colocado dentro de una pajuela

esterilizada (0.25–0.5 ml) a la que se le ha cortado un extremo
(aproximadamente 1,5 cm.), ésto se realiza para que no se
doble al ser introducida en el cérvix con la consiguiente
pérdida del embrión. La colocación del embrión dentro de la
pajuela se realiza de tal forma que el medio que posee el
embrión queda entre 2 gotas de medio; separadas por aire
(Fig. 10).

Posteriormente la pajuela con el embrión se coloca dentro de

la pistola de Cassou y ésta dentro de la pipeta plástica que,
previamente ha sido esterilizada.

Con la mano izquierda el operador sujeta el cérvix a través de

la pared del recto. La pipeta se introduce en el canal cervical
y su extremo se ubica, con ayuda de la mano izquierda, en el
cuerno ipsilateral al CL. Una vez en la posición deseada (un
poco más allá del cuerpo del útero) el embrión es depositado
suavemente y la pistola se retira lentamente. Todo este
procedimiento debe realizarse lo más rápido y
delicadamente posible. El exceso de manipulación producirá
daño a la mucosa del útero, que se traducirá en una baja en
los resultados (Rowe y col 1980a; Trowson y col 1978).

Aparte de la destreza y experiencia que son necesarias, con

cualquiera de las técnicas descritas, es necesario que las
receptoras sean animales sanos, que sus ciclos reproductivos
hayan sido normales y que estén en buen estado de nutrición.
En la medida que las receptoras estén en buenas
condiciones, tanto sanitarias como nutricionales y
reproductivas, y la técnica sea bien realizada, la eficiencia de
la transferencia de embriones, traducida en preñeces, será
mayor.

Figura 10. Transferencia no quirúrgica.

Forma de cargar una pajuela con el
embrión.

OTRAS POSIBILIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

ACTUALMENTE USADA EN TERRENO

CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES.

Un problema que presenta la transferencia de embriones en

terreno es la preparación de gran número de receptoras, que
muchas veces el criador no puede mantener, debido al alto
costo.

La preservación de embriones a bajas temperaturas abre una

nueva oportunidad para la ganadería, ya que en este caso
los embriones pueden ser transferidos en cualquier momento,
utilizando incluso una receptora o preparando grupos de
receptoras (Lehn–Jensen y Greve 1981).

PRODUCCION DE MELLIZOS

Utilizada especialmente en ganado de carne. Existen tres

posibilidades de producir mayor cantidad de crías por medio
de transferencia: a) colocando 2 embriones extraños en una
receptora (Anderson y col 1977; Renard y col 1977; Anderson
1978); b) colocando 1 embrión extraño en receptoras
previamente inseminadas (Sreenan y Mc Donagh 1979; Testar
y col 1975); c) usando mitades de embriones obtenidos a
través de microcirugía (Ozil, 1983). En éste último caso la
receptora recibirá 2 mitades de un mismo embrión, lo que
obviaría el problema de Freemartin. Esto permitiría producir
mellizos en animales de lechería.

Las posibilidades que se tienen en la reproducción animal con

el uso de estas nuevas tecnologías son incalculables, pero
también hay que tener presente los problemas que de ellas
pueden derivar.

TÉRMINOS
– CATÉTER FOLEY: Instrumento que se ocupa para
vaciar la vejiga urinaria humana y que se usa para
recolectar oocitos.
– CALOR, CELO, ESTRO: Período de receptividad sexual
en la hembra.
– CUERNO IPSILATERAL: Cuerno adyacente al ovario
que posee el cuerpo lúteo.
– DONANTE: Hembra de la cual se colectan oocitos.

– DULBECO'S PBS: Medio de cultivo, fosfato buffer

salino.
– EMBRION: Huevo fertilizado, oocito fertilizado, ovum.

– FREEMARTIN: Una hembra nacida de una preñez de

mellizos (macho / hembra). Generalmente la hembra
es estéril.
– FSH–P: Hormona folículo estimulante porcina.

– GONADOTROFINA: Hormona que estimula los ovarios

y testículo.
– OOCITO: Huevo no fertilizado.

– PGF2α: Prostaglandina F–2 alfa.

– PMS–G: Gonadotrofina sérica de yeguas preñadas.

– RECEPTORA: Hembra que recibe un oocito
proveniente de otra hembra.
SUPEROVULACION: Estimulación ovárica a base,
– generalmente de gonadotrofinas, para producir una
mayor cantidad de folículos, que la normal.
– TCM–199: Medio de cultivo de tejidos.
AGRADECIMIENTOS

El autor desea agradecer a la Dra. María Eugenia Colin y al

Dr. Jaime de Grenade por la ayuda prestada en la
preparación de este trabajo.