Dissertação PDF

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
unesp “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(MICROBIOLOGIA APLICADA)
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA ANTÁRTICA COM

ATIVIDADE ANTIBACTERIANA EM Xanthomonas spp.
GABRIELLE VIEIRA
Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências do Campus
de Rio Claro, Universidade
Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).
Rio Claro - SP
Abril - 2018
GABRIELLE VIEIRA
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA ANTÁRTICA

COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA EM Xanthomonas spp.
Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências do Campus de Rio Claro,
Universidade Estadual Paulista Júlio de
Mesquita Filho, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Microbiologia
Aplicada)
Orientadora: Profª. Drª. Daiane Cristina Sass
Rio
Claro
2018
589.2 Vieira, Gabrielle
V658m Metabólitos secundários de fungos da Antártica com
atividade antibacteriana em Xanthomonas spp. / Gabrielle
Vieira. - Rio Claro, 2018
73 f. : il., figs., gráfs., tabs.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,

Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientadora Daiane Cristina Sass
1. Fungos. 2. Cancro cítrico. 3. Mancha-bacteriana. 4.

Bacteriose. 5. Atividade antimicrobiana. 6. Antártica. I.
Título.
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP

Campus de Rio Claro/SP - Ana Paula Santulo C. de Medeiros / CRB 8/7336
RESUMO
As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande

importância econômica no Brasil. O controle destas doenças realizado pela
utilização de produtos químicos, entre outras práticas, causa impactos negativos na
saúde e ao meio ambiente. Isso torna a busca de alternativas sustentáveis de
combate a estas doenças cada vez mais importante. Uma possível alternativa aos
produtos químicos que tem despertado grande interesse é a aplicação de
metabólitos secundários. Suspeita-se que fungos que vivem em ambientes extremos
como a Antártica podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos.
Dessa maneira, este projeto teve como objetivo principal investigar a potencial
atividade de metabólitos secundários produzidos por 33 fungos isolados do solo
contra três espécies de Xanthomonas economicamente importantes para a
agricultura do país. Para tanto, foram utilizados fungos coletados em solo em
expedição à Antártica (2013) no âmbito do INCT Criosfera, que estão preservados
junto à Central de Recursos Microbianos da UNESP. Os extratos (n=66) foram
testados contra Xanthomonas patogênicas das culturas de tomate (Xanthomonas
euvesicatoria), frutas cítricas (Xanthomonas citri subsp. citri) e maracujá
(Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). Do total de extratos brutos submetidos a
bioensaio contra os fitopatógenos, 18 (27,27%) apresentaram taxa de inibição ≥
90%. Os extratos com potencial inibitório tiveram origem em fungos identificados por
sequenciamento da região ITS4 e ITS5 como pertencentes ao filo Ascomycota,
gênero Pseudogymnoascus. Alguns extratos ativos foram purificados utilizando
diversas técnicas cromatográficas por fracionamento bioguiado como cromatografia
por exclusão molecular, cromatografia em coluna em fase normal, cromatografia em
coluna de fase reversa e cromatografia líquida de alta eficiência por interação
hidrofílica. As frações obtidas foram testadas frente à Xanthomonas citri subsp. citri.
Duas frações, obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência, C2F2 e C2F5
apresentaram atividade inibitória contra o fitopatógeno.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Mancha-bacteriana. Bacteriose. Atividade

antimicrobiana. Fungos filamentosos. Antártica.
ABSTRACT
Bacteria of the genus Xanthomonas affect agricultural crops of great economic
importance in Brazil. Control of these diseases is made by the use of chemicals,
among other practices, that causes negative impacts on human health and the
environment. This makes the search for sustainable alternatives to combat these
diseases increasingly important. A possible alternative to chemicals that have
aroused great interest is the application of secondary metabolites. It is suspected that
fungi living in extreme environments such as Antarctica may produce secondary
metabolites as of yet unknown. Therefore this study had as main objective
investigate the potential activity of secondary metabolites produced by 33 fungi
isolated from the soil against three economically important Xanthomonas species.
For this purpose fungi previously collected in the Antarctic expedition (2013) under
the INCOS Criosfera and preserved at the Microbial Resource Center of UNESP
were utillized. The extracts produced by the 33 isolates (n = 66) were tested against
pathogenic Xanthomonas of tomato crops: Xanthomonas euvesicatoria; citrus:
Xanthomonas citri subsp. citri; and of passion fruit culture, Xanthomonas axonopodis
pv. passiflorae. From the total of extracts submitted to bioassay against
phytopathogens, 18 (27.27%) presented inhibition rate ≥ 90%. The extracts with
inhibitory potential were produced by fungi identified through sequencing of the ITS4
and ITS5 regions as belonging to the Ascomycota phylum, genus
Pseudogymnoascus. Some active extracts were purified using chromatography
techniques by bioguided fractionation such as solid phase chromatography by
molecular exclusion, normal phase column chromatography, reverse phase column
chromatography, and high performance liquid chromatography by hydrophilic
interaction . The fractions obtained by cromatography were tested for antibacterial
activity in Xanthomonas citri subsp. citri. Two fractions, obtained by high performance
liquid chromatography, C2F2 and C2F5, showed inhibitory activity against the
phytopathogen.
Keywords: Citrus canker. Bacterial spot. Passion fruit bacteriosis. Antimicrobian

activity. Filamentous fungi. Antarctica.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média de produção de extratos para cada isolado. ................................. 40

Tabela 2 - Triagem qualitativa dos extratos intracelulares quanto à atividade
antibacteriana em Xanthomonas spp. ....................................................................... 41
Tabela 3 - Triagem qualitativa dos extratos extracelulares quanto à atividade
antibacteriana em Xanthomonas spp. ....................................................................... 42
Tabela 4 - Atividade inibitória dos extratos produzidos por fungos filamentosos em
Xanthomonas spp. .................................................................................................... 44
Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima dos extratos para 90% de morte celular.
.................................................................................................................................. 47
Tabela 6 - Concentração Bactericida Mínima dos extratos em cada um dos
fitopatógenos do gênero Xanthomonas..................................................................... 50
Tabela 7 - Isolados de solo antártico e seu gênero de acordo com sequenciamento
da região ITS. ............................................................................................................ 52
Tabela 8 - Frações resultantes da cromatografia por exclusão molecular do extrato
3MPe ......................................................................................................................... 53
Tabela 9 - Frações resultantes de cromatografia por exclusão molecular – Extrato
10.4MPi ..................................................................................................................... 54
Tabela 10 - Frações resultantes de cromatografia em sílica com grupos CN – Extrato
10.4MPi ..................................................................................................................... 55
Tabela 11 - Frações da purificação das amostras do extrato 10.4MPi por CLAE. .... 59
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição mundial de Xanthomonas citri subsp. citri. ........................... 11
Figura 2 - Disseminação de X. citri subsp. citri. ........................................................ 13
Figura 3 - Colonização de ramo, folha e fruto por X. citri subsp. citri. ...................... 14
Figura 4 - Produção de maracujá no Brasil por região. ............................................ 15
Figura 5 - Principais produtores de maracujá do país por estado. ........................... 16
Figura 6 - Bacteriose do maracujá em folhas de maracujá-azedo............................ 17
Figura 7 - Sintoma de bacteriose em fruto do maracujá-azedo. ............................... 17
Figura 8 - Sintomas da mancha bacteriana em folhas e fruto do tomateiro. ............ 19
Figura 9 - Estrutura de microbiaeratina (A) e bacilamida (B) isolados de micro-
organismos antárticos. .............................................................................................. 23
Figura 10 - Compostos bioativos produzidos por Streptomyces sp. 1010. ............... 23
Figura 11 - Actinomicinas com atividade biológica produzidas por Streptomyces
flavovirens 6. ............................................................................................................. 24
Figura 12 - Compostos bioativos produzidos por micro-organismos isolados de
ambientes frios .......................................................................................................... 24
Figura 13 - Estruturas de metabólitos produzidos por Geomyces sp. isolado da
Antártica .................................................................................................................... 26
Figura 14 - Produção de metabólitos secundários. .................................................. 28
Figura 15 - Obtenção de extratos contendo metabólitos secundários. ..................... 29
Figura 16 - Esquema de placa 96 poços para REMA com extratos brutos. ............. 31
Figura 17 - Gráfico para determinação da curva de regressão de um extrato. ........ 33
Figura 18 - Repicador de colônias utilizado para inoculação em placas de Petri com
meio NYG para determinação da CBM. .................................................................... 33
Figura 19 - Determinação da CBM em placa de Petri. ............................................. 34
Figura 20 - Fungos filamentosos isolados de solo abaixo de madeira em
decomposição na região Antártica ............................................................................ 39
Figura 21 - CBM em triplicata de extratos extracelulares em presença de X. citri.
subsp. citri. ................................................................................................................ 48
Figura 22 - CBM dos extratos intracelulares em X. citri subsp. citri.......................... 49
Figura 23 - CBM de extratos bioativos contra X. euvesicatoria e X. axonopodis pv.
passiflorae ................................................................................................................. 49
Figura 24 - Cromatograma da amostra P1 do extrato 10.4MPi e coleta das frações.
.................................................................................................................................. 57
Figura 25 - Cromatograma da amostra P2 do extrato 10.4MPi. ............................... 58
Figura 26 - Cromatograma da fração CN-14 obtido no aparelho de CLAE-EM. ....... 60
Figura 27 - Inibição do crescimento de X. citri subsp. citri por frações da CLAE...... 60
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE A
Figura 28 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (I)..... 70
Figura 29 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (II).... 71
APÊNDICE B
Figura 30 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas axonopodis pv.
passiflorae ................................................................................................................. 72
APÊNDICE C
Figura 31 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas euvesicatoria ........... 73
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 9
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 10
2.1. O gênero Xanthomonas ................................................................................. 10

2.1.1. Câncro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri)................................................ 11
2.1.2. Bacteriose (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae) .................................. 15
2.1.3. Mancha bacteriana (Xanthomonas euvesicatoria) .......................................... 18
2.1.4. Controle de Xanthomonas .............................................................................. 20
2.2. Biotecnologia de Micro-organismos ............................................................. 20

2.2.1. Potencial dos fungos antárticos contra Xanthomonas .................................... 25
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 27
3.1. Objetivos específicos ..................................................................................... 27
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 27
4.1. Reativação dos fungos filamentosos ............................................................ 27
4.2. Produção de extratos metabólicos brutos fúngicos ................................... 28

4.2.1. Cultivo microbiano .......................................................................................... 28
4.2.2. Separação da biomassa microbiana e caldo bruto ......................................... 28
4.2.3. Extração de metabólitos extracelulares (Figura 15A) ..................................... 28
4.2.4. Extração de metabólitos intracelulares (Figura 15B) ...................................... 29
4.2.5. Concentração dos extratos metabólicos produzidos (Figura 15C) ................. 29
4.2.6. Preparo dos extratos para avaliação da atividade antibacteriana................... 29
4.3. Avaliação in vitro da atividade antibacteriana dos extratos brutos

produzidos ............................................................................................................... 30
4.3.1. Ensaio de viabilidade celular – Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA) ..... 30
4.3.2. Triagem e Avaliação da Atividade Antibacteriana dos Extratos Brutos .......... 32
4.4. Concentração Inibitória Mínima (CIM90) dos extratos bioativos ................ 32
4.5. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos .............. 33
4.6. Identificação dos fungos filamentosos ......................................................... 34
4.7. Purificação dos extratos bioativos ................................................................ 35

4.7.1. Fracionamento do extrato 3MPe..................................................................... 35
8
4.7.1.1. Cromatografia em fase normal ..................................................................... 35

4.7.2. Fracionamento do extrato 10.4MPi ................................................................. 35
4.7.2.1. Cromatografia em coluna por exclusão molecular ....................................... 36
4.7.2.3. Cromatografia em fase reversa .................................................................... 36
4.7.2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE......................................... 37
4.8. Atividade inibitória das frações cromatográficas ........................................ 37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 38
5.1. Produção de extratos metabólicos brutos ................................................... 38
5.2. Ensaio de viabilidade celular – Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA) 41

5.2.1. Triagem dos extratos brutos ........................................................................... 41
5.2.2. Atividade inibitória dos extratos bioativos ....................................................... 43
5.3. Concentração Inibitória Mínima CIM90 dos extratos bioativos .................. 47
5.4. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos .............. 48
5.5. Identificação dos fungos filamentosos ......................................................... 51
5.6. Fracionamento dos extratos bioativos ......................................................... 53

5.6.1. Fracionamento do extrato 3MPe..................................................................... 53
5.6.2. Fracionamento do extrato 10.4MPi ................................................................. 53
5.6.2.1. Cromatografia por exclusão molecular ......................................................... 54
5.6.2.3. Cromatografia em fase reversa .................................................................... 56
5.6.2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ......................................... 56
5.7. Atividade antimicrobiana e pureza das frações ........................................... 59
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 63
APÊNDICES ............................................................................................................. 70
9
1. INTRODUÇÃO
Fitopatógenos do gênero Xanthomonas são responsáveis por grande perda

de frutos e produção na agricultura brasileira. As bactérias pertencentes a esse
gênero afetam culturas economicamente importantes como tomate, citros, maracujá,
cana-de-açúcar, arroz, mandioca e pimentão (RYAN et al., 2011) .
O cancro cítrico, que afeta todas as variedades comerciais de citros é
causado por Xanthomonas citri subsp. citri, a bacteriose, causada por Xanthomonas
axonopodis pv. passiflorae nas culturas de maracujá, e a mancha bacteriana, que
afeta o tomateiro e também as culturas de pimenta, causada pela Xanthomonas
euvesicatoria são doenças presentes em diversas regiões do país. Os métodos de
combate a esses fitopatógenos não são definitivos e o controle das doenças é feito
pelo uso de variedades não suscetíveis em conjunto com a aplicação de
agroquímicos a base de cobre para diminuição de incidência, ou em algumas
culturas com a erradicação de plantas infectadas (SANCHES et al., 2014; MUNHOZ
et al., 2015; LOPES e QUEZADO-SOARES, 2000). Considerando as perdas
decorrentes da incidência das doenças, uma forma eficiente de controle alternativa
aos métodos atualmente empregados faz-se necessária.
Produtos naturais são uma alternativa aos produtos químicos utilizados em
plantações. Esses produtos causam um menor impacto ambiental quando
comparado a bactericidas químicos, pois além de serem mais facilmente
degradados, não se acumulam no ambiente, e também não oferecem grande risco
de contribuir para o desenvolvimento de fitopatógenos resistentes (PEIXOTO NETO
et al., 2002; DAYAN et al., 2009).
Em busca de uma fonte pouco explorada de produtos naturais bioativos, nos
voltamos para os micro-organismos de ambientes extremos. Fungos filamentosos
são conhecidos e têm sido estudados quanto à sua produção de metabólitos
secundários com atividade antimicrobiana desde a descoberta da penicilina. Os
fungos filamentosos provenientes de ambientes frios, como a Antártica, tem
recentemente mostrado também seu potencial como nova fonte de moléculas com
propriedades antimicrobianas (SPAGO et al., 2014; DE OLIVEIRA et al., 2011;
HENRÍQUEZ et al., 2014).
Estudos recentes de metabólitos secundários produzidos por micro-
organismos do ambiente antártico demonstraram uma potencial atividade
10
antibacteriana destes metabólitos contra algumas espécies de Xanthomonas (X.

campestris, X. axonopodis pv. glycines, X. vesicatoria, X. axonopodis pv. Phaseol, X.
vesicatoria, X. euvesicatoria e X. gardneri) (ENCHEVA et al., 2015; HENRÍQUEZ et
al., 2014; SILBER, et al., 2013; NEDIALKOVA, 2005; MONCHEVA et al., 2002).
Tendo em vista o potencial biotecnológico dos micro-organismos capazes de
sobreviver em extremas condições e adaptados às baixas temperaturas, bem como
a possibilidade de produção de novas moléculas e moléculas adaptadas ou
modificadas com potencial para desenvolvimento de antibióticos a serem utilizados
no setor agrícola brasileiro, esse trabalho propôs a avaliação de extratos produzidos
por fungos isolados da Antártica quanto à sua atividade inibitória em três espécies
de Xanthomonas de interesse econômico: X. citri subsp. citri, X. axonopodis pv.
passiforae e X. euvesicatoria.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O gênero Xanthomonas
O gênero Xanthomonas (xanthos: amarelo e monas: entidade) compreende
27 espécies que coletivamente afetam aproximadamente 400 hospedeiros vegetais.
As espécies incluem diversos patovares e apresentam uma alta especificidade
hospedeiro-planta, em alguns casos exibindo especificidade de tecido (RYAN et al.,
2011).
As espécies que fazem parte desse gênero são em sua maioria bactérias
associadas a plantas e comumente não encontradas em outros ambientes. As
bactérias desse grupo não são invariavelmente patógenos, alguns isolados foram
encontrados em associação assintomática com tecidos vegetais ou como epífitos
(HAYWARD, 1993). Infecções por Xanthomonas ocorrem em pelo menos 124
monocotiledôneas e 268 espécies de dicotiledôneas (LEYNS et al., 1984).
As bactérias desse gênero são bastonentes, Gram-negativas, aeróbias
obrigatórias, não formadoras de esporos, e apresentam um flagelo polar. As
Xanthomonas são distribuídas mundialmente e os danos causados nos vegetais são
normalmente suficientes para causar perdas no rendimento. No Brasil muitas
doenças causadas por bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas afetam
culturas de grande importância econômica e social tais como: citros, mandioca,
tomate, feijão, maracujá, cana-de-açúcar (RYAN et al., 2011; RODRIGUEZ et al.,
2012).
11
Doenças causadas por Xanthomonas spp. geralmente tem início com

sementes contaminadas, porém os patógenos podem se disseminar para plantas
saudáveis devido à práticas agriculturais como poda, nebulização de canteiros,
assim como por águas de chuva, solos contaminados e insetos. As bactérias
crescem nas superfície das folhas como epífitas e invadem o hospedeiro por
aberturas naturais, como hidatódios e estômatos, ou através de feridas. Algumas
espécies do gênero sobrevivem no solo em associação com material vegetal morto,
formando um foco de contaminação em futuras plantações, que podem ser
infectadas através de ferimentos nas raízes (RYAN et al., 2011).
2.1.1. Câncro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri)
O cancro cítrico, causado pela X. citri subsp. citri (X. citri - XaC), é uma
doença que ataca todas as espécies e variedades de citros de importância
comercial. Regiões com clima favorável, como o Brasil, Índia, Japão, países do
sudeste asiático e algumas áreas dos Estados Unidos da América sofrem grandes
perdas econômicas por conta da doença (Figura 1). A doença ocorre
endemicamente em países da América do Sul como Argentina, Bolívia, Brasil,
Paraguai e Uruguai. No Brasil, o cancro cítrico é considerado um dos principais
problemas fitossanitários na cultura de citros no Brasil (SANCHES et al., 2014; CABI,
2017; EPPO, 2017).
Figura 1 - Distribuição mundial de Xanthomonas citri subsp. citri.
Fonte: CABI, online (2017).

12
O cancro cítrico tem grande importância para o setor citrícola brasileiro e o

fitopatógeno causador da doença se faz presente nos estados do Mato Grosso do
Sul, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Roraima, Santa Catarina e São Paulo
(CABI, 2017).
De acordo com levantamento feito em 2017 o cancro cítrico está presente em

12,92% dos talhões avaliados nas regiões do parque citrícola paulista e Triângulo
Mineiro confirmando o crescimento da incidência da doença. Na região Noroeste, a
mais afetada, Votuporanga apresentou a maior incidência, com 64,47% dos talhões
afetados pela doença. Já as regiões sul e sudoeste são as menos afetadas com
1,66% e 0,28% dos talhões com a doença, respectivamente. A região de
Votuporanga apresentou o maior nível de incidência da doença, com percentual de
54,16% de árvores sintomáticas, seguida por Duartina (16,79%), Matão (15,74%),
São José do Rio Preto (11,61%) e Bebedouro (9,08%). As regiões de Brotas,
Altinópolis, Porto Ferreira e Limeira apresentaram nível intermediário de incidência
enquanto que o Triângulo Mineiro, Itapetininga e Amaré foram as regiões com menor
percentual de árvores sintomáticas com valores respectivos de 0,62%, 0,56% e
0,19% (BEHLAU et al., 2017).
A primeira detecção de cancro cítrico no estado de São Paulo se deu no ano
de 1957 na região de Presidente Prudente de onde se disseminou para outras
regiões do país (BITANCOURT, 1957). Desde então, até hoje, o cancro cítrico foi
controlado por medidas de erradicação e exclusão com o intuito de eliminar ou pelo
menos evitar a disseminação da doença que causa a desfolha das plantas e
diminuição da produção e qualidade dos frutos (FEICHTENBERGER et al., 2005).
Atualmente, a legislação federal para o controle do cancro cítrico foi alterada,
principalmente devido ao recente aumento da doença. De acordo com a Instrução
Normativa nº37, de 5 de Setembro de 2016 o estabelecimento e manutenção da
situação fitossanitária com respeito ao cancro cítrico em território nacional depende
da incidência da doença na região. Assim foram estabelecidas 4 categorias: I – Área
com Praga Ausente, II – Área Livre de Praga (ALP), III – Área sob Erradicação ou
Supressão, e IV – Área sob Sistema de Mitigação de Risco (SMR) (BRASIL, 2016).
Com a nova legislação medidas de manejo também podem ser aplicadas,
dessa maneira plantas com sintomas podem ser mantidas e as medidas para
controle tem por objetivo a proteção dos frutos contra infecções, reduzindo o impacto
13
da doença na produção. A doença apresenta um ciclo composto por 4 fases:

disseminação, infecção, colonização e sobrevivência. Essas fases vão desde a
chegada da bactéria ao pomar até a continuidade da doença na área. A
disseminação é causada por diversos fatores, entre eles: ação de chuvas, ação
humana, maquinário contaminado, mudas e materiais de colheita infectados (Figura
2) (AMARAL, 2003).
Figura 2 - Disseminação de X. citri subsp. citri.
Causas de disseminação do cancro cítrico: chuvas,

equipamentos e mudas contaminados. Fonte: Fundecitrus
Araraquara.
A bactéria penetra na planta através de aberturas naturais, como os

estômatos, ou por ferimentos causados por equipamentos, atrito e por insetos como
o minador dos citros (AMARAL, 2003). As bactérias se multiplicam localmente no
ponto onde penetraram o tecido vegetal, assim o cancro cítrico não é uma doença
sistêmica. A partir do local onde penetraram, elas liberam enzimas para obtenção de
nutrientes através da degradação das células vegetais.
Devido à liberação das enzimas o tecido vegetal adquire aspecto encharcado
e escurecido. O processo também provoca a formação de lesões necróticas (Figura
3). O processo de colonização continua radialmente a partir do ponto de infecção.
Nessa etapa, a temperatura é fator essencial, com faixa mais favorável para
multiplicação entre 25 ºC e 35 ºC. A bactéria continua no pomar por meio de lesões
remanescentes de um ano para outro. Quando uma lesão é molhada a bactéria se
locomove para o filme de água na superfície da planta e dá inicio ao ciclo da doença
novamente (BEHLAU, SALA e BASSANEZI, 2017).
14
Figura 3 - Colonização de ramo, folha e fruto por X. citri subsp. citri.
Lesões necróticas aparecem. As bactérias são

ativas nas margens das lesões. Fonte:
FUNDECITRUS Araraquara.
De acordo com a legislação o controle do cancro cítrico depende da condição

fitossanitária da doença na área. Dentre as medidas de controle estão o uso de
mudas sadias, utilização de espécies ou variedades menos suscetíveis, o uso de
quebra ventos, a aplicação de cobre, o controle do minador de citros, o uso de
indutores de resistência e outras medidas complementares, como o controle do
acesso de pessoas e veículos aos pomares, desinfestação de equipamentos e
ferramentas e a inspeção dos pomares (FEICHTENBERGER et al., 2005; BEHLAU,
SALA, e BASSANEZI, 2017).
O uso de plantas resistentes pode reduzir as medidas complementares, pois
embora todas as espécies possam ser afetadas há uma diferença na suscetibilidade
das mesmas. Já o uso de quebra-ventos é essencial para pomares para fruta para
mesa, principalmente em regiões com alta incidência de ventos. O objetivo dos
quebra-ventos é formar um obstáculo, reduzindo a velocidade do vento e
consequentemente a disseminação da bactéria. O uso de cobre nos pomares não
previne a entrada do fitopatógenos, é uma medida que ajuda a reduzir a quantidade
de sintomas nas plantas e a queda dos frutos. Os produtos utilizados são à base de
cobre como o oxicloreto de cobre, hidróxido de cobre e óxido cuproso. Eles formam
uma camada protetora quando aplicados e evitam novas infecções. O controle do
minador dos citros é preventivo e realizado com inseticidas para diminuir a
ocorrência de ferimentos nas plantas (OLIVEIRA et al., 2008; BEHLAU, SALA e
BASSANEZI, 2017).
15
2.1.2. Bacteriose (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae)

A bacteriose, mancha-bacteriana ou mancha oleosa, causada pela bactéria X.
axonopodis pv. passiflorae (X. passiflorae – Xap) é uma das doenças mais severas
de ocorrência nos pomares de maracujá no Brasil (MUNHOZ et al., 2015), a doença
causa prejuízos econômicos significativos no país, visto que o Brasil se destaca
como sendo um dos principais produtores de maracujá do mundo.
O gênero Passiflorae reúne mais de 450 espécies de maracujá, das quais
cerca de 60 são comestíveis. O Brasil é o maior produtor de maracujá-amarelo ou
maracujá azedo do mundo. A região Nordeste é responsável pela maior parte da
produção de maracujá, com 64,90% da produção nacional. O estado da Bahia lidera
a produção com 297 328 toneladas produzidas (42,81%), seguido pelos estados do
Ceará, Espírito Santo, Minas Gerais e Pará conforme divulgado pela Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) em 2016 com base nos dados do
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) de 2015 (Figuras 4 e 5)
(EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, online).
Figura 4 - Produção de maracujá no Brasil por região.
Fonte: IBGE – Produção Agrícola Municipal, 2015.

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, consultado em
27/09/2016.
16
Figura 5 - Principais produtores de maracujá do país por estado.
Fonte: IBGE – Produção Agrícola Municipal, 2015.

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, consultado em
27/09/2016.
As regiões de maior produção do maracujá no país também são

regiões que oferecem condições ótimas de temperatura (temperaturas
maiores que 30 ºC e umidade elevada) e umidade para o desenvolvimento e
multiplicação da bactéria causadora da bacteriose (X. passiflorae) e a
principal razão das perdas relacionadas à doença é a dificuldade do controle.
Uma vez ocorre à infecção o controle químico do fitopatógeno torna-se
ineficiente, devido à alta taxa de multiplicação da bactéria (ISHIDA e
HALFELD-VIEIRA, 2009).
A primeira constatação da doença no Brasil ocorreu em 1969 na região
de Araraquara e é responsável por perdas expressivas durante os períodos
mais quentes e úmidos. Outros nomes por que é conhecida são mancha-
oleosa, crestamento-bacteriano, morte precoce ou bacteriose do maracujá
(FISCHER et al., 2005).
A disseminação entre áreas se dá pela contaminação de sementes e
mudas, entre plantas, ocorre pela água de irrigação ou chuvas, ventos e
insetos que se alimentam de folhas já lesionadas. Assim como a X. citri, os
sintomas causados por X. passiflorae aparecem nas folhas e frutos e a
contaminação se dá por aberturas naturais, como estômatos, ou por lesões
mecânicas (ISHIDA e HALFELD-VIEIRA, 2009).
17
Pequenas lesões de aspecto encharcado e translúcido são induzidas pelo

patógeno. Essas lesões passam por necrose e tornam-se marrom-avermelhadas
(Figura 6), podendo formar um halo ao redor da mancha. As lesões ocorrem
principalmente no lado dorsal da folha (FISCHER et al., 2005).
Figura 6 - Bacteriose do maracujá em folhas de maracujá-azedo.
Foto: EMBRAPA Amazônia Oriental
Conforme progride, a doença leva a perda das folhas e redução da

produtividade devido a seca das folhas afetadas. A bactéria pode então se propagar
por todo o tecido da planta se atingir os feixes vasculares, e causar a morte em
variedades mais sensíveis (ISHIDA e HALFELD-VIEIRA, 2009).
Nos frutos as manchas são esverdeadas, oleosas, grandes e bem delimitadas
no início (Figura 7) e podem se unir, dando origem a lesões de grandes extensões.
Embora as manchas sejam superficiais, se houver condições ideais, a polpa do fruto
pode ser comprometida pela penetração da bactéria, resultando na contaminação
das sementes e fermentação (FISCHER et al., 2005).
Figura 7 - Sintoma de bacteriose em fruto do maracujá-azedo.
Foto: EMBRAPA Amazônia Oriental.
As medidas de controle da bacteriose consistem na utilização de mudas e

sementes sadias que passam por tratamento térmico para erradicação da bactéria
18
como método preventivo. Na região do cerrado o manejo da bactéria é feito por

manejo integrado de controles químicos, cultural e genético (LIMA et al., 2006;
ISHIDA e HALFELD-VIEIRA, 2009).
O controle da cultura é feito pela instalação de plantios novos em áreas
afastadas de culturas contaminadas, adubação adequada, controle de plantas
invasoras, insetos e destruição de restos da cultura (Junqueira e Junqueira, 2007).
O uso de químicos a base de cobre, como o sulfato de cobre, em conjunto
com bactericidas é indicado para manejo da doença após poda de limpeza até a
ausência dos sintomas, embora tenha sido ineficaz em alguns casos relatados
(FISCHER et al., 2005). No entanto o uso de compostos cúpricos pode levar à
seleção de patógenos resistentes aos químicos.
Uma opção simples no controle da doença é a utilização de variedades
resistentes, enquanto o melhoramento genético das plantas ainda está em
desenvolvimento no país.
2.1.3. Mancha bacteriana (Xanthomonas euvesicatoria)
A mancha bacteriana, causada por X. euvesicatoria, anteriormente
denominada X. campestris pv. vesicatoria, é uma das doenças mais importantes da
cultura do tomate e pimentão no Brasil (MALAVOLTA JUNIOR, 2004). Esta doença
tem causado grandes perdas no cultivo do tomate reduzindo a produtividade pela
destruição de tecido foliar e pela derrubada de frutos em formação, além de
comprometer a qualidade e o valor comercial dos frutos (LOPES e QUEZADO-
SOARES, 2000).
Para o cultivo do pimentão em regiões ou épocas de umidade elevada e
temperaturas entre 25 ºC e 28 ºC a mancha bacteriana consiste na doença
bacteriana de maior importância. Em pimentão a doença pode afetas as plantas em
qualquer período do desenvolvimento e todas as partes aéreas são suscetíveis. A
incidência causa a queda das folhas e flores e lesões no caule e frutos de aparência
necrótica. Nas folhas os sintomas consistem em pequenas manchas de aparência
circular ou irregular, bem definidas e encharcadas na fase inferior das folhas. Mais
tarde as manchas se tornam pardas com bordas escuras. Já os frutos podem ser
colonizados após o aparecimento dos sintomas iniciais que são pequenas áreas
encharcadas que se tornam esbranquiçadas circundadas por halos pardos. A
contaminação pode atingir as sementes e favorecer o apodrecimento do fruto por
outros micro-organismos. A disseminação a longa distância pode ocorrer através de
19
sementes e em culturas através da água da chuva ou de irrigação em associação

com ventos (KUROZAWA e PAVAN, 2005).
Em qualquer idade todos os órgãos do tomateiro são suscetíveis à doença. A
penetração da bactéria em tomateiro se dá através de aberturas naturais, os
estômatos e hidatódios, e também por ferimentos. Após penetração o patógeno
começa a se multiplicar, mesmo com umidade do ar e do solo baixas e provocam um
amarelamento nos folíodos, sendo as folhas mais velhas e medianas as mais
afetadas. Pequenas áreas circulares ou irregulares de tecido encharcado formam os
primeiros sintomas nas folhas do tomateiro. Com o passar do tempo as manchas
sofrem necrose e passam a apresentam coloração parda em várias intensidades
(Figura 8). As áreas lesionadas quando secas tem aspecto brilhante se observadas
pela face inferior das folhas, devido a exsudados bacterianos (LOPES e QUEZADO-
DUVAL, 2010).
Figura 8 - Sintomas da mancha bacteriana em folhas e fruto do tomateiro.
Foto: EMBRAPA Hortaliças
Dependendo da variedade de tomateiro, tipo de solo, chuvas e ventos, o

tamanho e número de lesões são variados. Os sintomas iniciam-se como pequenas
áreas que necrosam e aumentam de tamanho, dando origem à lesões deprimidas ou
salientes (Figura 8). Em frutos pequenos a incidência pode levar a deformação ou
queda, e embora não leve a morte da planta adulta, pode reduzir a produtividade e
qualidade dos frutos (KUROZAWA e PAVAN, 2005).
As medidas de controle envolvem o uso de cultivares híbridos com alta
capacidade de brotação e recuperação aérea, mudas sadias e o uso de agrotóxicos
a base de cobre em conjunto com antibióticos agrícolas. O uso de antibióticos como
forma de controle tem sido abandonado devido ao alto custo e baixa eficiência,
provavelmente relacionado ao aparecimento de isolados resistentes aos produtos
20
empregados. E o uso de agrotóxicos depende de fatores como clima, sensibilidade

da população bacteriana e tecnologia de aplicação (LOPES e QUEZADO-DUVAL,
2010).
2.1.4. Controle de Xanthomonas
Como pode ser visto anteriormente, o controle das infecções causadas pelos
diversos patovares de Xanthomonas tem sido geralmente realizado por aspersão de
produtos químicos à base de cobre, erradicação de plantas contaminadas e uso de
variedades resistentes (SANCHES et al., 2014; LOPES e QUEZADO-SOARES,
2000) ou no caso do cancro cítrico no estado de São Paulo, pelo SMR. Porém, estas
medidas têm sido ineficientes, devido à acumulação de material químico no
ambiente, suscetibilidade de variedades supostamente resistentes e perdas de área
plantada. Assim, alternativas para o controle dos fitopatógenos são necessárias.
2.2. Biotecnologia de Micro-organismos

Micro-organismos, suas enzimas e demais produtos estão envolvidos na
produção em diversas áreas industriais, desde a medicina às aplicações ambientais
(HERBERT, 1992). A biotecnologia está profundamente interligada ao cotidiano, ela
se faz presente na produção de biocombustíveis, alimentos, bioinseticidas,
detergentes, medicamentos, e em muitas outras áreas (COKER, 2016).
A busca por micro-organismos capazes de suportar as condições dos
processos industriais é constante. Produtos biotecnológicos podem ser otimizados
de diversas maneiras, como a partir do uso de temperaturas extremas, da
salinização, modificação de pressão e pH e muitas vezes na presença de solventes.
Tais organismos podem ser encontrados em diversos ambientes geralmente
considerados extremos. Esses organismos adaptaram-se às condições de seu
ambiente, que se tornam ideais para seu crescimento e desenvolvimento
(HERBERT, 1992; CAVICCHIOLI et al., 2002; COKER, 2016).
Dentre as áreas biotecnológicas onde o uso de compostos oriundos de
organismos extremófilos teve sucesso encontramos enzimas utilizadas na produção
de biocombustíveis, organismos utilizados na extração de metais, o uso de
carotenoides na indústria alimentícia e cosmética. Já dentre as áreas com potencial
aplicação encontramos a produção de antibióticos, compostos com propriedades
antifúngicas e com atividade contra o câncer. Considerando o contexto de aplicação
industrial, a existência de micro-organismos eficientes em baixas temperaturas foi
21
proposta em várias aplicações biotecnológicas (VINCENT, 2000; CLARKE, 2003;

COKER, 2016;).
A necessidade de adaptação ao frio de todos os componentes de uma célula
microbiana implica em um vasto número de produtos celulares disponíveis para
aplicação biotecnológica. As enzimas adaptadas ao frio fazem parte desses
compostos, podendo ser aplicadas na indústria alimentícia, na área da biologia
molecular, cosméticos, e em processos de biotransformação. Amilases, proteases e
lipases produzidas por psicrófilos, por exemplo, são utilizadas como agentes
degradadores de polímeros em detergentes. Além de suas enzimas, os organismos
adaptados a baixas temperaturas apresentam outras aplicações. Na indústria
alimentícia, por exemplo, bactérias e fungos podem ser utilizados na produção de
iogurte e queijos, no amaciamento de carnes, modificação de sabor e na remoção
de lactose do leite (CAVICCHIOLI et al., 2002; SCHIRALDI e ROSA, 2002).
O interesse pelo emprego de metabólitos bioativos produzidos por
microrganismos em práticas agrícolas, como alternativa aos produtos químicos, vem
aumentando significativamente nos últimos anos, tanto na promoção de crescimento
vegetal como no controle de pragas e doenças de plantas, se constituindo em
potenciais substitutos de produtos químicos e com nenhum ou mínimo impacto
ambiental (DAYAN et al., 2009, LIM et al., 2010).
Os metabólitos secundários geralmente se acumulam durante a fase final da
fermentação, chamada idiofase, que ocorre após a fase de crescimento ativo. Os
compostos formados durante a idiofase não tem relação com o crescimento
microbiano ou com a síntese de material celular, assim os metabólitos secundários
são formados após o crescimento celular ser completado (CALVO et al., 2002).
Para a indústria de bioprocessos, a produção de metabólitos secundários de
valor econômico, como antibióticos, é a sua maior atividade. Como característica
geral, os metabólitos secundários não são essenciais ao crescimento, reprodução e
metabolismo normal microbiano. Esses compostos tem sua formação controlada
pelas condições de crescimento, e composição do meio de cultura, sendo
produzidos como um grupo de estruturas relacionadas entre si. São moléculas
muitas vezes bioativas com baixo peso molecular. A maioria dos metabólitos
secundários são moléculas orgânicas complexas, sendo geralmente produzidas a
partir de produtos intermediários que se acumulam no meio fermentativo ou nas
22
células microbianas durante o metabolismo primário (CALVO et al., 2002; KELLER

et al., 2005; NIGAM e SINGH, 2014).
Os antibióticos, por exemplo, são produtos do metabolismo secundário
produzidos por alguns micro-organismos. Essas substâncias tem a capacidade de
inibir o crescimento ou matar outros micro-organismos, mesmo em baixas
concentrações. O exemplo mais conhecido de inibição de crescimento é o
observado por Fleming em 1929, que levou a descoberta da penicilina, produzida
por Penicillium notatum.
Desde então, produtos naturais de fungos são considerados uma importante
fonte para novos compostos antimicrobianos, devido à grande diversidade de
espécies de fungos e as estruturas químicas altamente diversas de seus metabólitos
secundários. A sensibilidade dos micro-organismos, no entanto, varia, bactérias
Gram-positiva são mais sensíveis à antibióticos do que bactérias Gram-negativas
(NIGAM e SINGH, 2014).
A adaptabilidade e resistência dos micro-organismos capazes de sobreviver
em condições de estresse como as encontradas nas regiões da Antártica e do Ártico
sugerem, de modo general, a síntese de novos metabólitos com estruturas únicas e
atividade biológica específica (BRATCHKOVA e IVANOVA, 2011).
Estudos realizados com organismos da região Antártica revelam diversos
metabólitos secundários bioativos produzidos por esses isolados (GONÇALVES et
al., 2015; SVAHN et al., 2015). Previamente encontrado apenas nas bacitracinas de
Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis, um derivado de bacilamida (Figura 9A)
produzido por Bacillus sp. isolado da Antártica apresentou atividade contra o
dinoflagelado Cochlodinium polykrikoides (JEONG et al., 2003). Em 2007, Ivanova et
al. obtiveram microbiaeratina (Figura 9B), um novo alcaloide natural, a partir de
cultura de Microbispora aerata linhagem imbas-11A isolada de excrementos de
pinguins na Antártica.
23
Figura 9 - Estrutura de microbiaeratina (A) e bacilamida (B) isolados de micro-organismos

antárticos.
Fonte: Bratchkova e Ivanova , 2011.

Outras espécies de micro-organismos isolados do ambiente antártico e ártico
também foram estudados quanto a produção de substâncias bioativos e suas
estruturas. As estruturas de substâncias bioativas isoladas da linhagem
Streptomyces sp. 1010, que incluem o novo composto ácido 2-amino-9,13-dimetil
heptadecanóico, além do éster dioctílico de ácido hexanodióico e éter de polifenilo
são apresentadas na Figura 10 (IVANOVA et al., 2001).
Figura 10 - Compostos bioativos produzidos por Streptomyces sp. 1010.

Compostos com atividade antimicrobianas e antitumorais e pertencentes às
actinomicinas (Figura 11) foram produzidos pela linhagem Streptomyces flavovirens
67 isolada de solo na Antártica (IVANOVA et al., 2002).
24
Figura 11 - Actinomicinas com atividade biológica produzidas por Streptomyces flavovirens

67.

Micro-organismos isolados do Ártico como Penicillium islandicum, Penicillium
coprobium e Salegentibacter sp. linhagem T436 e Penicillium griseofulvum coletados
na Groenlândia também produziram susbtâncias bioativas (Figura 12)
(BRATCHKOVA e IVANOVA, 2011).
Figura 12 - Compostos bioativos produzidos por micro-organismos isolados de ambientes

frios
Ácido fúlvico produzido por Penicillium griseofulvum, estireno isolado de Penicillium

coprobium, emodina produzida por Penicillium islandicum e derivados de fenol isolados
de Salegentibacter sp. linhagem T436.
25
Rojas et al. (2009) isolaram bactérias de lagos da região antártica e avaliaram

a produção de extratos com atividade antimicrobiana. Dos isolados, 122 bactérias
mostraram atividade contra as bactérias Gram-positivas Staphylococus aureus e em
menor grau em Enterococus faecium e contra Escherichia coli, bactéria Gram-
negativa. Além de atividade antibacteriana, algumas linhagens isoladas
apresentaram atividade antifúngica contra Cryptococcus neoformans, Aspergillus
fumigatus e Candida albicans em diferentes níveis. Fracionamento dos extratos
mostrou que duas linhagens de Arthtobacter agilis produziu compostos fortemente
antibacterianos possivelmente relacionados a novos peptídeos tiazolílicos cíclicos.
Em 2011, Shekh et al. também isolaram bactérias com capazes de inibir
linhagens de Candida albicans.
Estudos recentes também evidenciam o potencial de fungos do ambiente
antártico em produzir metabólitos secundários bioativos contra fungos como Candida
albicans, Candida krusei e Cladosporium sphaerosperum (FURBINO et al., 2014).
Gonçalves et al. (2015) produziram extratos etanólicos de fungos filamentosos
isolados de solo da rizosfera os quais mostraram atividade antifúngica,
antimicrobiana e tripanocida com atividade moderada em células normais. A análise
espectral dos extratos indicou presença de compostos contendo um sistema de anel
aromático altamente funcionalizado. Henríquez et al. (2014) verificaram o potencial
bioativo de 101 fungos isolados. Extratos fúngicos foram avaliados e cerca de 51%
dos extratos apresentaram atividade antimicrobiana contra alguma das bactérias
testadas enquanto que 42% dos extratos mostrou atividade antitumoral e o potencial
para produção de antioxidantes foi moderado. A atividade antibacteriana de um
número crescente de fungos que vivem na Antártica está sendo investigada para a
descoberta de novos compostos antibacterianos. (FURBINO et al., 2014; CHEUNG
et al., 2014).
Dessa maneira, o conhecimento da diversidade fúngica e o potencial
biotecnológico dos microrganismos da Antártica, são de extrema relevância e
estratégico para o conhecimento da dinâmica dos ecossistemas antárticos e para a
obtenção de compostos naturais de valor agregado (PIKUTA et al., 2007).
2.2.1. Potencial dos fungos antárticos contra Xanthomonas

Fungos são micro-organismos conhecidos por produzirem uma variedade de
metabólitos secundários. Muitas vezes esses metabólitos são únicos para
26
determinada espécie microbiana. Alguns metabólitos secundários produzidos por

fungos isolados do Ártico e da Antártica foram descritos. Dentre eles, Li et al. (2008),
relataram 5 novos derivados de ácido astérico produzidos por Geomyces sp. isolado
na Antártica cujo extrato apresentou atividade antifúngica e antimicrobiana: asterato
de etilo (sinteticamente conhecido), asterato de n-butilo, e outros 3 novos complexos
derivados de ácido astérico denominados geomicinas A-C (Figura 13), além de 3
compostos conhecidos (ácido astérico, 7-metilasterato e bisdechlorogeodina).
Figura 13 - Estruturas de metabólitos produzidos por Geomyces sp. isolado da Antártica
6: Geomicina A, 7: Geomicina B e 8: Geomicina C. Fonte: Li et al. 2008.
Os metabólitos secundários tem despertado grande interesse como possíveis

alternativas para o combate a diversas espécies de Xanthomonas (MURATE et al.
2015; SPAGO et al., 2014). Estudos recentes de metabólitos secundários
produzidos por micro-organismos do ambiente antártico demonstraram uma
potencial atividade antibacteriana destes metabólitos contra algumas espécies de
Xanthomonas (X. campestris, X. axonopodis pv. glycines, X. vesicatoria, X.
axonopodis pv. phaseol, X. euvesicatoria) (ENCHEVA-MALINOVA et al., 2015;
HENRÍQUEZ et al., 2014; SILBER, et al., 2013; MONCHEVA et al., 2002).
Um estudo realizado em 2002 mostrou que actinobactérias isoladas do solo da
antártica apresentaram atividade contra X. axonopodis pv. glycines, X. euvesicatoria,
X. axonopodis pv. phaseol, causadoras respectivamente de doenças nas culturas de
soja, tomate e feijão (MONCHEVA et al., 2002). Em 2014 Henríquez e
colaboradores mostraram a atividade de 22 fungos associados a amostras de
esponjas coletadas na Antártica contra a bactéria X. campestris, que é uma espécie
de bactéria que causa uma variedade de doenças de plantas.
27
Estudos realizados por Encheva-Malinova e colaboradores mostraram a

atividade de extratos brutos produzidos por microrganismos isolados do solo da
Antártica contra as bactérias X. vesicatoria, X. euvesicatoria e X. gardneri,
causadoras da mancha bacteriana na pimenta (ENCHEVA-MALINOVA et al., 2014;
ENCHEVA-MALINOVA et al., 2015).
Considerando a necessidade atual de novas alternativas no controle a
espécies de Xanthomonas, que visam substituir os produtos cúpricos e ao mesmo
tempo minimizar danos ao ambiente, este trabalho vem contribuir para o estudo de
compostos produzidos por fungos isolados do solo da Antártica com potencial ação
contra três espécies de Xanthomonas, que causam sérios prejuízos a algumas
culturas do país.
3. OBJETIVOS
Produzir extratos contendo metabólitos secundários de fungos filamentosos

isolados de solo na Antártica com ação antibacteriana contra X. citri subsp. citri, X.
axonopodis pv. passiflorae e X. euvesicatoria
3.1. Objetivos específicos
Selecionar fungos produtores de metabólitos secundários com potencial ação
antibacteriana contra fitopatógenos do gênero Xanthomonas, determinar a
concentração mínima dos extratos para inibição de 90% das células bacterianas, a
concentração bactericida dos extratos brutos, e iniciar o processo de purificação
desses extratos.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Reativação dos fungos filamentosos
Os trinta e três fungos filamentosos utilizados no projeto foram isolados de
solo abaixo de madeira em decomposição, coletados na Ilha de Deception na
Antártica por Alysson Wagner Fernandes Duarte sob orientação da Prof.ª Dr.ª Lara
Durães Sette (UNESP, Rio Claro) durante expedição PROANTAR (OPERANTAR
XXXII) realizada em novembro/dezembro de 2013 no âmbito do projeto INCT
Criosfera (Coordenado pelo Prof. Jefferson Simões, UFRGS).
Esses isolados fazem parte do acervo de fungos da coleção de pesquisa da
Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP) e encontram-se
preservados à -80 ºC. Os isolados foram reativados em placas de Petri contendo
meio de cultura Agar Malte 2% (MA) e incubados em estufa tipo BOD durante 10
28
dias a 15 ºC. Os fungos filamentosos foram examinados quanto à sua pureza para a
produção dos extratos, e preservados pelo método de Castellani (CASTELLANI,
1939).
4.2. Produção de extratos metabólicos brutos fúngicos
4.2.1. Cultivo microbiano
Após o período de incubação em placa de Petri, três quadrados de
aproximadamente 5 mm x 5 mm de área contendo ágar e micélio foram transferidos
para erlenmeyers de 250 mL contendo 180 mL de caldo malte 2%. Os erlenmeyers
foram mantidos em incubadora shaker durante 20 dias à 15 ºC e 150 rpm para
produção de metabólitos secundários (Figura 14). O cultivo foi realizado em triplicata
para todos os isolados.
Figura 14 - Produção de metabólitos secundários.
Produção à 15 ºC e 150 rpm por 20 dias. Fonte:

Arquivo pessoal.
4.2.2. Separação da biomassa microbiana e caldo bruto

Empregou-se o método de filtração a vácuo para a separação entre a
biomassa microbiana que contém metabólitos intracelulares e o caldo bruto
que compreende o meio extracelular que contém metabólitos. Posteriormente
a biomassa e o caldo bruto passaram por centrifugação para assegurar uma
boa separação entre as duas partes.
4.2.3. Extração de metabólitos extracelulares (Figura 15A)
Os metabólitos extracelulares foram extraídos do caldo bruto através
de extração líquido-líquido com o solvente orgânico acetato de etila em funil
de separação. Esse método separa uma mistura com base nas diferentes
solubilidades de seus componentes em dois líquidos imiscíveis, formando
uma fase aquosa e uma fase orgânica. A fase aquosa foi autoclavada e
descartada enquanto que a fase orgânica contendo os metabólitos foi
separada para posterior evaporação do solvente.
29
4.2.4. Extração de metabólitos intracelulares (Figura 15B)

A extração dos metabólitos intracelulares foi realizada via maceração da
biomassa em almofariz na presença do solvente metanol. A fase orgânica contendo
os metabólitos foi submetida à centrifugação para eliminação de partículas celulares
que poderiam estar presentes. O sobrenadante foi separado para evaporação do
solvente e as partículas insolúveis foram descartadas após tratamento.
4.2.5. Concentração dos extratos metabólicos produzidos (Figura 15C)
Os extratos contendo os metabólitos (extra e intracelulares) foram
concentrados por evaporação de parte dos solventes em evaporador rotativo
seguida de secagem completa em concentrador de amostras com pressão de ar a
40ºC. Os extratos secos foram acondicionados em microtubos em geladeira a 10ºC.
Os solventes recuperados no evaporador rotativo foram destilados para serem
reutilizados nas extrações.
Figura 15 - Obtenção de extratos contendo metabólitos secundários.
A B C
(A) Extração líquido-líquido do caldo bruto filtrado com acetato de

etila. (B) Rompimento celular da biomassa filtrada e extração com
metanol. (C) Retirada do solvente em evaporador rotativo (60 rpm
e 45ºC). Fonte: Arquivo pessoal.
4.2.6. Preparo dos extratos para avaliação da atividade antibacteriana

De forma a realizar um bioensaio uniforme, os extratos secos tiveram sua
massa determinada e foram dissolvidos em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) 10%
para concentração final de 30 mg/mL. Os extratos diluídos foram armazenados em
congelador a -4 ºC. Os extratos foram nomeados de acordo com o código do isolado
e o tipo de extrato (exemplo: o isolado DMP deu origem a dois extratos: DMPi
(intracelular) e DMPe (extracelular).
30
4.3. Avaliação in vitro da atividade antibacteriana dos extratos brutos

produzidos
Todos os extratos brutos foram testados quanto à sua capacidade de inibição
do crescimento em três isolados do gênero Xanthomonas: X. citri subsp. citri
linhagem selvagem 306, gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Henrique Ferreira da
UNESP de Rio Claro; X. euvesicatoria (isolado IBSBF1387), isolado de pimenta em
Brasilândia – MG e X. axonopodis pv. passiflorae (isolado LM4a), isolada de
maracujá azedo em Limeira – SP, estes dois isolados foram gentilmente cedidos
pela Prof.ª Drª Maria Lúcia Carneiro Vieira da ESALQ/USP. Os fitopatógenos foram
mantidos em ultrafreezer -80 ºC para preservação utilizando glicerol 20% como
crioprotetor.
4.3.1. Ensaio de viabilidade celular – Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA)
A avaliação da atividade antibacteriana dos extratos foi feita pelo método
REMA. Esse bioensaio baseia-se na redução da resazurina (corante azul), quando
há metabolismo celular, para a substância resorufina, que apresenta cor rosa e é
altamente fluorescente. Os testes foram executados em placas de 96 poços e os
extratos foram testados juntamente com os controles positivo (CP), de veículo (CV) e
negativo (CN).
Os extratos armazenados a 30 mg/mL em DMSO 10% foram diluídos em
meio NYG (0,3% extrato de levedura; 0,5% de peptona bacteriológica e 2% de
glicerol) até concentração de 2,1 mg/mL (17,5 µL de extrato em 232,5 µL de NYG)
de forma que a concentração de DMSO presente nos extratos foi de 0,7%. Em
seguida os extratos (X) foram testados quanto a sua capacidade inibitória frente a
Xanthomonas. O bioensaio seguiu o protocolo de Silva e Ferreira (2013), com
algumas modificações. O CP foi preparado a partir de uma solução estoque de
canamicina (20 mg/mL), a qual foi diluída duas vezes, uma para 200 mg/mL (10 µL
do estoque em 990 µL de H20d.e.) e depois para 20 µg/mL (50 µL em 450 mL de meio
NYG). Uma solução de DMSO 1% preparada em meio NYG (5 µL DMSO 100% em
495 µL de meio NYG) foi o CV utilizada nesse teste.
A placa de 96 poços foi preparada da seguinte maneira: 90 µL de meio NYG
foram adicionados nas colunas 1 e 12 para prevenir evaporação, CN foi feito
diretamente na placa adicionando-se 90 µL de meio NYG e 10 µL do inóculo
bacteriano diluído na coluna 11. Quatro poços da coluna 10 receberam 100 µL da
solução de canamicina a 20 µg/mL e em quatro poços foi adicionado 100 µL de
31
DMSO 1%. Nas colunas de 2 a 9, exceto na primeira linha (linha A), foram
adicionados 90 µL de meio NYG. Os extratos a serem testados foram adicionados
na linha A (200 µL) e seguiu-se uma diluição seriada e então a adição do inóculo
bacteriano.
O inóculo bacteriano (IB) contendo X. citri subsp. citri, X. euvesicatoria ou X.
axonopodis pv. passiflorae foi feito transferindo uma alçada de bactéria cultivada
previamente em meio sólido NYG e incubada por 2 dias à 29 ºC em estufa BOD para
frasco coletor contendo 30 mL de meio líquido NYG. O frasco coletor foi incubado a
200 rpm e 29 ºC até D.O600 = 0,8. O inóculo foi cultivado a 29 ºC e 200 rpm em
incubadora SHAKER por aproximadamente 14h, onde a Densidade Óptica medida a
600nm é de 0,8 (D.O.600 = 0,8). Após atingir a D.O.600 desejada o inóculo foi diluído
1:10 em meio NYG e 10 µL foram adicionados nos poços da placa, exceto nas
colunas 1 e 12, assim temos padronizado que a concentração de células por poço é
de 105 UFC para os três fitopatógenos.
A placa foi incubada a 29 ºC por 18h, em seguida 15 µL de uma solução de
resazurina 0,01% (w/v) foi adicionada e a placa novamente levada para incubação à
29 ºC por 1 h e trinta minutos. A Figura 16 mostra um esquema de placa de 96
poços utilizada para o teste de inibição antes da adição de resazurina.
Figura 16 - Esquema de placa 96 poços para REMA com extratos brutos.
A1 a A8 referem-se as colunas de 2 a 9 da placa de 96 poços. X: extrato bruto. IB: Inóculo

Bacteriano. NYG: meio de cultivo. CP: controle positivo – canamicina 0,020 mg/mL. CV: controle do
veículo – DMSO 1%. Concentração do extrato: (A) 2,1 mg/mL, (B) 1,05 mg/mL, (C) 0,525 mg/mL, (D)
0,2625 mg/mL, (E) 0,13125 mg/mL, (F) 0,065625 mg/mL, (G) 0,032813 mg/mL e (H) 0,016406
mg/mL. Fonte: Arquivo pessoal.
32
Após o período de incubação a fluorescência apresentada foi mensurada a

530 nm (excitação) e 590 nm (emissão) usando um espectrômetro de fluorescência
Biotek Synergy H1MFD.
A porcentagem de inibição do crescimento bacteriano é definida pela fórmula
abaixo, onde UF são as Unidades de Fluorescência.
[(𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑈𝐹 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜) − (𝑈𝐹 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒)]
× 100
(𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑈𝐹 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜)
Foram considerados positivos os extratos que apresentaram porcentagem de
inibição igual ou superior a 90, tendo em vista os valores de desvio padrão
apresentados pelos mesmos.
4.3.2. Triagem e Avaliação da Atividade Antibacteriana dos Extratos Brutos

Os extratos foram primeiramente avaliados em triagem por uma modificação
no protocolo seguido para REMA descrito no item 4.3.1.. Uma modificação na
disposição dos extratos e microdiluição na placa foram realizadas para que 16
extratos fossem avaliados por experimento.
Os extratos positivos durante a triagem foram avaliados segundo o método
REMA descrito anteriormente. Neste foi realizado uma microdiluição completa dos
extratos, sendo oito extratos avaliados por microplaca nas seguintes concentrações
(mg/mL): 2,1; 1,05; 0,525; 0,262; 0,131; 0,065; 0,032 e 0,016. A avaliação completa
foi realizada em triplicata em experimentos independentes.
4.4. Concentração Inibitória Mínima (CIM90) dos extratos bioativos

Os dados de porcentagem inibitória obtidos pelo ensaio de viabilidade celular
foram utilizados para a construção de curvas de regressão polinomial para cada
extrato bioativo. Um modelo de equação obtida pode ser visto na Figura 17. Os
valores para CIM90, isto é, a concentração de extrato bruto necessária para a
inibição do crescimento de 90% de células bacterianas, foi determinada com base
na equação obtida da curva de regressão.
33
Figura 17 - Gráfico para determinação da curva de regressão de um extrato.
4.5. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos

A CBM foi determinada pela inoculação do conteúdo da microplaca de 96
poços contendo os extratos e a bactéria (após a incubação a 29 ºC por 18h, e antes
da adição de resazurina) em placa de Petri (150 x 15 mm) contendo meio Ágar NYG
usando um repicador de colônias (Figura 18).
Figura 18 - Repicador de colônias utilizado para inoculação em placas de Petri com meio
NYG para determinação da CBM.
Fonte: Arquivo pessoal.

As placas foram incubadas por 48 horas a 29 ºC em estufa bacteriológica. A
Figura 19 apresenta um exemplo do bioensao bactericida, o crescimento bacteriano
foi analisado visualmente, e para os extratos, em que não houve o crescimento
bacteriano, foi determinada a CMB. O teste foi realizado em triplicata em três
experimentos independentes para cada espécie de Xanthomonas. Na Figura 18 as
colunas de 2 a 9 representam a maior concentração de extrato. A coluna 10 contém
o CP e CV. O CN é representado pela coluna 11.
34
Figura 19 - Determinação da CBM em placa de Petri.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

4.6. Identificação dos fungos filamentosos
Os fungos filamentosos que produziram extratos bioativos contra pelo menos

uma das três espécies de Xanthomonas foram enviados ao grupo de estudo da
Prof.ª Dr.ª Lara Durães Sette para identificação via taxonomia molecular. Extração
do DNA foi feita diretamente no micélio após crescimento do isolado em meio malte
2% por período de 7 a 14 dias a 15ºC seguindo uma versão modificada do método
CTAB (Möller et al., 1992; Palazzo et al., 2004).
Os primers utilizados para amplificação do espaçador interno transcrito
(internal transcribed spacer – ITS) foram ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) e
ITS5 (5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’) (Schoch et al., 2012). As reaçaõ de
PCR foram realizadas em volume final de 25 25 μL (4 μL de dNTPs [1.25 mm cada];
5 μL de tampão 5x; 1 μL de BSA [1 mg mL-1]; 2 μL de MgCl2 [25 mm]; 1 μL de cada
primer [10 μm]; 0.2 μl de Taq polimerase [5 U μL-1], 2 μL of DNA genômico diluído
[1:100], e 8.8 μL de água ultra pura). As condições de PCR para ITS foram 94 ºC/3
min seguido de 35 ciclos à 94 ºC/1min e 72 ºC/2min. Os produtos do PCR foram
purificados utilizando as enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina termosensível
FastAP.
O DNA genômico foi quantificado em NanoDrop (Thermo Scientific) e
submetido a reação de sequenciamento utilizando kit BigDye Terminator v.3.1 (Life
Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. As sequências obtidas
foram comparadas com sequências do banco de dados do NCBI – GenBank.
Alinhamentos foram feitos separadamente para cada marcador molecular usando
35
MAFFT v.7 (KATOH e STANDLEY, 2013). A análise filogenética foi feita usando o
programa MEGA v. 7 (TAMURA et al., 2013). O modelo Kimura 2-parâmetros The
Kimura 2-parameter model (KIMURA, 1980) foi utilizado para estimar a distância
evolucionária para Máxima Parcimônia. O Branch support foi calculado por bootstrap
com 1000 corridas repetidas.
4.7. Purificação dos extratos bioativos

Extratos ativos contra os fitopatógenos foram submetidos a diversos métodos
de fracionamento. O método empregado variou de acordo com as características de
eluição, baseadas nas placas cromatográficas de sílica (Cromatografia em Camada
Delgada – CCD) cada extrato. Para a CCD foram utilizados placas de sílica (TLC
Silica gel 60 F254 MERCK) de dimensões 2 cm x 5 cm e para detecção os
reveladores p-anisaldeído (detector universal) e detecção ultra-violeta à 254
nm(UV254), inicialmente, e depois orcinol e ninidrina de forma a detectar uma maior
quantidade de compostos.
4.7.1. Fracionamento do extrato 3MPe

4.7.1.1. Cromatografia em fase normal
O extrato extracelular do isolado 3MPe foi fracionado em coluna
cromatográfica de 5 mL com Sílica Gel 60 (Ø 0,2 a 0,5 mm) e fase móvel gradiente
constituída de acetato de etila, acetato de etila:metanol (1:1), metanol e
metanol:ácido acético (19:1). Frações de 500 µL foram coletadas e agrupadas de
acordo com similaridade em CCD em metanol utilizando como detectores UV254 e p-
anisaldeído. Após agrupamento as amostras foram secas em concentrador de
amostras. As frações obtidas após o fracionamento foram testadas pelo método
REMA quanto à atividade inibitória em X. citri subsp. citri.
4.7.2. Fracionamento do extrato 10.4MPi

O extrato 10.4MPi passou por diversos processos cromatográficos de maneira
a se encontrar a melhor metodologia a ser seguida para esse extrato.
A aplicação do extrato 10.4MPi em placa cromatográfica (TLC Silica gel 60
F254 MERCK) para cromatografia em camada delgada (CCD) utilizando como fase
móvel diclorometano:acetato de etila (1:1) e acetato de etila:metanol:diclorometano
(8:1:1) e como reveladores UV254 e p-anisaldeído mostrou que o extrato contém
moléculas com polaridade alta em sua composição, assim inicialmente o
fracionamento foi feito por cromatografia por exclusão molecular.
36
4.7.2.1. Cromatografia em coluna por exclusão molecular

A resina SephadexTM LH-20 (GE Healthcare) foi utilizada como fase
estacionária e a purificação foi conduzida em modo isocrático com metanol como
fase móvel em coluna cromatográfica de 10mL. Frações de 500 µL foram coletadas
em microtubos e aplicadas em placas para CCD em acetato de
etila:metanol:diclorometano (8:1:1) e metanol para acompanhamento do processo
cromatográfico e pureza das frações utilizando p-anisaldeído como revelador.
Frações similares entre si foram então agrupadas e o solvente retirado em
concentrador de amostras, seguido de determinação da massa de cada fração
obtida.
Depois de verificada a eficiência do método empregado, uma nova amostra
do extrato foi injetada em diferentes condições. O segundo fracionamento desse
extrato foi conduzido em coluna de 25 mL. Um total de 261,5 mg do extrato 10.4MPi
foi inserido em coluna contendo a mesma resina como fase estacionária e fase
móvel gradiente: metanol, metanol:água (9:1) e água. As frações coletadas variaram
em volume de 500 µL a 1 mL e foram aplicadas em placas de sílica para CCD em
acetato de etila:hexano (8:2). Frações similares foram agrupadas e tiveram sua
massa determinada após secagem em concentrador de amostras.
Ainda considerando um melhor desempenho na purificação do extrato
10.4MPi e seus componentes como sendo altamente polares, optamos por uma
purificação desse extrato por extração em fase sólida (Solid Phase Extraction –
SPE) com sílica derivatizada com grupos ciano. Dessa maneira, 157,4 mg do extrato
foi inserida em cartucho (SPE Strata® CN Phenomenex 55 µm, 70 Å, 200 mg/3 mL).
A eluição na coluna foi conduzida de forma gradiente com os seguintes solventes:
diclorometano:hexano (1:1), metanol:hexano (1:1), metanol:hexano (3:1),
metanol:hexano (9:1), metanol, metanol:água (1:1) e água. As frações foram
aplicadas em placas de sílica para CCD e agrupadas por similaridade utilizando p-
anisaldeído, detecção ultra-violeta, orcinol e ninidrina. Em seguida, o solvente foi
evaporado e a massa das frações determinada por pesagem.
Devido ao bom desempenho cromatográfico o procedimento em coluna SPE
Strata® CN Phenomenex foi repetido com 196 mg do extrato.
4.7.2.3. Cromatografia em fase reversa

37
Buscando outra maneira de fracionar o extrato 10.4MPi, 108 mg do extrato

foram purificados por cromatografia de fase reversa em coluna C8 (HiPrep Octyl FF
16/10, GE Healthcare) utilizando como fase móvel água, etanol 20%, etanol 30%,
etanol 50%, etanol 60% e etanol 70%. Essa purificação foi realizada de maneira a
separar os compostos mais polares que compõem o extrato bruto dos extratos
menos polares. As frações similares foram agrupadas, concentradas e pesadas. O
procedimento foi repetido com massa inicial do extrato de 156,7 mg e 199,8 mg.
4.7.2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE
Duas amostras originadas da cromatografia em fase reversa (4.7.2.4.) foram
enviadas para realização de CLAE. A amostra P1 (200 mg) foi dissolvida em 2 mL
de solução metanol:água (1:1) e 1 mL foi injetado em coluna preparativa para
interação hidrofílica (Luna® 5µm HILIC 200Å 250 x 21,2 mm) para Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência com fase móvel água:metanol com 0,1% de ácido fórmico
em gradiente de 98-80% de metanol. Após o final da cromatografia foram injetados
mais 1 mL da mesma amostra. A amostra P2 (137,3 mg) foi dissolvida em 1 mL de
solução metanol:água (1:1), e injetada em CLAE nas mesmas condições descritas
acima. Frações foram coletadas por minuto quando não houve detecção em UV250
ou UV350 e no caso de detecção, de acordo com os picos formados no
cromatograma. As frações obtidas tiveram sua massa determinada após secagem
em concentrador de amostras.
4.8. Atividade inibitória das frações cromatográficas

As frações obtidas nas etapas cromatográficas descritas acima, quando em
massa suficiente, foram submetidas novamente ao bioensaio de atividade
antibacteriana descrito no item 4.3.1.. As amostras foram dissolvidas em
dimetilsulfóxido (DMSO) 1% (v/v) até concentração de 2 mg/mL ou 10 mg/mL. Para
a realização do bioensaio, as amostras foram diluídas quando necessário para 2
mg/mL diretamente na placa REMA.
Frações que apresentaram atividade inibitória foram enviadas para análise via
espectrometria de massas para verificar a purificação das mesmas e determinar a
massa molecular do composto bioativo.
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Produção de extratos metabólicos brutos
Os 33 fungos filamentosos foram reativados com sucesso em meio de cultura
malte 2%. A Figura 20 mostra os isolados após 14 dias de cultivo à 15 ºC.
Após o período de cultivo em agitação para produção de metabólitos
secundários e posterior filtragem, o meio metabólico e a biomassa foram submetidos
aos processos de extração obtendo-se ao final um total de 66 extratos (33
extracelulares e 33 intracelulares). Os extratos secos foram pesados e armazenados
em microtubos e preservados em geladeira a 10 ºC.
Conforme pode ser observado na Tabela 1, houve uma diferença na obtenção
de extratos extracelulares e intracelulares. Na extração extracelular foi obtido uma
massa média de extrato de 37 mg. A extração intracelular apresentou maior
rendimento, com média de extratos intracelulares obtida de 113 mg. A diferença
entre massa obtida deve-se, provavelmente, ao método de extração e ao solvente
empregado na extração.
O metanol, empregado na extração intracelular, é um solvente altamente
polar e capaz de extrair um maior número de moléculas quando comparado ao
acetato de etila utilizado na extração extracelular. Como resultado, o número de
impurezas presentes no extrato intracelular também deve ser maior.
Como a quantidade obtida de alguns extratos foi relativamente baixa para
realização de algumas etapas do projeto (principalmente de purificação) e para
serem armazenados na extratoteca, vários destes extratos foram produzidos em
maior quantidade.
39
Figura 20 - Fungos filamentosos isolados de solo abaixo de madeira em decomposição na

região Antártica

40
Tabela 1 - Média de produção de extratos para cada isolado.
Massa Média Massa Média

Extrato Extrato
(mg) (mg)
1MPe 25,60 1MPi 98,20
2MPe 21,00 2MPi 85,00
3MPe 28,00 3MPi 114,70
4MPe 34,70 4MPi 189,80
5MPe 90,00 5MPi 79,00
6MPe 33,16 6MPi 227,90
7MPe 77,30 7MPi 70,20
8MPe 64,10 8MPi 58,30
9MPe 67,80 9MPi 89,85
10MPe 58,40 10MPi 108,90
10.1MPe 46,00 10.1MPi 69,80
10.2MPe 52,50 10.2MPi 86,15
10.4MPe 32,40 10.4MPi 157,40
10.5MPe 64,10 10.5MPi 195,80
10.6MPe 62,10 10.6MPi 132,60
10.7MPe 28,90 10.7MPi 55,80
10.8MPe 34,95 10.8MPi 105,75
10.AMPe 51,90 10.AMPi 79,60
10.BMPe 11,45 10.BMPi 98,30
CMPe 32,50 CMPi 90,50
DMPe 51,90 DMPi 102,35
EMPe 13,90 EMPi 287,00
FMPe 13,70 FMPi 227,20
1Mae 4,30 1MAi 55,60
2Mae 33,15 2MAi 134,60
3Mae 30,60 3MAi 140,80
4Mae 29,15 4MAi 78,90
5Mae 24,70 5MAi 101,60
6Mae 26,90 6MAi 133,40
7Mae 14,65 7MAi 67,90
8Mae 24,10 8MAi 46,90
9Mae 16,75 9MAi 38,90
10Mae 21,30 10MAi 120,90
(e): extrato extracelular. (i): extrato intracelular
Os extratos obtidos estão armazenados na extratoteca, a qual já está sendo
utilizada por outro pesquisador (Prof.ª Dr.ª Leticia Veras Costa Lotufo) para
realização de testes antitumorais.
41
5.2. Ensaio de viabilidade celular – Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA)

5.2.1. Triagem dos extratos brutos
O potencial antibacteriano dos extratos, produzidos pelos 33 fungos
filamentosos foi avaliado frente às bactérias fitopatogênicas X. citri subsp. citri, X.
euvesicatoria e X. axonopodis pv. passiflorae. Os resultados obtidos para os extratos
intracelulares (i) podem ser visualizados na Tabela 2 e para os extracelulares (e) são
apresentados na Tabela 3. Extratos que inibiram no mínimo 90% do crescimento
bacteriano foram considerados positivos e selecionados para prosseguimento dos
experimentos. A triagem foi realizada em duplicata.
Tabela 2 - Triagem qualitativa dos extratos intracelulares quanto à atividade
antibacteriana em Xanthomonas spp.
Xanthomonas
Xanthomonas Xanthomonas citri
Fungo axonopodis pv.
euvesicatoria subsp. citri
passiflorae
3MP - - +
5MP + + +
6MP - - +
10MP - - +
10.1MP + + +
10.4MP - - +
10.5MP - - +
10.8MP + + +
CMP + + +
2MA + - +
(+): Positivo para inibição do crescimento celular a 2,1 mg/mL.(-): Negativo para inibição do
crescimento celular a 2,1 mg/mL. Valor de corte: 90%.
42
Tabela 3 - Triagem qualitativa dos extratos extracelulares quanto à atividade

antibacteriana em Xanthomonas spp.
Xanthomonas
Xanthomonas Xanthomonas citri
Fungo axonopodis pv.
euvesicatoria subsp. citri
passiflorae
3MP + + +
6MP + + +
10.4MP - + +
10.6MP + + -
CMP - - +
EMP + - +
FMP - - +
10MA - + -
(+): Positivo para inibição do crescimento celular a 2,1 mg/mL.(-): Negativo para inibição do
crescimento celular a 2,1 mg/mL. Valor de corte: 90%.
Vários fungos inibiram o crescimento bacteriano de Xanthomonas spp. assim

como previamente relatado em estudos sobre a bioatividade dos micro-organismos
de ambientes extremos como a Antártica. Catorze fungos produziram metabólitos
capazes de inibir o crescimento microbiano de pelo menos uma das espécies de
Xanthomonas que foram testadas. Estes fungos produziram extratos ativos
extracelulares (8) e intracelulares (10) ativos.
Dos 66 extratos testados, 18 extratos apresentaram atividade inibitória
significativa em pelo menos uma das espécies de Xanthomonas em que foi testada.
Dentre os 18 extratos, 9 foram positivos contra X. euvesicatoria, 9 foram positivos
contra X. axonopodis pv. passiflorae e 16 apresentaram atividade contra X. citri
subsp. citri, todos com inibição maior ou igual à 90% in vitro.
Entre os 18 extratos brutos bioativos, 10 foram extraídos do meio intracelular
e 8 do meio metabólico. Os fungos 3MP, 6MP, 10.4MP e CMP foram os únicos que
produziram extratos com compostos bioativos tanto intra como extracelularmente.
Dentre os extratos positivos, os extratos 3MPe, 5MPi, 6MPe, CMPi, 10.1MPi e
10.8MPi apresentaram atividade antibacteriana contra as três espécies de
Xanthomonas e os extratos 2MAi, 10.4MPe, 10.6MPe e EMPe foram ativos para
duas, das três espécies de Xanthomonas testadas.
43
Já os extratos 3MPi, 6MPi, 10MPi, 10.4MPi, 10.5MPi, CMPe e FMPe

apresentaram maior seletividade e inibiram o crescimento bacteriano apenas de X.
citri subsp. citri e o extrato 10MAe foi ativo apenas para a X. axonopodis pv.
passiflorae
Observando os resultados obtidos foi possível verificar que alguns fungos
isolados da Antártica produziram compostos ativos contra as 3 espécies de
Xanthomonas e que alguns apresentaram seletividade frente as três espécies de
Xanthomonas estudadas.
Este resultado é muito interessante, estudos apresentados na literatura que
englobam a avaliação da atividade antibacteriana contra mais de uma espécie de
Xanthomonas, apresenta resultados semelhantes para todas as espécies testadas,
como, por exemplo, o estudo realizado por Spago e colaboradores em 2014, no qual
eles mostraram que os metabólitos secundários produzidos pela bactéria
Pseudomonas aeruginosa tiveram ação antibacteriana contra as três Xanthomonas
estudadas: X. axonopodis pv. malvacearum, X. axonopodis pv. citri e X. axonopodis
pv. phaseoli.
Actinomicetos isolados de solo antártico também foram avaliados quanto a
atividade antimicrobiana em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Moncheva
et al (2002) avaliaram a atividade de extratos etanólicos do micélio e de filtrados do
meio de cultivo em diversas linhagens bacterianas, dentre as quais encontram-se
Xanthomonas axonopodis pv. glycines, Xanthomonas vesicatoria (PT),
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e Xanthomonas vesicatoria T. Das 47
linhagens isoladas, 3 apresentaram filtrados com atividade em Xanthomonas
axonopodis pv. glycines, Xanthomonas vesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli.
5.2.2. Atividade inibitória dos extratos bioativos
A inibição do crescimento celular dos extratos bioativos em porcentagem para
X. citri subsp. citri, X. axonopodis pv. passiflorae e X. euvesicatoria estão
apresentados na Tabela 3.
44
Tabela 4 - Atividade inibitória dos extratos produzidos por fungos filamentosos

em Xanthomonas spp.
Inibição (%)
Xanthomonas citri Xanthomonas Xanthomonas
Isolado Extrato
subsp. citri euvesicatoria axonopodis pv.
passiflorae
I 97,25 ± 0,73 - -
3MP
E 94,22 ± 0,35 92,66 ± 4,58 96,88 ± 1,33
5MP I 96,58 ± 0,71 98,04 ± 0,12 98,23 ± 0,38
I 93,29 ± 3,08 - -
6MP
E 96,15 ± 0,37 97,71 ± 0,13 98,14 ± 0,59
10MP I 94,32 ± 3,42 -
10.1MP I 94,45 ± 1,96 98,20 ± 0,12 97,96 ± 0,78
I 89,41 ± 4,52 - -
10.4MP
E 95,02 ± 0,50 - 97,43 ± 0,74
10.5MP I 90,37 ± 7,67 -
10.6MP E - 93,62 ± 1,30 98,35 ± 0,27
10.8MP I 95,96 ± 0,61 97,68 ± 0,23 97,82 ± 0,75
I 96,02 ± 0,78 98,07 ± 0,16 98,32 ± 0,47
CMP
E 95,62 ± 1,70 - -
EMP E 96,37 ± 1,01 96,03 ±1,40 -
FMP E 92,54 ± 1,66 - -
2MA I 95,89 ± 0,53 95,66 ± 0,71 -
10MA E - - 90,32 ± 0,10
CP 90,65 ± 0,81 97,63 ± 0,87 98,15 ± 0,21
E: extracelular. I: intracelular. Dados apresentados como valores médios de inibição (n=3) ± desvio
padrão para cada um dos fitopatógenos. Valores referentes a 2,1 mg de extrato/mL.
Na Tabela 4 é possível verificar que 15 extratos bioativos contra X. citri na

triagem apresentaram na concentração máxima testada (2,10 mg/mL) inibição do
crescimento bacteriano igual ou maior que 90%. Já o extrato 10.4MPi inibiu 92,6%
do crescimento na triagem porém, nestes bioensaio, apresentou valores médios de
89,41% com alto desvio padrão após novo bioensaio.
45
Na concentração de 1,05 mg/mL os extratos CMPi e 2MAi apresentaram uma

inibição de X. citri subsp. citri maior que 90%, sendo que o extrato CMPi também
apresentou inibição maior que 70% na concentração de 0,525 mg/mL. Gráficos
dose-resposta para os extratos foram construídos com base nas médias de inibição
e desvio padrão, como pode ser visto nas Figuras 28 e 29 (Apêndice A).
Alguns extratos foram ativos apenas na maior concentração enquanto que
outros apresentaram uma melhor dose-resposta, como o caso dos extratos 10.8MPi,
CMPi e 2MAi (Apêndice A).
Para a X. axonopodis pv. passiflorae (Tabela 4) todos os extratos, bioativos
na triagem, apresentaram na concentração de 2,10 mg/mL inibição do crescimento
bacteriano igual ou maior que 90%. Na concentração de 1,05 mg/mL os extratos
5MPi e 6MPe apresentaram inibição maior que 80%.
O Apêndice B apresenta os dados de inibição dos extratos em função das
concentrações testadas. Em comparação com os resultados obtidos em X. citri, a
maioria dos extratos testados em X. passiflorae apresentaram um melhor
decaimento na inibição com a diminuição da concentração de extrato. As melhores
dose-resposta foram obtidas com os extratos 6MPe, 10.1MPi e 10.4MPe (Apêndice
B - Figura 30).
A Tabela 4 também apresenta os resultados obtidos para o bioensaio frente a
X. euvesicatoria., é possível verificar que na concentração de 2,1 mg/mL todos os
extratos, positivos na triagem, apresentaram atividade inibitória maior ou igual a
90%. Já para a concentração de 1,05 mg/mL os extratos CMPi e 2MAi foram os
únicos que apresentaram inibição promissora contra a X. euvesicatoria. Os gráficos
de dose-resposta para a ação antibacteriana dos extratos em X. euvesicatoria estão
apresentados no Apêndice C. Os extratos CMPi, 2MAi e EMPe apresentaram a
melhor dose-resposta como pode ser visualizado na Figura 31.
Para Xanthomonas euvesicatoria, 5 dos extratos positivos tiveram origem
intracelular. Encheva-Malinova et al. (2015) avaliaram a atividade antibacteriana de
estreptomicetos isolados de solo antártico em 3 espécies de Xanthomonas, entre
elas, Xanthomonas euvesicatoria, a partir de extratos oriundos do meio de cultivo e
do micélio. Em condições in vitro e in vivo os extratos miceliais mostraram ser mais
ativos
A atividade inibitória extracelular está de acordo com estudos anteriores
conduzidos a partir de extratos orgânicos de isolados de fungos oriundos do
46
continente antártico. Furbino et al. (2014) em estudo sobre a atividade

biológica de extratos de fungos associados com macroalgas da região
Antártica apresentou além de outras espécies, isolados de
Pseudogymnoascus sp. com atividade contra Candida albicans, Candida
krusei e Cladosporium sphaerosperum.
Ding et al. (2016) relatou 18 isolados produtores de compostos ativos,
dos quais 10 exibiram citotóxica e 14 apresentaram atividade antimicrobiana.
De acordo com o estudo, todos os isolados de Pseudogymnoascus sp.
apresentaram baixa atividade antifúngica e 2 exibiram atividade antibacteriana
média. Gonçalves et al. (2015) avaliaram extratos etanólicos produzidos por
fungos de diversos substratos. Pseudogymnoascus sp. mostrou juntamente
com Penicillium sp. forte atividade antifúngica contra um patógeno humano.
É interessante notar que grande parte dos extratos com atividade em
Xanthomonas tem origem intracelular. Diversos estudos em atividade antimicrobiana
de fungos e bactérias abordam apenas extratos extracelulares, que permitem um
melhor acesso as moléculas de metabólitos secundários já que não é necessário
romper a parede celular para extraí-los. No entanto a atividade antimicrobiana dos
micro-organismos não está restrita aos compostos expelidos para o meio de cultura,
mas engloba também moléculas não secretadas de importância, como mostram os
extratos intracelulares ativos contra Xanthomonas spp.
Algumas suposições podem ser feitas em relação à atividade antibacteriana
apresentada pelos extratos intracelulares produzidos pelos isolados. É possível que
o(s) composto(s) antibacteriano produzido(s) pelos fungos não tenha(m) sido
secretado para o meio extracelular devido às condições de cultivo, as moléculas
podem ter sido liberadas ao meio extracelular em quantidade insuficiente para afetar
o crescimento celular bacteriano ou o solvente utilizado na extração, acetato de etila,
foi incapaz de extrair o(s) composto(s) que é fortemente polar e foi extraído com o
uso de metanol.
47
5.3. Concentração Inibitória Mínima CIM90 dos extratos bioativos

Com base nas equações obtidas da curva de regressão para cada extrato a
partir dos dados de inibição via REMA, foi possível determinar a CIM90 dos extratos
bioativos contra as três espécies de Xanthomonas, os valores estão apresentados
na Tabela 5.
Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima dos extratos para 90% de morte
celular.
X. euvesicatoria X. passiflorae X. citri subsp. citri
Extrato
CIM90 CIM90 CIM90
3MPi - - 2,005
3MPe 2,055 1,931 1,542
5MPi 2,027 1,018 2,056
6MPi - - 2,061
6MPe 2,073 1,090 2,059
10MPi - - 2,072
10.1MPi 2,029 1,940 2,069
10.4MPe - 1,942 2,066
10.4MPi - - 2,104
10.5MPi - - 2,098
10.6MPe 1,998 2,037 -
10.8MPi 2,042 1,835 1,138
CMPi 1,006 1,487 0,798
CMPe - - 2,062
FMPe - - 2,082
2MAi 1,023 - 1,026
EMPe 2,059 - 2,052
10MAe - 2,098 -
Valores em mg/mL de extrato bruto. CIM90: Concentração Inibitória Mínima para 90% de morte celular.
De acordo com os resultados exibidos na Tabela 5 o extrato CMPi foi o que

apresentou o menor valor de MIC90 no combate à X. citri subsp. citri. O extrato
CMPi também apresentou menor MIC90 para X. euvesicatoria. Para a X. axonopodis
pv. passiflorae os extratos 5MPi e 10.4MPe foram os que apresentaram os menores
valores de MIC90.
Observando estes resultados é possível verificar que o extrato CMPi é o que
apresenta maior potencial no combate a estas espécies de Xanthomonas, pois além
de apresentar os menores valores de MIC90 para as X. citri subsp. citri e X
48
euvesicatoria, também apresenta valores baixos de MIC90 para a X. axonopodis pv.

passiflorae.
É importante ressaltar que os extratos são constituídos de uma mistura de
compostos, assim a molécula ou as moléculas que é (são) ativa (s) contra as
Xanthomonas, provavelmente deve (m) inibir 90% do crescimento bacteriano em
uma concentração menor do que a dos respectivos extratos.
5.4. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos

Os extratos bioativos foram submetidos à avaliação da atividade bactericida,
sendo que para as amostras que apresentaram esta atividade foi determinada a
concentração bactericida mínima (CBM).
De acordo com a avaliação da atividade bactericida contra a X. citri. subsp.
citri., os extratos extracelulares tiveram atividade bactericida na concentração de 2,1
mg/mL (Figura 21). O mesmo ocorreu com os extratos intracelulares, as exceções
foram os extratos 6MPi e 10.4MPi que apresentaram caráter bacteriostático (Figura
22).
Figura 21 - CBM em triplicata de extratos extracelulares em presença de X. citri. subsp. citri.
Códigos de identificação em placa 1: 3MPe, 2: 6MPe, 3: 10.4MPe, 4: CMPe e 5: FMPe. Fonte:

Arquivo pessoal.
49
Figura 22 - CBM dos extratos intracelulares em X. citri subsp. citri.
Os códigos se referem à: 1:3MPi, 2:5MPi, 3:6MPi, 4:10MPi, 5:10.4MPi, 6:10.5MPi,

7:10.8MPi e 8:CMPi. Fonte: Arquivo pessoal.
As avaliações contra X. euvesicatoria e X. axonopodis pv. passiflorae (Figura

23) mostraram que os extratos 3MPe, 5MPi e 6MPe foram bacteriostáticos em todas
as concentrações. Os extratos 10.1MPi, 10.8MPi e 10.6MPe foram bactericidas na
concentração mínima testada de 2,1 mg/mL para as duas bactérias. O extrato CMPi
apresentou caráter bactericida contra a X. euvesicatoria na concentração mínima de
2,1 mg/mL, já contra a X. passiflorae o mesmo extrato apresentou uma MBC de 1,05
mg/mL. O extrato 10.4MPe e 10MAe apresentou, respectivamente, caráter
bacteriostático e bactericida (MBC = 2,1 mg/mL) contra X. axonopodis pv.
passiflorae.
Figura 23 - CBM de extratos bioativos contra X. euvesicatoria e X. axonopodis pv.

passiflorae
A B
(A) CBM em X. euvesicatoria com os extratos: 1:6MPe, 2:CMPi, 3:3MPe, 4:5MPi,

5:10.8MPi, 6:10.1MPi e 7:10.6MPe e (B) CBM em X. passiflorae com os extratos:
1:10.4MPe, 2:6MPe, 3:CMPi, 4:3MPe, 5:5MPi, 6:10.8MPi, 7:10.1MPi e
8:10.6MPe.Fonte: Arquivo pessoal.
50
Embora não estejam retratados nas figuras, o extrato 10.1MPi apresentou

características bactericidas em Xanthomonas citri subsp citri, o mesmo ocorreu com
os extratos 2MAi e EMPe em X. euvesicatoria e X. citri nas concentrações testadas.
O extrato 10MAe, que teve ação apenas contra X. axonopodis pv. passiflorae
também apresentou caráter bactericida no fitopatógeno.
É importante destacar as diferenças do comportamento dos extratos em
relação aos fitopatógenos (Tabela 6). Os extratos 10.8MPi, CMPi e 10.1MPi tem
ação bactericida nas três espécies de Xanthomonas testadas. Já os extratos 3MPe,
6MPe e 5MPi agem como bacteriostáticos em X. euvesicatoria e X. passiflorae à 2,1
mg/mL e de forma bactericida em X. citri na mesma concentração. Outra diferença
pôde ser observada quanto ao extrato 10.4MPe, que agiu como bactericida em X.
citri, como bacteriostático em X. passiflorae mas não teve efeito em X. euvesicatoria.
Tabela 6 - Concentração Bactericida Mínima dos extratos em cada um dos
fitopatógenos do gênero Xanthomonas
CBM (mg/mL) CBM (mg/mL) CBM (mg/mL)
Extrato
X. euvesicatoria X. ax. pv. passiflorae X. citri subsp. citri
3MPi - - 2,1
3MPe > 2,1 > 2,1 2,1
5MPi > 2,1 > 2,1 2,1
6MPi - - >2,1
6MPe > 2,1 > 2,1 2,1
10MPi - - 2,1
10.1MPi 2,1 2,1 2,1
10.4MPi - - >2,1
10.4MPe - > 2,1 2,1
10.5MPi - - 2,1
10.6MPe 2,1 2,1 -
10.8MPi 2,1 2,1 2,1
CMPi 2,1 1,0 2,1
CMPe - - 2,1
2MAi 2,1 - 2,1
EMPe 2,1 - 2,1
FMPe - - 2,1
10MAe - 2,1 -
51
Estudos anteriores denotam diferenças de sensibilidade das espécies de

Xanthomonas aos extratos produzidos por linhagens de micro-organismos isolados
da Antártica. De acordo com Encheva-Malinova et al. (2015) dentre 3 espécies de
Xanthomonas avaliadas frente à extratos produzidos por linhagens de
estreptomicetos, Xanthomonas euvesicatoria apresentou maior sensibilidade aos
antimicrobianos produzidos em relação à Xanthomonas vesicatoria e Xanthomonas
gardneri, que foi a menos afetada.
As diferenças observadas na atividade antibacteriana de extratos produzidos
pela mesma linhagem entre as Xanthomonas spp. pode ter ocorrido devido à
natureza das substâncias sintetizadas pelos isolados, que podem interagir ou atuar
de maneira diferente em cada fitopatógeno.
Assim como os resultados obtidos na avaliação de inibição do crescimento
bacteriano e na determinação da MIC destaca a ação do extrato CMPi, os resultados
da avaliação da atividade bactericida também confirmam o potencial desse extrato
no combate ao gênero Xanthomonas.
5.5. Identificação dos fungos filamentosos
De acordo com a identificação molecular todos os isolados, possíveis de
serem identificados e que produziram extratos ativos contra os fitopatógenos,
pertencem, provavelmente, ao gênero Pseudogymnoascus (Tabela 7). Os isolados
10.6MP, 2MA e EMP não foram sequenciados.
52
Tabela 7 - Isolados de solo antártico e seu gênero de acordo com

sequenciamento da região ITS.
Identificação Isolado
Pseudogymnoascus sp. 3MP
Pseudogymnoascus sp. 10.1MP
Pseudogymnoascus sp. CMP
Pseudogymnoascus sp. FMP
Estudos anteriores realizados com fungos antárticos mostraram que o gênero

Pseudogymnoascus é comum na região, estando presente em uma variedade de
substratos como solo continental e peninsular, musgos, folhas de Colobanthus
quitensis, thalli of macroalgas e lagos de água doce (GODINHO et al., 2015; DING et
al., 2016). Santiago et al. (2015) isolaram e identificaram 438 fungos associados a
liquens dos quais o taxa mais abundante foi Pseudogymnoascus sp. Também em
2015, estudos de diversidade conduzidos mostraram a presença desse gênero na
região antártica, muitas vezes sendo o gênero dominante. Godinho et al. (2015)
isolaram 115 fungos de solo oligotrófico no continente antártico dentre os quais
representantes do gênero Pseudogymnoascus estavam presentes. E em 2015
Gonçalves et al. (2015) identificaram isolados de 55 amostras da região marítima da
Antártica. Dos 100 isolados identificados, 14 foram classificados como
Pseudogymnoascus sp. 3 e 10 classificados como Pseudogymnoascus sp. 4.
Em 2014, Furbino et al. constataram a presença de Pseudogymnoascus spp.

em abundância e em associação com macroalgas endêmicas da Antártica e alguns
dos isolados identificados dentro desse gênero apresentaram atividade inibitória em
Candida albicans, Candida krusei e Cladosporium sphaerosperum.
Representantes do gênero Pseudogymnoascus associados com esponjas
antárticas também são relatados com atividade antimicrobiana em Pseudomonas
53
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clavibacter michiganensis e Xanthomonas

campestris por Henríquez e colaboradores (2014). Gonçalves et al. (2015)
conduziram pesquisa com foco na diversidade e potencial de produção de moléculas
bioativas de fungos da Antártica e mostraram resultados com Pseudogymnoascus.
5.6. Fracionamento dos extratos bioativos
5.6.1. Fracionamento do extrato 3MPe
Após o fracionamento por cromatografia em fase normal, 6 frações finais

foram obtidas: C1, composta pelas frações de f9 a f27; C2 formada por f28; C3, que
compreende as frações de f29 a f34; C4, frações de f40 a f48; C5, frações de f94 a
f107; e C6 que é composta por f5 e f6. Todas as frações tiveram sua massa
determinada após evaporação do solvente (Tabela 8).
Tabela 8 - Frações resultantes da cromatografia por exclusão molecular do

extrato 3MPe
3MPe – 90 mg
Fração Final Fração componente Massa (mg)
C1 f9 a f27 1,4
C2 f28 1,1
C3 F29 a f34 1,5
C4 f40 a f48 9,1
C5 f94 a f107 3,0
C6 f5, f6 1,1
Embora tenha apresentado um bom fracionamento dos componentes do

extrato, o total de massa das frações obtido foi baixo (17,2 mg) em relação a massa
de extrato inserida (90 mg).
Das frações obtidas a partir do extrato 3MPe, nenhuma inibiu o crescimento
bacteriano em uma porcentagem maior ou igual a 90%. É possível que as frações
sejam afetadas por sinergismo e por isso, são incapazes de inibir o crescimento
celular quando isoladas, ou que o composto bioativo não tenha sido recuperado
após a eluição na coluna cromatográfica.
5.6.2. Fracionamento do extrato 10.4MPi

De acordo com a CCD, os componentes do extrato produzido pelo fungo
10.4MP eram altamente polares, assim prosseguiu-se inicialmente com
fracionamento por exclusão molecular.
54
5.6.2.1. Cromatografia por exclusão molecular

Após fracionamento em coluna, frações similares entre si foram agrupadas
(Tabela 9) resultando nas frações: F2, formada por F2 e F3; F7, formada por F7 e
F8; e F4, formada pelas frações F4, F5 e F6. Com base na CCD em metanol, F2 e
F7 foram consideradas puras e tiveram sua massa determinada após secagem. A
fração final F4 ainda não purificada foi reinjetada em condições similares e deu
origem à quatro novas frações denominadas f3, f4, f16 e f18. Após aplicação em
CCD, f3 foi agrupada com F2, f4 foi similar à F7 enquanto que f16 e f18 foram
agrupadas na nova fração final F16 e teve sua massa determinada após secagem.
Tabela 9 - Frações resultantes de cromatografia por exclusão molecular –
Extrato 10.4MPi
10.4MPi – 90 mg
Fração Final Fração componente Massa (mg)
F2 F2, F3, f3 12
F7 F7, F8, f4 4,2
F16 f16, f18 9,5
Considerando a quantidade de extrato inserida na coluna (90 mg) e a massa
total das frações obtida (25,7 mg), uma boa parte de compostos parecem terem sido
retidos na resina empregada.
O segundo fracionamento desse extrato, conduzido em coluna de 25 mL a
partir de 261,5 mg do extrato deu origem a 185 frações que foram agrupadas em 22
frações compostas que foram novamente avaliadas quanto a sua similaridade em
CCD e por fim agrupadas em cinco frações finais e pesadas (B1, B2, B3, B4 e B5)
Entre as frações finais, três foram consideradas purificadas (B1, B4 e B5) e duas são
compostas (B2 e B3).
Das frações geradas na cromatografia de exclusão molecular, tanto na
primeira tentativa quanto na segunda, nenhuma fração apresentou inibição do
crescimento bacteriano maior ou igual a 90%. Entretanto, como o rendimento da
purificação ficou abaixo de 50%, é possível que o composto bioativo não tenha sido
recuperado após o fracionamento na coluna, assim como para este extrato havia
uma quantidade em massa significativa, este foi submetido a outro tipo
fracionamento utilizando cromatografia de fase normal.
55

Cromatografia em fase normal foi empregada de forma a se obter um melhor
desempenho na purificação do extrato 10.4MPi e seus componentes. Os 157 mg de
extrato resultaram em um total de 543 frações de 500 µL foram coletadas em
microtubos e aplicadas em placas de CCD em acetato de etila:hexano (8:2) para
agrupamento em 19 frações de acordo com similaridade.
O método resultou em 5 frações purificadas (CN7, CN14, CN16, CN17 e
CN19), 12 frações compostas (CN1, CN2, CN3, CN4, CN5, CN6, CN8, CN9, CN10,
CN11, CN12 e CN13) e duas sem compostos revelados (CN15 e CN18). As frações
foram agrupadas novamente em frações finais conforme similaridade (Tabela 10).
Tabela 10 - Frações resultantes de cromatografia em sílica com grupos CN –
Extrato 10.4MPi
10.4MPi – 157,4 mg
Frações agrupadas Fração Fração Final Massa (mg)
componente
CN1 f7 a f11
CN3 f17 a f22 CN1 11,2
CN5 f27 a f30
CN2 f12 a f16
CN4 f23 a f26 CN6 16,7
CN6 f31 a f74
CN7 f75 a f98 CN7 0,9
CN8 f99 a f140
CN9 f141 a f176
CN10 f177 a f224 CN8 26,1
CN11 f225 a f284
CN12 f285 a f335
CN13 f336 a f 368 CN13 15,8
CN14 f369 a f387
CN16 f403 a f421 CN14 1,9
CN17 f422 a f464
CN15 f388 a f402 - -
CN18 f465 a f482 - -
CN19 f483 a f543 CN19 1,1
- Nenhum composto visualizado em UV ou p-anisaldeído/orcinol/ninidrina
254
56
Em massa, dos 157 mg injetados na coluna, foram recuperados 73,7 mg em

frações. A partir dessa purificação, outras duas soluções foram utilizadas como
reveladores químicos de placas de CCD, a ninidrina e o orcinol. O procedimento em
coluna SPE Strata® CN Phenomenex repetido com 196 mg do extrato, resultou em
frações similares às previamente obtidas por esse método.
As frações foram submetidas ao bioensaio de atividade antibacteriana contra
X. citri subsp. citri.
5.6.2.3. Cromatografia em fase reversa
Dos 108 mg do extrato 10.4MPi injetados em coluna foram coletadas 204
frações de 500 µL, as quais foram agrupadas em 9 frações finais. Dessas 9 frações,
3 frações Oc1, Oc2 e Oc3 foram agrupadas após nova CCD por apresentarem perfis
similares à fração CN14. Um total de 43,3 mg em massa foi recuperado nessa
purificação.
O mesmo procedimento foi realizado para maiores quantidades do extrato
bruto de 10.4MPi (156,7 mg e 199,8 mg). Em cada uma das purificações foram
obtidos 9 frações finais das quais 4 tiveram perfis similares à fração CN14. Nestes
fracionamentos foram obtidos 136,0 mg e 170,8 mg em massa nas frações.
As frações similares por CCD entre as frações obtidas durante os 3
fracionamentos foram agrupadas resultando em duas frações, P1 (200 mg) e P2
(137 mg), e inseridas em aparelho para cromatográfica líquida de alta eficiência
(CLAE).
5.6.2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A amostra P1 foi injetada em duas corridas cada uma utilizando 1mL da
amostra. A corrida teve duração de 18 minutos e as frações foram coletadas por
minuto quando não houve detecção em UV250 ou UV350, e no caso de detecção, de
acordo com os picos formados no cromatograma (Figura 24 e 25 para as amostras
P1 e P2 respectivamente).
57
Figura 24 - Cromatograma da amostra P1 do extrato 10.4MPi e coleta das frações.
Leituras em tempo real em coluna preparativa HILIC com detector UV nos comprimentos
de onda de 250 nm e 350 nm. Fonte: Arquivo pessoal.
58
Figura 25 - Cromatograma da amostra P2 do extrato 10.4MPi.
Leituras em tempo real em coluna preparativa HILIC com detector UV nos

comprimentos de onda de 250 nm e 350 nm. Fonte: Arquivo pessoal.
Como pode ser visualizado na Figura 25, o perfil do cromatograma da

amostra P2 foi similar ao cromatograma da amostra P1 (Figura 24). As frações
coletadas em cada corrida cromatográfica estão representadas na Tabela 11.
59
Tabela 11 - Frações da purificação das amostras do extrato 10.4MPi por CLAE.

Extrato 10.4MPi fracionado
P1 – 1mL P1 – 1mL P2 – 1 mL
Frações Massa (mg) Frações Massa (mg) Frações Massa (mg)
C2F0 1,0 C3F0 1,2 C1F0 1,1
C2F1 1,9 C3F1 1,1 C1F1 2,9
C2F2 31,7 C3F2 8,0 C1F2 41,6
C2F5 26,0 C3F3 27,7 C1F3 33,6
C2F6 12,4 C3F4 29,5 C1F4 19,7
C2F8 1,7 C3F5 6,3 C1F5 2,8
C2F9 0,9 C3F6 2,0 C1F6 2,3
C2F10 1,9 C3F7 2,2 C1F7 3,6
C2F11 2,2 C3F8 2,4 C1F8 1,7
C2F12 1,4 C3F9 1,5
C2F13 1,2 C3F10 1,8
Considerando que as frações coletadas nas três corridas cromatográficas são

semelhantes, apenas as amostras de uma das corridas foram avaliadas quanto ao
potencial inibitório contra X. citri subsp. citri.
5.7. Atividade antimicrobiana e pureza das frações

As amostras obtidas do fracionamento do extrato produzido pelo isolado
10.4MP foram submetidas ao bioensaio de atividade antibacteriana contra X. citri
subsp. citri. As frações CN13 e CN14, resultantes da extração em fase móvel
utilizando sílica derivatizada, apresentaram inibição do crescimento bacteriano
superior a 90% na concentração de 2,1 mg/mL, além disso, pela análise de CCD a
fração CN14 foi considerada pura e altamente polar.
A fração CN14 foi enviada para a análise de CLAE-EM (Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas) e a partir de seu
cromatograma (Figura 26) foi possível verificar que a amostra ainda não estava
pura.
60
Figura 26 - Cromatograma da fração CN-14 obtido no aparelho de CLAE-EM.

Amostra - CN-14
27092017_CN-14-LC-DAD-MS-01 Sm (Mn, 3x1); Sb (20,30.00 ) 1: MS2 ES+
25.62 TIC
100
1.02e10
%
8.33
8.55 11.47 16.73
14.57 27.94
22.50
2.12 18.38 19.85 24.34
5.20
0 Time
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
Diante dos resultados, optou-se por utilizar um HPLC-preparativo para realizar

a purificação da fração, entretanto a quantidade obtida da fração CN14 era cerca de
2 mg, pouca quantidade para realizar este tipo de cromatografia.
Assim antes de utilizar o HPLC-preparativo, foi produzido maior quantidade do
extrato 10.4MPi e este purificado em cromatografia de fase reversa C8 conforme
descrito no item 5.6.2.3., devido a fração CN14 ser altamente polar, a coluna de fase
reversa diminuiria a retenção desta fração polar.
Das frações obtidas após CLAE (Tabela 10) a fração C2F5 apresentou
inibição do crescimento bacteriano maior que 90% na concentração de 2,0 mg/mL, a
fração C2F2 apresentou inibição de 89% na mesma concentração. A Figura 27
apresenta o gráfico de dose-resposta das duas frações (C2F5 e C2F2) obtidas na
CLAE que inibiram o crescimento de X. citri subsp. citri
Figura 27 – Inibição do crescimento de X. citri subsp. citri por frações da CLAE.
61
As duas frações que inibiram a maior porcentagem de células, também

apresentaram um decaimento proporcional de inibição de acordo com a quantidade
de composto presente. Na concentração de 1 mg/mL as frações C2F5 e C2F2
apresentaram atividade capaz de inibir 50,53% e 54,76% o crescimento bacteriano,
respectivamente. Nas concentrações seguintes o decaimento da inibição foi mais
sutil, com valores entre 48% e 47% a 500 µL/mL, 42% e 44% a 250 µL/mL, 32% e
34% a 125 µL/mL e entre 1 e 11% na concentração mais baixa testada.
As duas frações, C2F2 e C2F5 (Figura 22) foram coletadas em sequência,
podendo ser compostas pelos mesmas moléculas ou apresentarem compostos
semelhantes. Ambas as frações foram enviadas para análise de massa e para
análise de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C.
6. CONCLUSÃO
Como esperado, os micro-organismos adaptados à extremas condições como
os encontrados em solos da região da Antártica tem grande potencial biotecnológico
e são fonte de moléculas com propriedades antimicrobianas. Particularmente, os
representantes do gênero Pseudogymnoascus tem potencial como produtores de
compostos antibacterianos ativos em fitopatógenos como as bactérias do gênero
Xanthomonas, especialmente as bactérias causadoras do cancro cítrico, mancha-
bacteriana e bacteriose.
Os 14 isolados selecionados durante esse estudo, embora pertencentes ao
mesmo gênero comportamento diferentes de bioatividade, o que demonstra a
diversidade metabólica das linhagens testadas e reforça a necessidade de estudo
dos micro-organismos que compõem o gênero bem como seus metabólitos. A
aplicação de diferentes condições para o crescimento e produção de metabólitos
pelos fungos como temperatura, meio de cultivo e período de produção dos
metabólitos e o uso de solventes extratores com diferentes características são
variáveis que precisam ser consideradas de forma a otimizar a produção dos
metabólitos secundários ativos. A alteração dessas condições reflete na produção
de diferentes compostos do inicialmente observado, podendo levar a ausência ou
diminuição da quantidade de uma molécula bioativa ou ao aumento da produção de
um determinado composto ou a detecção de moléculas inéditas ou previamente não
observadas em um dado isolado.
62
Os extratos biotivos devem ser estudados para determinação dos compostos

antibacterianos presentes em cada um, e para a elucidação do mecanismo de ação
em cada um dos fitopatógenos, que pode esclarecer a diferença na ação de
compostos ativos nas 3 espécies de Xanthomonas avaliadas em relação aos
extratos com atividade biológica em apenas duas ou uma das espécies.
O fracionamento dos extratos produzidos evidencia a quantidade de
moléculas sintetizadas pelos fungos filamentosos, especialmente no meio
intracelular, o que dificulta a purificação de moléculas antimicrobianas e torna o
fracionamento de extratos extracelulares mais atrativo, devido a facilidade, eficiência
e tempo do processo. Em adição a isso, outros estudos podem ser conduzidos a
partir desses micro-organismos como por exemplo a produção de enzimas, a
atividade em fitopatógenos que atacam outras culturas ou que pertencem a um
gênero diferente, estudos voltados para a ação antitumoral dos isolados e produção
de pigmentos.
63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMARAL, A. M. do. Cancro cítrico: permanente preocupação da citricultura no Brasil e no

mundo. Brasília: EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2003. 5p. (EMBRAPA
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Comunicado Técnico, 86).
BEHLAU, F.; SALA, I.; BASSANEZI, R. B. Cancro cítrico: Medidas essenciais de controle.
Fundo de Defesa da Citricultura. Araraquara, São Paulo: Fundecitrus, 2017. 24p.
BEHLAU, F.; BASSANEZI, R. B.; LOPES, S. A.; BARBOSA, J. C. Levantamento de doenças

dos citros: HLB, CVC e Cancro cítrico. Fundo de Defesa da Citricultura. Araraquara, São
Paulo: Fundecitrus, 2017. 56 p.
BITANCOURT, A. A. Cancro cítrico. Biológico, São Paulo, v. 23, n. 6, p. 101-111, 1957.
BRASIL. Instrução Normativa n. 37 de 5 de setembro de 2016. Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento. Brasília, 6 de set. 2016. Seção 1, p. 1-17.
BRATCHKOVA, A.; IVANOVA, V. Bioactive Metabolites Produced by Microorganisms

Collected in Antarctica and the Arctic. Biotechnology & Biotechnological Equipment, v.
25, sup.1, p. 1-7, 2011. Disponível em:
<https://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.5504/BBEQ.2011.0116 >. Acesso em: 25 dez.
2017.
CABI, 2017. Xanthomonas citri subsp. citri. In: Invasive Species Compendium. Wallingford,
UK: CAB International. www.cabi.org/isc. Disponível em <www.cabi.org/isc>. Acesso em: 26
de dez. 2017.
CALVO, A. M.; WILSON, R. A.; BOK, J. W.; KELLER, N. P. Relationship between

Secondary Metabolism and Fungal Development. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, v. 66, n. 3, p. 447–459, 2002. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/11179959_Relationship_between_Secondary_Me
tabolism_and_Fungal_Development>. Acesso em: 25 dez. 2017.
CASTELLANI, A. The viability of some pathogenic fungi in sterile distilled water. Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, v. 42, p. 225–226, 1939.
CAVICCHIOLI, R.; SIDDIQUI, K. S.; ANDREWS, D.; SOWERS, K. R. Low temperature

extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, v. 13, n. 3, p. 253-
261, 2002. Disponível em:
<https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166902003178>. Acesso em: 25
dez. 2017.
CHEUNG, R. C. F.; WONG, J. H.; PAN, W. L.; CHAN, Y. S.; YIN, C. M.; DAN, X. L.; WANG,
H. X.; FANG, E. F.; LAM, S. K.; NGAI, P. H. K.; XIA, L. X.; LIU, F.; YE, X. Y.; ZHANG, G. Q.;
LIU, Q. H.; SHA, O.; LIN, P.; KI, C.; BEKHIT, A. A.; BEKHIT, A. E. D.; WAN, D. C. C.; YE, X.
J.; XIA, J.; NG, T. B. Antifungal and antiviral products of marine organisms. Applied
Microbiology and Biotechnology, v. 98, n. 8, p. 3475–3494, 2014. Disponível em:
<https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-014-5575-0>. Acesso em: 25 dez.
2017.
CLARKE, A. Evolution, adaptation and diversity: global ecology in an Antartic contexto. In:
HUIKES AHL, GIESKES WWC, ROZEMA J, SCHORNO RML, VAN DER VIES SM, WOLFF
64
WJ. (Ed.) Antarctic biology in a global contexto. Leiden: Backhuys Publishers, p. 3-17,
2003.
COKER, J. A. Extremophiles and biotechnology: current uses and prospects.

F1000Research, v. 5, p. 396, 2016. Disponível em: <http://f1000research.com/articles/5-
396/v1>. Acesso em: 25 dez. 2017.
DAYAN, F. E.; CANTRELL, C. L.; DUKE, S. O. Natural products in crop protection.

Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 17, n.12, p. 4022-4034, 2009. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968089609000923>. Acesso em 25. Dez
2017.
DE OLIVEIRA, A. G.; MURATE, L. S.; SPAGO, F. R.; LOPES, L. P.;, BERANGER, J. P. O.;
SAN MARTIN, J. A. B.; NOGUEIRA, M. A.; MELLO, J. C. P.; ANDRADE, C. G. T. J.;
ANDRADE, G. Evaluation of the antibiotic activity of extracellular compounds produced by
the Pseudomonas strain against the Xanthomonas citri pv. citri 306 strain. Biological
Control, v. 56, n. 2, p. 125–131, 2011. Disponível em:
<https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1049964410002252?via%3Dihub>.
Acesso em: 25 dez. 2017.
DING, Z.; LI, L.; CHE, Q.; LI, D.; GU, Q.; ZHU, T. Richness and bioactivity of culturable soil
fungi from the Fildes Peninsula, Antarctica. Extremophiles, v. 20, n. 4, p. 425–435, 2016.
Disponível em: < https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00792-016-0833-y>. Acesso
em: 25 dez. 2017.
ENCHEVA-MALINOVA, M.; STOYANOVA, M.; AVRAMOVA, H.; PAVLOVA, Y.; GOCHEVA,

B.; IVANOVA, I.; MONCHEVA, P. Antibacterial potential of streptomycete strains from
Antarctic soils. Biotechnology & Biotechnological Equipments, v. 28, n. 4, p. 721-727,
2014. Disponível em:
<https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/13102818.2014.947066>. Acesso em: 23
dez. 2017.
ENCHEVA-MALINOVA, M.; VANCHEVA, T.; BADZHINEROV, N.; KOLEVA, V.; TISHKOV, S.;
BOGATZEVSKA, N.; MONCHEVA, P. Antimicrobial activity of Antarctic streptomycetes
against pepper bacterial spot causing agents. First National Conference of Biotechnology
- Sofia. v. 100, p. 216-222, 2015. Disponível em:
<https://www.uni-
sofia.bg/index.php/bul/content/download/140622/1029457/version/2/file/29_MARTA_ENCHE
VA-MALINOVA.pdf>. Acesso em: 25 dez. 2017.
EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organisation), online (2017) EPPO
Plant Quarantine Data Retrieval System. Disponível em:
<http://www.eppo.int/DATABASES/pqr/pqr.htm.> Acesso em 25 set. 2017.
FEICHTENBERGER, E.; BASSANEZI, R.B.; SPÓSITO, M.B.; BELASQUE- JÚNIOR, J.

Doenças dos citros (Citrus spp.). In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.;
BERGAMIN-FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A. (Ed.) Manual de fitopatologia: doenças das
plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 2005. v.2, p.239-269.
FISCHER, I. H.; KIMATI, H.; REZENDE, J.A.M. Doenças do maracujazeiro. In: KIMATI, H.;
AMORIM, L.; REZENDE; J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A. (Eds.)
Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Ceres, 2005.
v. 2, p. 467-474
65
FURBINO, L. E.; GODINHO, V. M.; SANTIAGO, I. F.; PELLIZARI, F. M.; ALVES, T. M. A.;
ZANI, C. L.; JUNIOR, P. A. S.; ROMANHA, A. J.; CARVALHO, A. G. O.; GIL, L. H. V. G.;
ROSA, C. A.; MINNIS, A. M.; ROSA, L. H. Diversity Patterns, Ecology and Biological
Activities of Fungal Communities Associated with the Endemic Macroalgae Across the
Antarctic Peninsula. Microbial Ecology, v. 67, n. 4, p. 775-787, 2014. Disponível em: <
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00248-014-0374-9>. Acesso em 25 dez. 2017.
GODINHO, V. M.; GONÇALVES, V. N.; SANTIAGO, I. F.; FIGUEREDO, H. M.; VITORELI,

G. A.; SCHAEFER, C. E. G. R.; BARBOSA, E. C.; OLIVEIRA, J. G.; ALVES, T. M. A.; ZANI,
C. L.; JUNIOR, P. A. S.; MURTA, S. M. F.; ROMANHA, A. J.; KROON, E. G.; CANTRELL, C.
L.; WEDGE, D. E.; DUKE, S. O.; ALI, A.; ROSA, C. A.; ROSA, L. H. Diversity and
bioprospection of fungal community present in oligotrophic soil of continental Antarctica.
Extremophiles, v. 19, n. 3, p. 585–596, 2015. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1007/s00792-015-0741-6>. Acesso em: 26 dez. 2017.
GONÇALVES, V. N.; CARVALHO, C. R.; JOHANN, S.; MENDES, G.; ALVES, T. M. A.;
ZANI, C. L.; JUNIOR, P. A. S.; MURTA, S. M. F.; ROMANHA, A. J.; CANTRELL, C. L.;
ROSA, C. A.; ROSA, L. H. Antibacterial, antifungal and antiprotozoal activities of fungal
communities present in different substrates from Antarctica. Polar Biology, v. 38, n. 8, p.
1143-1152, 2015. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/276859411_Antibacterial_antifungal_and_antiprot
ozoal_activities_of_fungal_communities_present_in_different_substrates_from_Antarctica>.
Acesso em: 23 dez. 2017.
HAYWARD, A. C. The hosts of Xanthomonas. In: SWINGS, J.G. e CIVEROLO, E.L. (Ed.).
Xanthomonas. Dordrecht: Springer, 1993. p. 1–119.
HENRÍQUEZ, M.; VERGARA, K.; NORAMBUENA, J.; BEIZA, A.; MAZA, F.; UBILLA, P.;
ARAYA, I.; CHÁVEZ, R.; SAN-MARTÍN, A.; DARIAS, J.; DARIAS, M. J.; VACA, I. Diversity of
cultivable fungi associated with Antarctic marine sponges and screening for their
antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 30, n. 1, p. 65–76, 2014. Disponível em:
<https://link.springer.com/article/10.1007/s11274-013-1418-x>. Acesso em: 20 dez. 2017.
HERBERT, R. A. A perspective on the biotechnological potential of extremophiles.Trends in

Biotechnology, v. 10, p. 395-402, 1992. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/0167-
7799(92)90282-Z>. Acesso em: 22 dez. 2017.
ISHIDA, A. K.; HALFELD-VIEIRA, B. de A. Mancha-Bacteriana do Maracujazeiro

(Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae): Etiologia e Estratégias de Controle. Belém:
EMBRAPA Amazônia Oriental, 2009. 23p. (EMBRAPA Amazônia Oriental, Documentos
357).
IVANOVA, V.; ORIOL, M.; MONTES, M-J.; GARCÍA, A.; GUINEA, J. Secondary Metabolites
from a Streptomyces strain isolated from Livingston Island, Antarctica. Zeitschrift fur
Naturforschung - Section C, Journal of Biosciences. v. 56, n. 1-2, p. 1-5, 2001.
Disponível em: < https://doi.org/10.1515/znc-2001-1-201>. Acesso em: 15 mar. 2018.
IVANOVA, V.; YOCHEVA, L.; SCHLEGEL, R.; GRAEFE, U.; KOLAROVA, M.; ALEKSIEVA,
K.; NAIDENOVA, M. Antibiotic complex from Streptomyces flavovirens 67, isolated from
Livingston Island, Antarctica. Bulgarian Antarctic Research Life Sciences. v.3, p. 35-42,
2002.
IVANOVA, V.; KOLAROVA, M.; ALEKSIEVA, K.; GRÄFE, U.; DAHSE, H-M.; LAATSCH, H.
Microbiaeratin, a new natural indole alkaloid from a Microbispora aerata strain, isolated from
66
Livingston Island, Antarctica. Preparative Biochemistry and Biotechnology. v. 37, n. 2, p.

161-168, 2007. Disponível em:
<https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10826060701199122>. Acesso em: 18 mar.
2018.
JEONG, S.-Y.; ISHIDA, K.; ITO, Y.; OKADA, S.; MURAKAMI, M. Bacillamide, a novel
algicide from the marine bacterium, Bacillus sp. SY-1, against the harmful
dinoflagellate, Cochlodinium polykrikoides. Tetrahedron Letters. v. 44, n. 43, p. 8005-8007,
2003. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2003.08.115>. Acesso em : 15 mar.
2018.
JUNQUEIRA, N. T. V.; JUNQUEIRA, K. P. Manejo das principais doenças do maracujazeiro.

In: SUSSEL, A. A. B.; MEDEIROS, F. H. V.; RIBEIRO JÚNIOR, P. M.; UCHOA, C. N.;
AMARAL, D. R.; MEDEIROS, F. C. L.; PEREIRA, R. B.; SANTOS, J.; LIMA, L. M.;
ROSWALKA, L. C. Manejo integrado de doenças de fruteiras. Lavras: Ufla, 2007. 1 CD-
ROM.
KATOH, K.; STANDLEY, D.M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7:
improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution, v. 30, n. 4,
p. 772–780, 2013. Disponível em: <https://doi.org/10.1093/molbev/mst010>. Acesso em: 21
set. 2017.
KELLER, N. P.; TURNER, G.; BENNETT, J. W. Fungal secondary metabolism - From

biochemistry to genomics. Nature Reviews Microbiology, v. 3, n. 12, p. 937–947, 2005.
Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/7445837_Fungal_secondary_metabolism_-
_From_biochemistry_to_genomics>. Acesso em: 26 dez. 2017.
KIMURA, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through
comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, v. 16, n. 2,
p. 111–120, 1980. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/15734590_A_Simple_Method_for_Estimating_Ev
olutionary_Rate_of_Base_Substitutions_Through_Comparative_Studies_of_Nucleotide_Seq
uences>. Acesso em: 21 set. 2017.
KUROZAWA, C.; PAVAN, M. A. Doenças do Tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill). In:

KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN-FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A.
(Ed.) Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo:
Agronômica Ceres, 2005. v.2, p. 607-626.
LEYNS, F.; DE CLEENE, M.; SWINGS, J. G.; DE LEY, J. The host range of the genus
Xanthomonas. The Botanical Review, v. 50, n. 3, p. 308–356, 1984. Disponível em:
<https://link.springer.com/article/10.1007/BF02862635>. Acesso em: 22 dez. 2017.
LI, Y.; SUN, B.; LIU, S.; JIANG, L.; LIU, X.; ZHANG, H.; CHE, Y. Bioactive asterric acid
derivatives from the antarctic ascomycete fungus Geomyces sp. Journal of Natural
Products, v. 71, n. 9, p. 1643–1646, 2008. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/23187931_Bioactive_Asterric_Acid_Derivatives_fr
om_the_Antarctic_Ascomycete_Fungus_Geomyces_sp>. Acesso em: 22 dez. 2017.
LIM, C.; KIM, J.; CHOI, J. N.; PONNUSAMY, K.; JEON, Y.; KIM, S. U.; KIM, J. G.; LEE, C.
Identification, fermentation, and bioactivity against Xanthomonas oryzae of antimicrobial
metabolites isolated from Phomopsis longicolla S1B4. Journal of Microbiology and
67
Biotechnology, v. 20, n. 3, p. 494-500, 2010. Disponível em:

<https://www.researchgate.net/publication/43050306_Identification_Fermentation_and_Bioac
tivity_Against_Xanthomonas_oryzae_of_Antimicrobial_Metabolites_Isolated_from_Phomopsi
s_longicolla_S1B4>. Acesso em: 26 dez. 2017.
LIMA, A. de A.; NORONHA, A. C. da S.; BORGES, A. L.; CARDOSO, C. E. L.; RITZINGER,

C. H. S. P.; BARBOSA, C. de J.; BARBOSA, C. de J.; SANTOS FILHO, H. P.; FANCELLI,
M.; CUNHA, M. A. P. da; SANCHES, N. F. A cultura do maracujá. EMBRAPA Mandioca e
Fruticultura Tropical. 3. ed. ver. amp. Brasília: EMBRAPA Informação Tecnológica, 2006.
124p. (EMBRAPA Informação Tecnológica, Coleção Plantar, 51).
LOPES, C. A.; QUEZADO-SOARES, A. M. Doenças causadas por bactérias em tomate. In:

ZAMBOLIM, L.; VALE, F. X. R.; COSTA, H. (Ed). Controle de doenças de plantas:
hortaliças. Viçosa: UFV. p. 754-784, 2000.
LOPES, C.A.; QUEZADO-DUVAL, A.M. Mancha bacteriana: uma atualização para o Sistema
de Produção Integrada de Tomate Indústria. Brasília: EMBRAPA Hortaliças, 2010. 24p.
(EMBRAPA Hortaliças, Circular Técnica, 84).
MALAVOLTA JUNIOR, V. A. Doenças bacterianas em tomateiro: etiologia e controle. In:

Seminário de atualização: Cadeia produtiva do tomate, 2004.
MÖLLER, E. M.; BAHNWEG, G.; SANDERMANN, H.; GEIGER, H. H. A simple and efficient
protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and
infected plant tissues. Nucleic Acids Research, v. 20, n. 22, p. 6115-6116, 1992. Disponível
em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC334490/pdf/nar00233-0230.pdf>.
Acesso em: 21 set. 2017.
MONCHEVA, P.; TISHKOV, S.; DIMITROVA, N.; CHIPEVA, V.; NIKOLOVA, A. S.;
BOGATZEVSKA, N. Characteristics of soil actinomycetes from
Antarctica. Journal of Culture Collections, v. 3, p. 3-14, 2002. Disponível em:
<https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/1178/1/cc02001.pdf>. Acesso em 22 dez.
2017.
MUNHOZ, C. F.; SANTOS, A. A.; ARENHART, R. A.; SANTINI, L.; MONTEIRO-

VITORELLO, C. B.; VIEIRA, M. L.C. Analysis of plant gene expression during passion fruit–
Xanthomonas axonopodis interaction implicates lipoxygenase 2 in host defence. Annals of
Applied Biology, v. 167, n. 1, p. 135–155, 2015. Disponível em:
<https://doi.org/10.1111/aab.12215>. Acesso em: 26 dez. 2017.
MURATE, L. S.; DE OLIVEIRA, A. G.; HIGASHI, A. Y.; BARAZETTI, A. R.; SIMIONATO, A.

S.; DA SILVA, C. S.; SIMÕES, G. C.; DOS SANTOS, I. M. O.; FERREIRA, M. R.; CELY, M.
V. T.; NAVARRO, M. O. P.; DE FREITAS, V. F.; NOGUEIRA, M. A.; DE MELLO, J. C. P.;
LEITE JR, R. P.; ANDRADE, G. Activity of Secondary Bacterial Metabolites in the Control of
Citrus Canker. Agricultural Sciences, v. 6, n. 3, p. 295-303, 2015. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.4236/as.2015.63030>. Acesso em: 26 dez. 2017.
NEDIALKOVA, D.; NAIDENOVA, M. Screening the antimicrobial activity of actinomycetes

strains isolated from Antarctica. Journal of Culture Collections, v. 4, p. 29-35, 2005.
Disponível em: <http://nbimcc.org/JCC/2005/JCC0543/JCC0543.pdf>. Acesso em 22 dez.
2017.
NIGAM, P.; SINGH, A. Metabolic Pathways: Production of Secondary Metabolites – Fungi.

In: BATT, C. A.; TORTORELLO, M. L. (Ed.). Encylopedia of Food Microbiology. Elsevier
Ltd, Academic Press, 2014. v. 2, p. 570–578.
68
OLIVEIRA, R.P. de; UENO, B.; SCIVITTARO, W.B.; KOLLER, O. C.; ROCHA, P.S. da.
Cancro cítrico: epidemiologia e controle. Pelotas: EMBRAPA Clima Temperado, 2008. 42p.
(EMBRAPA Clima Temperado, Documentos 234).
PALAZZO, G.; CARBONE, L.; COLAFEMMINA, G.; ANGELICO, R.; CEGLIE, A.; GIUSTINI,
M. The role of the cosurfactant in the CTAB/water/n-pentanol/n-hexane system: Pentanol effect
on the phase equilibria and mesophase structure. Physical Chemistry Chemical Physics, v. 6,
n. 7, p. 1423-1429. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/224776312_The_role_of_the_cosurfactant_in_the_CT
ABwatern-pentanoln-
hexane_system_Pentanol_effect_on_the_phase_equilibria_and_mesophase_structure>. Acesso
em : 21 set. 2017.
PEIXOTO NETO, P. A. S.; AZEVEDO, J. L.; ARAÚJO, W. L. Microrganismos endofíticos.

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília, n. 29, p. 62-77, 2002. Disponível em:
<http://www.biotecnologia.com.br/>. Acesso em: 20 ago. 2016.
PIKUTA, E. V.; HOOVER, R. B.; TANG, J. Microbial Extremophiles at the Limits of Life.
Critical Reviews in Microbiology, v. 33, n. 3, p. 183-209, 2007. Disponível em:
<https://doi.org/10.1080/10408410701451948>. Acesso em: 19 nov. 2017.
RODRIGUEZ-R, L. M.; GRAJALES, A.; ARRIETA-ORTIZ, M. L.; SALAZAR, C.; RESTREPO,

S.; BERNAL, A. Genomes-based phylogeny of the genus Xanthomonas. BMC
Microbiology, v. 12, n. 43, p. 1-14, 2012. Disponível em: <https://doi.org/10.1186/1471-
2180-12-43>. Acesso em: 26 dez. 2017.
ROJAS, J. L.; MARTÍN, J.; TORMO, J. R.; VICENTE, F.; BRUNATI, M.; CICILIATO, I.; LOSI,
D.; VAN TRAPPEN, S.; MERGAERT, J.; SWINGS, J.; MARINELLI, F.; GENILLOUD, O.
Bacterial diversity from benthic mats of Antarctic lakes as a source of new bioactive
metabolites. Marine Genomics, v. 2, n. 1, p. 33–41, 2009. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.margen.2009.03.005>. Acesso em: 22 dez. 2017.
RYAN, R. P.; VORHÖLTER, F. J.; POTNIS, N.; JONES, J. B.; SLUYS, V.; BOGDANOVE, A.
J.; DOW, J. M. Pathogenomics of Xanthomonas: understanding bacterium-plant interactions.
Nature Reviews Microbiology, v. 9, n. 5, p. 344-355, 2011. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/51037848_Pathogenomics_of_Xanthomonas_und
erstanding_bacterium-plant_interactions>. Acesso em: 26 dez. 2017.
SANCHES, A. L. R.; DE MIRANDA, S. H. G.; BELASQUE JUNIOR, J.; BASSANEZI, R. B.

Análise Econômica da Prevenção e Controle do Cancro Cítrico no Estado de São Paulo.
Revista de Economia e Sociologia Rural, v. 52, n. 3, p. 549-566, 2014. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1590/S0103-20032014000300008>. Acesso em: 21 set. 2017.
SCHIRALDI, C.; ROSA, M. de. The production of biocatalysts and biomolecules from
extremophiles. Trends in Biotechnology. v. 20, n. 12, p. 515-521, 2002. Disponível em:
<https://doi.org/10.1016/S0167-7799(02)02073-5>. Acesso em: 15 mar. 2018.
SCHOCH, C. L.; SEIFERT, K. A.; HUHNDORF, S.; ROBERT, V.; SPOUGE, J. L.;
LEVESQUE, C. A.; CHEN, W.; FUNGAL BARCODING CONSORTIUM. Nuclear ribosomal
internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.
109, n. 16, p. 6241–6246, 2012. Disponível em: <https://doi.org/10.1073/pnas.1117018109>.
69
SHEKH, R. M.; SINGH, P.; SINGH, S. M.; ROY, U. Antifungal activity of Arctic and Antarctic
bacteria isolates. Polar Biology, v. 34, n. 1, p. 139–143, 2011. Disponível em: <
https://link.springer.com/article/10.1007/s00300-010-0854-4>. Acesso em: 22 dez. 2017.
SILBER, J.; OHLENDORF, B.; LABES, A.; ERHARD, A.; IMHOFF, J. F. Calcarides A–E,
Antibacterial Macrocyclic and Linear Polyesters from a Calcarisporium Strain. Marine Drugs,
v. 11, n. 9, p. 3309-3323, 2013. Disponível em: <http://www.mdpi.com/1660-
3397/11/9/3309/pdf>. Acesso em: 22 dez. 2017.
SILVA, I. C.; REGASINI, L. O.; PETRÔNIO, M. S.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.;
BELASQUE JR, J.; SACRAMENTO, L. V. S.; FERREIRA, H. Antibacterial activity of alkyl
gallates against Xanthomonas citri subsp. citri. Journal of Bacteriology, v. 195, n. 1, p. 85-
94, 2013. Disponível em: <http://jb.asm.org/content/195/1/85.long>. Acesso em: 20 ago.
2016.
SPAGO, F. R.; ISHII MAURO, C. S.; OLIVEIRA, A. G.; BERANGER, J. P. O.; CELY, M. V. T.;
STANGANELLI, M. M.; SIMIONATO, A. S.; MELLO, J. C. P.; ANDRADE, G. Pseudomonas
aeruginosa produces secondary metabolites that have biological activity against plant
pathogenic Xanthomonas species. Crop Protection, v. 62, p. 46-54, 2014. Disponível em:
<https://doi.org/10.1016/j.cropro.2014.04.011>. Acesso em: 20 set. 2017.
SVAHN, K. S.; CHRYSSANTHOU, E.; OLSEN, B.; BOHLIN, L.; GÖRANSSON, U.

Penicillium nalgiovense Laxa isolated from Antarctica is a new source of the antifungal
metabolite amphotericin B. Fungal Biology and Biotechnology. v. 2, p. 1-8, 2015.
Disponível em: <https://doi.org/10.1186/s40694-014-0011-x>. Acesso em: 22 dez. 2017.
TAMURA, K.; STECHER, G.; PETERSON, D.; FILIPSKI, A.; KUMAR, S. MEGA6: molecular
evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, v. 30, n. 12,
p. 2725–2729, 2013. Disponível em: <https://dx.doi.org/10.1093%2Fmolbev%2Fmst197>.
VINCENT, W. F. Evolutionary origins of Antarctic microbiota: invasion, selection and

endemism. Antarctic Science, v. 12, n. 3, p. 374-385, 2000. Disponível em:
<https://doi.org/10.1017/S0954102000000420>. Acesso em: 20 dez. 2017.
APÊNDICE A
Figura 28 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (I)
Dados apresentados como porcentagem da média de inibição (n=3) e desvio padrão. Para concentrações onde não ocorreu inibição os dados não são
apresentados.
70
APÊNDICE A
Figura 29 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (II)
apresentados.
71
APÊNDICE B
Figura 29 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae
apresentados.
72
APÊNDICE C
Figura 29 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas euvesicatoria
apresentados.
73

Dissertação PDF

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Dissertação PDF

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

unesp “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA ANTÁRTICA COM

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA ANTÁRTICA

Dissertação apresentada ao Instituto de

Orientadora: Profª. Drª. Daiane Cristina Sass

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,

1. Fungos. 2. Cancro cítrico. 3. Mancha-bacteriana. 4.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP

As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande

Palavras-chave: Cancro cítrico. Mancha-bacteriana. Bacteriose. Atividade

Keywords: Citrus canker. Bacterial spot. Passion fruit bacteriosis. Antimicrobian

Tabela 1 - Média de produção de extratos para cada isolado. ................................. 40

2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 10

2.1. O gênero Xanthomonas ................................................................................. 10

2.2. Biotecnologia de Micro-organismos ............................................................. 20

3.1. Objetivos específicos ..................................................................................... 27

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 27

4.1. Reativação dos fungos filamentosos ............................................................ 27

4.2. Produção de extratos metabólicos brutos fúngicos ................................... 28

4.3. Avaliação in vitro da atividade antibacteriana dos extratos brutos

4.4. Concentração Inibitória Mínima (CIM90) dos extratos bioativos ................ 32

4.5. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos .............. 33

4.6. Identificação dos fungos filamentosos ......................................................... 34

4.7. Purificação dos extratos bioativos ................................................................ 35

4.7.1.1. Cromatografia em fase normal ..................................................................... 35

4.8. Atividade inibitória das frações cromatográficas ........................................ 37

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 38

5.1. Produção de extratos metabólicos brutos ................................................... 38

5.2. Ensaio de viabilidade celular – Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA) 41

5.3. Concentração Inibitória Mínima CIM90 dos extratos bioativos .................. 47

5.4. Concentração Bactericida Mínimo (CBM) dos extratos bioativos .............. 48

5.5. Identificação dos fungos filamentosos ......................................................... 51

5.6. Fracionamento dos extratos bioativos ......................................................... 53

5.7. Atividade antimicrobiana e pureza das frações ........................................... 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 63

Fitopatógenos do gênero Xanthomonas são responsáveis por grande perda

antibacteriana destes metabólitos contra algumas espécies de Xanthomonas (X.

Doenças causadas por Xanthomonas spp. geralmente tem início com

2.1.1. Câncro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri)

Fonte: CABI, online (2017).

O cancro cítrico tem grande importância para o setor citrícola brasileiro e o

De acordo com levantamento feito em 2017 o cancro cítrico está presente em

da doença na produção. A doença apresenta um ciclo composto por 4 fases:

Causas de disseminação do cancro cítrico: chuvas,

A bactéria penetra na planta através de aberturas naturais, como os

Figura 3 - Colonização de ramo, folha e fruto por X. citri subsp. citri.

Lesões necróticas aparecem. As bactérias são

De acordo com a legislação o controle do cancro cítrico depende da condição

2.1.2. Bacteriose (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae)

Fonte: IBGE – Produção Agrícola Municipal, 2015.

Figura 5 - Principais produtores de maracujá do país por estado.

Fonte: IBGE – Produção Agrícola Municipal, 2015.

As regiões de maior produção do maracujá no país também são

Pequenas lesões de aspecto encharcado e translúcido são induzidas pelo

Foto: EMBRAPA Amazônia Oriental

Conforme progride, a doença leva a perda das folhas e redução da

Foto: EMBRAPA Amazônia Oriental.

As medidas de controle da bacteriose consistem na utilização de mudas e

como método preventivo. Na região do cerrado o manejo da bactéria é feito por

sementes e em culturas através da água da chuva ou de irrigação em associação

Foto: EMBRAPA Hortaliças