INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE FITASA EN

ESTADO SÓLIDO Y DISEÑO DE UNA CÁMARA PILOTO
DE FERMENTACIÓN

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTAN:
FERNÁNDEZ MARTELL ALEJANDRO
SOLÍS ESCALANTE DANIEL

DIRECTOR:
DR. EDGAR SALGADO MANJARREZ

México, D.F. 22 de mayo del 2007

 Resumen

Las fermentaciones en estado sólido (FES) presentan varias ventajas sobre las tradicionales
fermentaciones sumergidas, sin embargo son muy pocos los procesos industriales que utilizan
este bioproceso. Entre los productos obtenidos por fermentaciones en estado sólido se
encuentran las enzimas, la mayoría se produce por Koji, una técnica ancestral de producción
utilizando hongos filamentosos sobre sustratos sólidos, principalmente cereales. En México un
proceso a nivel industrial de la fermentación en estado sólido es la obtención de fitasa, una
enzima hidrolítica que al ser adicionada al alimento en ganado y aves de corral aumenta la
absorción del fósforo contenido en los vegetales que consumen, por la técnica Koji.

En este trabajo se realizó la optimización del medio de cultivo, salvado de trigo, para la
producción de fitasa por Aspergillus niger, utilizando el diseño experimental fraccionado
Plackett-Burman, de acuerdo con los resultados obtenidos el extracto de levadura, detergentes
y fosfato de potasio tienen un efecto positivo. Además se obtuvieron los valores óptimos para
otros parámetros importantes como lo son la humedad y el tiempo de incubación, este objetivo
se alcanzó utilizando el método de superficie de respuesta dando como resultado que la
máxima producción de fitasa se obtiene a los 14 días y con una humedad relativa del 60%.

Un problema para la aplicación de la fermentación en estado sólido a nivel industrial es que la

mayor parte de la investigación se realiza a nivel laboratorio. Esta se realiza generalmente en
matraces que no cuentan con instrumentación por lo que no se sabe si podría haber
limitaciones en el transcurso de las fermentaciones. Por este motivo se diseñan biorreactores
piloto que controlen parámetros críticos en la fermentación, sin embargo existen pocos diseños.
Aquí se presenta el diseño de una cámara de fermentación de charolas (biorreactor tipo Koji)
para la fermentación en estado sólido que mantendría las condiciones de humedad y
temperatura por el método de enfriamiento evaporativo. Se propusieron varias configuraciones
de equipos que podrían proporcionar la humedad y temperaturas requeridas en la
fermentación, se eligió la mejor configuración de acuerdo a los requerimientos energéticos
dando como resultado que la recirculación del aire a la salida de la cámara puede disminuir
costos. La cámara se diseño en base a las características del crecimiento de A. niger en
fermentaciones sólidas, aunque se estimo que se puede trabajar con microorganismos cuya
velocidad de crecimiento en fermentación sólida sea de hasta 0.34 h-1 sin limitar el proceso por
oxígeno o alcanzar velocidades superficiales del aire elevadas que no permitan que se lleve a
cabo la fermentación.

i
 Contenido

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1

2. ANTECEDENTES ................................................................................................................. 3

2.1 Fitasa.............................................................................................................................. 3
2.2 Fermentación en estado sólido ...................................................................................... 3
2.3 Optimización................................................................................................................... 4
2.4 Optimización de medios de cultivo por diseños experimentales .................................... 5
2.5 Diseños factoriales completos........................................................................................ 6
2.5.1 Diseños factoriales fraccionados.................................................................................... 7
2.5.2 Diseños Plackett-Burman ............................................................................................... 7
2.6 Diseños de superficie de respuesta ............................................................................... 8
2.7 Biorreactores para FES.................................................................................................. 8
2.8 Diseño de biorreactores para FES ................................................................................. 9

3 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 12

4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 13

4.1 Objetivos Generales..................................................................................................... 13

4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................... 13

5 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................... 14

5.1 Optimización de la producción de fitasa....................................................................... 14

5.2 Diseño de cámara piloto............................................................................................... 16

6. RESULTADOS Y ANALISIS ............................................................................................... 19

6.1. Optimización de medio utilizando el diseño Plackett-Burman...................................... 19

6.2. Determinación de humedad y tiempo de incubación óptimos por el método de
superficie de respuesta........................................................................................................... 22
6.3. Diseño de cámara piloto de fermentación .................................................................... 24

7. DISCUSIÓN: ....................................................................................................................... 41

8. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 43

9. REFERENCIAS................................................................................................................... 45

10. ANEXOS ............................................................................................................................... A

ii
 Anexo 1: Protocolos de FES..................................................................................................... A
Anexo 2: Balances de materia.................................................................................................. E
Anexo 3: Determinación de VTO y VCO ................................................................................. U
Anexo 4: Determinación del espesor del biorreactor................................................................ Y
Anexo 5: Estimación de rendimientos para el sistema Aspergillus niger en salvado
de trigo....................................................................................................................................BB
Anexo 6: Lista de Símbolos ................................................................................................... DD

Índice de Figuras

Figura 1 Esquema general de un biorreactor de charolas para fermentación Koji ...................... 9

Figura 2 Ejemplo de utilización de la carta psicrométrica (49) para el sistema 4. A) Equipos
a utilizar, B) esquema de trayectoria y C) carta psicrométrica.......................................... 27
Figura 3. Dimensiones de la cámara de fermentación............................................................... 28
Figura 4. Sistemas de humidificacion planteados y esquemas de sus trayectorias a seguir
en la carta psicrométrica ................................................................................................... 29
Figura 5. Diagrama de flujo del sistema 4.................................................................................. 31
Figura 6 Soporte de aluminio. ................................................................................................... 36
Figura 7 Esquema de la estructura de soporte y distribución espacial del equipo .................... 37
Figura 8 Esquema básico de instrumentación de la cámara piloto de fermentación. ............... 40

Índice de Gráficas

Gráfica 1 Actividad de fitasa (11 factores),. ............................................................................... 22

Gráfica 2 Superficie de respuesta. ............................................................................................. 23
Gráfica 3 Calor generado por diferentes velocidades específicas de crecimiento..................... 26
Gráfica 4 Energía que ocupa el porceso.................................................................................... 30
Gráfica 5 Flujo de aire en el sistema en cada sistema............................................................... 30
Gráfica 6 Velocidad de transferencia de oxígeno ...................................................................... 32
Gráfica 7 Velocidad de aire humedo en tuberia de 3”-SS 316,.................................................. 32
Gráfica 8 Velocidad de aire humedo en la cámara .................................................................... 33

iii
 Índice de Tablas

Tabla 1 Diferentes tipos de biorreactores para FES (14).......................................................... 10

Tabla 2 . Concentraciones de factores para Plackett-Burman 32 x 32 ...................................... 15
Tabla 3 Factores empleados en Plackett-Burman de 11 factores ............................................. 16
Tabla 4. Compuestos reportados en la literatura que influyen en la producción de fitasa en
FES ................................................................................................................................... 19
Tabla 5. Matriz de diseño Plackett-Burman de 31 factores........................................................ 20
Tabla 6 Matriz de diseño Plackett-Burman de 11 factores........................................................ 21
Tabla 7 Respuestas del diseño Plackett-Burman para 11 factores .......................................... 21
Tabla 8 Espesores de pared ..................................................................................................... 24
Tabla 9 Dimensión de una charola de fermentación................................................................. 25
Tabla 10 Volumen total y de operación de la cámara de fermentación (biorreactor de
charolas). .......................................................................................................................... 25
Tabla 11 Datos necesarios para el calculo de calor metabólico y calor metabólico
resultante para A. niger teniendo como sustrato salvado de trigo. ................................... 25
Tabla 12 Tubería de servicios acero inoxidable-calibre 40 ....................................................... 34
Tabla 13. Tubería principal acero inoxidable-calibre 40............................................................. 35
Tabla 14 Tubería de descarga acero inoxidable-calibre 40 ...................................................... 35
Tabla 15 Dimensiones del soporte............................................................................................ 36
Tabla 16 Cotización de equipos de la cámara piloto de fermentación....................................... 38

iv
 1. INTRODUCCIÓN

El fósforo es un mineral esencial para el metabolismo del organismo animal

donde juega un papel muy importante en el desarrollo y mantenimiento de las
estructuras óseas; es un componente del ATP, de ácidos nucleicos y forma parte de
los fosfolípidos que integran y dan flexibilidad a las membranas celulares (1).

El fósforo consumido por el ganado se obtiene principalmente de alimento de origen

vegetal (granos), siendo el ácido fítico el fosfoglúcido más abundante en los granos. El
ácido fítico es un componente esencial de todas las semillas el cual constituye la
reserva más importante de fósforo y de otros minerales que se liberan durante la
germinación. Consiste en una molécula de inositol con 1 a 6 grupos ortofosfato unidos
mediante enlaces éster, químicamente se define como mio-inositol -1, 2, 3, 4, 5, 6 -
hexacis-fosfato. En torno a un 60-80% del fósforo total contenido en los granos y sus
subproductos se encuentra como parte del ácido fítico y sus sales, generalmente como
fitatos de calcio, potasio y magnesio (2, 3) cuya disponibilidad como fósforo libre para
animales monogástricos es prácticamente nula (3). Debido a su alto potencial
quelante, el ácido fítico forma sales insolubles a pH neutro lo que impide su absorción
a nivel intestinal, de manera que el fósforo contenido en el ácido fítico es excretado en
las heces, incrementando problemas de contaminación ambiental (3, 4, 5, 6,). El ácido
fítico también puede formar complejos insolubles con proteínas y almidón, e inhibir la
acción de ciertas enzimas tales como la α-amilasa, proteasas como tripsina y pepsina
y lipasas formando complejos mediante mecanismo aún desconocido (7).

Las fitasas (mio-inositol hexafosfato fosfohidrolasa) son fosfatasas ácidas que

catalizan el proceso de hidrólisis del ácido fítico, liberando de forma secuencial 6
grupos ortofosfato y mio-inositol; lo que permite que una fracción mayor del fósforo
orgánico sea transmitida en una forma aprovechable para los animales monogástricos
(6, 8). La cantidad de fitasa de origen vegetal que se encuentra en la mayoría de los
alimentos que se emplean en la dieta de ganado y aves de corral es insuficiente para
liberar de los fitatos todo el fósforo inorgánico que el animal necesita (9). Por esta
razón suplementar el alimento de ganado con esta enzima nos brinda una alternativa
para evitar la contaminación con fósforo y sobre todo favorece la asimilación de este
elemento y otros nutrientes en el ganado.

Las fitasas se producen de forma natural en numerosos cultivos bacterianos y

fúngicos, así como en ciertos granos de cereales; también están presentes en el tracto

1
intestinal de todos los animales debido a la ingestión de plantas que las contienen (6,
10). A nivel industrial se utilizan bacterias y hongos para producción de fitasa, debido a
que presentan una mayor actividad que las fitasas de origen vegetal (6). La fitasas de
origen fúngico son producidas por numerosas especies, siendo Aspergillus sp el
principal microorganismo utilizado en la actualidad (6). Se ha reportado que
Aspergillus niger produce grandes cantidades de fitasa cuando se realizan
fermentaciones en estado sólido (FES) (11), siendo el salvado de trigo el sustrato.

En nuestro país la producción de fitasa por FES se realiza por la técnica llamada Koji.
La técnica Koji destaca por su amplia aplicación a nivel industrial, principalmente en
Asia pero con gran auge en el occidente. El Koji es una técnica para la producción de
enzimas haciendo crecer hongos como Aspergillus sp en medios que principalmente
están compuestos por cereales. Este proceso es de gran importancia histórica y se
considera el mejor prototipo de la fermentación en estado sólido moderna (12).

En este trabajo se realizó la optimización estadística del medio de cultivo para la

producción de fitasa en FES a nivel laboratorio utilizando diseños factoriales
fraccionados y el método de superficie de respuesta. También se diseño una cámara
piloto de charolas (biorreactor Koji) para mantener las condiciones de humedad y
temperatura en un amplio rango de velocidades de crecimiento.

2
 2. ANTECEDENTES

2.1 Fitasa

El fósforo contenido en los fitatos no está disponible para aves y ganado ya que el
organismo de estos animales carece de enzimas, o al menos no en cantidad
suficiente, para romper y separar el fósforo de la molécula de inositol. En situaciones
normales, la mayor parte de ácido fítico aparece en las heces incrementando
problemas de contaminación ambiental (5, 3, 6). Su hidrólisis mediante la acción de las
fitasas mejora en proporciones variables la absorción de fósforo y aminoácidos, y evita
la contaminación del suelo por fósforo (8).

Las fitasas están presentes de forma natural en numerosos cultivos bacterianos y

fúngicos, así como en ciertos granos de cereales y oleaginosas; también están
presentes en el tracto intestinal de todos los animales debido a la ingestión de plantas
que las contienen (6, 10).

A nivel industrial la producción de fitasa se realiza con algunas bacterias y hongos

debido a que presentan una mayor actividad que las fitasas de las plantas. La fitasas
de origen fúngico son producidas por numerosas especies, la mayoría de ellas las
producen de manera extracelular, siendo Aspergillus sp el principal microorganismo
utilizado como fuente en la actualidad (6). Se ha demostrado que Aspergillus niger
produce grandes cantidades de fitasa cuando se encuentra en sustratos sólidos
comparada con la fermentación sumergida (FSm) (11).

2.2 Fermentación en estado sólido

La FES se define como el proceso fermentativo que ocurre en ausencia de agua

libre en el sistema y utilizando como soporte sólido un sustrato natural o un soporte
inerte (13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). Las FES son utilizadas desde tiempos muy antiguos
para la producción de alimentos fermentados, como la salsa de soja, el tempeh y el
queso azul; y para el composteo de desperdicios sólidos (12, 20, 11).

En los últimos años se ha observado que las FES tienen un gran potencial en una gran
variedad de procesos entre los cuales están la biorremediación, desintoxicación
biológica de alimentos, biotransformación y la producción de una variedad amplia de

3
productos con alto valor agregado como enzimas, saborizantes y colorantes; se ha
demostrando que en FES se obtienen mejores rendimientos o productos con mejores
características comparada con productos similares en fermentaciones sumergidas
(FSm) (12). Las FES se han llevado a cabo en gran escala en principalmente en
países asiáticos, sin embargo en el resto del mundo la aplicación a nivel industrial es
baja.

La producción de enzimas por FES es el proceso más usado debido a que en estos
procesos los productos fermentados pueden ser utilizados directamente como la
fuente nutricional, sin requerir de procesos de purificación. Además que las FES
ofrecen numerosas ventajas sobre las FSm, como altos rendimientos o productos con
mejores características y requerimientos simples en el equipamiento (12).

Existe un gran numero de microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos

que presentan un buen crecimiento en sustratos sólidos, sin embargo los hongos
filamentosos se utilizan más debido a que las características del medio empleado son
muy similares a las condiciones que se tienen en el ambiente natural donde se
desarrollan (18, 21, 22).

2.3 Optimización

Los principales objetivos de una optimización es encontrar los valores de variables

en un proceso que nos den el mejor rendimiento bajo una serie de restricciones de
operación para un criterio de funcionamiento establecido. Los ingenieros trabajan por
mejorar los diseños iníciales para obtener un beneficio máximo con un costo mínimo.

La optimización puede tener lugar a varios niveles dentro de un proceso, lo cual indica
que al mencionarla no necesariamente se habla de un optimo global, puede ser local.
Puede ir desde una actividad gruesa hasta una detallada, indispensable en el proceso.
La optimización se puede llevar a cabo principalmente en tres partes de los procesos:
1) manejo (administración), 2) diseño y especificaciones de equipo y 3) funcionamiento
del proceso.

Hablar de optimización no es garantía de un mejor proceso, los resultados obtenidos

por las técnicas de optimización deben ser evaluadas y juzgadas por los ingenieros
con el fin de decidir si se utilizan los valores obtenidos o solo se colocan como limites

4
de aceptación. Principalmente los problemas de optimización y su método de solución
dependen de la naturaleza y número de variables dependientes e independientes en el
proceso. (23)

2.4 Optimización de medios de cultivo por diseños experimentales

Reducir los costos de producción optimizando el medio de producción es una

de las investigaciones básicas en aplicaciones industriales en biotecnología. El uso de
diseños estadísticos para este fin es ampliamente utilizado mostrando ser una
herramienta poderosa en este campo (24).

La optimización de un bioproceso conlleva al mejoramiento del rendimiento y calidad

del producto manipulando los parámetros nutricionales y físicos, así como el
mejoramiento de la cepa. Evaluar los requerimientos nutricionales y ambientales de los
microorganismos es un paso importante para el desarrollo de fermentaciones. Para la
obtención de un medio de producción económico se requiere la selección de fuentes
de carbono (FC), nitrógeno (FN), fósforo (FF), potasio (FP) y elementos trazas. (25,
26, 27, 28).

En las FES la selección del sustrato sólido para procesos de fermentación es un factor
crítico que involucra la búsqueda de materiales agro-industriales y nutrientes (27, 29).
Optimizar medios de producción por el método clásico se realiza cambiando una sola
variable mientras las demás se mantienen fijas en un nivel. Sin embargo este
procedimiento es muy costoso y requiere mucho tiempo y trabajo, por otro lado no se
pueden determinar los efectos por la interacción de varios componentes (26, 27, 30).

Una estrategia alternativa es ocupar acercamientos estadísticos. La optimización

estadística no solo nos permite una evaluación rápida y ordenada sobre los factores
involucrados en un experimento, sino también permite determinar el rol de cada
componente o factor. Otra ventaja importante de los diseños estadísticos en procesos
de optimización es que requieren un número menor de experimentos lo cual implica
menos trabajo, tiempo y costo (26, 30, 31).

Existen diversos análisis estadísticos, como diseños Plackett-Burman, factoriales

incompletos y factoriales completos. El diseño Plackett Burman es muy utilizado
cuando se busca hacer una discriminación de variables y no se cree que exista

5
interacción entre los factores, puesto que esto es lo que los distingue de los factoriales
incompletos, no se ven fácilmente las interacciones (28, 30). Las técnicas estadísticas
de diseños experimentales y superficies de respuesta son herramientas muy útiles ya
que proporcionan modelos que facilitan la comprensión del efecto de los componentes
y sus interacciones (25, 27).

El diseño (estadístico) experimental es un procedimiento para planear experimentos

de tal forma que los datos obtenidos puedan analizarse y obtener conclusiones
objetivas. Los diseños experimentales comienzan determinando los objetivos de los
experimentos y seleccionando los factores del proceso. Un diseño experimental
maximiza la cantidad de información que se puede obtener de varios experimentos
(32).

Para la producción de fitasa se han determinado fuentes de nitrógeno que aumentan la

producción utilizando el diseño experimental Plackett-Burman (33) y se han
determinado otros medios de producción en el que su composición se obtuvo con
diseños Plackett-Burman (34, 35).

2.5 Diseños factoriales completos

En algunos experimentos se estudian los efectos de de uno o más factores, para este
tipo de experimentación se utilizan los diseños factoriales en los cuales en cada
ensayo o prueba del experimento se investigan todas las combinaciones posibles de
todos los niveles de cada factor. Las ventajas de utilizar los diseños factoriales son
que permiten detectar la existencia de efectos de interacción entre los diferentes
factores tratados.

Los diseños factoriales 2k son diseños en los que se trabaja con k factores, todos ellos
con dos niveles (se suelen denotar alto y bajo o + y -). Estos diseños son adecuados
para tratar el tipo de problemas descritos sin embargo si k es grande, el número de
experimentos (n) que necesita un diseño factorial de dos niveles es muy grande (n =
2k).

Los diseños experimentales completos no son recomendables, en términos de costo y

tiempo, para más de cinco factores para este caso se recomienda utilizar un diseño
factorial fraccionado o un diseño Plackett-Burman (36).

6
2.5.1 Diseños factoriales fraccionados

La Sociedad Americana para el Control de la Calidad, en su glosario y tablas para la

calidad estadística, define los diseños factoriales fraccionados como: “Un diseño
experimental factorial en el cual solo se escogen la fracción de los experimentos
requeridos por el diseño factorial completo para ser llevados a cabo” (36).

El propósito básico de los diseños factoriales fraccionados es el investigar las causas y

efectos de los factores en los experimentos. En este tipo de diseños se puede verificar
cual de los factores tienen influencia sobre el experimento y cuales son las
interacciones entre los factores, es por esta razón que se les nombra diseños de
barrido o escaneo. El termino diseño de barrido se refiere al plan experimental que
busca encontrar los factores con efecto significativo de una lista de varios factores
potenciales (36).

2.5.2 Diseños Plackett-Burman

El diseño Plackett-Burman es una variedad de los diseños factoriales fraccionados; el

cual es ortogonal por lo que se pueden obtener los efectos de cada factor estudiado
por separado y no confundirlo con interacciones entre los mismos (28); en este diseño
se estudian k variables en k+1 experimentos, su empleo nos permite realizar una
evaluación rápida y económica del efecto de cada factor empleado.

El diseño Plackett-Burman tiene la capacidad de evaluar múltiples variables

independientes y detectar las variables significativas en un solo experimento;
comprende un tipo de diseño experimental de nivel 2. El diseño Plackett-Burman
consiste en matrices con en arreglos obtenidos mediante el análisis de un factorial
completo de 2k donde solo se seleccionaron las combinaciones que proporcionen la
mayor cantidad de información (37).

Los diseños Plackett-Burman tradicionales consisten en matrices de 8, 12, 16, 20 y 24

28 y 32 pruebas. En este diseño, los niveles superiores e inferiores son codificados
como +1 y -1, respectivamente. Cabe mencionar que cada factor es probado el mismo
número de veces tanto en su valor superior como en el inferior, esto provee
resultados correctos y una estimación lineal eficiente para cada uno de los factores. Su

7
análisis consiste en verificar el efecto de cada factor estudiado mediante una gráfica
de efectos, en la cual se observa como influye cada factor en el problema planteado.

Pij=Σ Yd , si Xj=i en la matríz 1

Efectoj= P+j - P-j 2

El efecto de cada factor se determina con las ecuaciones 1 y 2, donde i es el nivel (+ o

-) al que se estudia el factor j en el experimento d y Y es el valor experimental
obtenido.

2.6 Diseños de superficie de respuesta

El método de superficie de respuesta consiste en un grupo de técnicas matemáticas y

estadísticas dedicadas a la evaluación de las relaciones existentes entre un conjunto
de factores experimentales controlados y las respuestas medidas de acuerdo con uno
o más criterios para encontrar el óptimo en sistemas multivariables (29, 25). En este
método generalmente el comportamiento del proceso puede describirse con
ecuaciones polinomiales, principalmente cuadráticas o cúbicas (36).

2.7 Biorreactores para FES

La FES ofrece varias ventajas sobre la tradicional FSm, principalmente aumenta la

producción y rendimientos (17, 22) y en ciertos casos la expresión de los metabolitos
es diferente (22). El costo de operación y equipo, así como el consumo de energía, es
menor que en FSm (13, 15, 17, 18, 19). También en la mayoría de los casos los
procesos de purificación y recuperación del producto son menores (13, 19, 22). Por
otro lado las fermentaciones son lentas y algunas variables de operación son más
difíciles de controlar (18).

Los biorreactores para FES se clasifican de acuerdo a su agitación o aeración (22, 38),
existiendo de charolas, tambor y columna empacada (18, 22, 38, 39). Los principales
biorreactores industriales son de tipo charolas y de tambor rotatorio (17). Los procesos
de FES pueden ser en lote, continuos y lote alimentado (18). La mayor parte de FES
son llevadas a cabo en procesos por lote, empleando la técnica denominada Koji
donde el biorreactor de charolas es característico para este tipo de fermentaciones

8
(21, 22). El biorreactor de charolas es el diseño más simple, en él se controla la
humedad y temperatura por la técnica de enfriamiento evaporativo (evaporative
cooling) (38). Estos biorreactores consisten en una cámara, de ahí que en ocasiones
se mencione como cámara de fermentación, a la cual se introduce aire con
temperatura y humedad controladas, este circula alrededor de las charolas donde se
lleva a cabo la fermentación (22) (Figura 1).

Figura 1 Esquema general de un biorreactor de charolas para fermentación Koji; 1,

filtro de aire; 2, intercambiador de calor; 3, humidificador; 4, charolas y 5, camara de
fermentación.

2.8 Diseño de biorreactores para FES

El biorreactor es el corazón de los procesos fermentativos, bajo ciertas condiciones el

material ocupado de soporte se convierte en el producto deseado (18). Para que esto
suceda se deben de mantener ciertas condiciones óptimas, esto es el trabajo del
biorreactor.

Los diseños de fermentadores para FES son pocos (15) y en su mayoría los diseños
están en etapas de investigación (Tabla 1). Las consideraciones en los diseños de
FES son: materiales, esterilidad, regulación de aeración, mezclado, remoción de calor,
parámetros ambientales, uniformidad y preparación de sustrato (18). Para los
procesos fermentativos en sustrato sólido los parámetros a controlar son: temperatura,
aeración, pH, humedad relativa, contenido de agua en el sustrato (13, 14, 15, 16, 21),
sin embargo debido a la heterogeneidad del proceso es difícil medir los parámetros
ambientales, la biomasa y el producto (14).

9
 Tabla 1 Diferentes tipos de biorreactores para FES (14)

Reactor Descripción Ventajas/desventajas

Reactores de Investigación

Matraces erlenmeyer Matraz tapado con algodón o gasa Simple, bajo costo, no existe control, aeración pasiva

Reactor de columna Columna empacada con sustrato, aeración Bajo costo, fácil de regular la temperatura y el flujo de
fluidizada aire

Reactores industriales y piloto

Reactor de charolas Charolas con una delgada capa de sustrato, Buena aeración, control de temperatura y humedad,
colocadas en una cámara controlada Heterogéneo

Reactor de tambor Tambor cilíndrico horizontal o vertical. Agitado por Agitación suave, homogéneo, remoción de calor pobre
un sistema de impulsores en rotación

Reactor de columna Reactor de columna con la base perforada por Aeración excelente, remoción de calor efectiva, alto
donde se hace pasar aire (aeración forzada) por costo
entre las partículas de sustrato

10
A diferencia de FSm, donde la mayor restricción se presenta en el suministro de
oxígeno, en FES el control de la temperatura y humedad son los parámetros críticos
del proceso (13, 21, 38). El control de temperatura se enfoca en remover el calor
generado por la fermentación que es directamente proporcional a la actividad
metabólica del microorganismo empleado (17, 18, 22). La remoción de calor se
complica por la baja conductividad térmica de los materiales de soporte-sustrato y su
baja humedad (17, 18). El gradiente de temperatura en el sustrato alcanza 3.1°C cm-1
(17) y en procesos industriales se alcanzan temperaturas de 47-50°C (17, 19, 22). Las
técnicas convencionales para el control de la temperatura en FSm no sirven para FES
(17, 18), generalmente para el control de la temperatura se introduce aire saturado a
27±1°C y 90-97% de humedad relativa (17) para evitar que se seque el sustrato,
previniendo la caída en la concentración de oxígeno, esta técnica se llama
enfriamiento evaporativo (18).

Se han utilizado varios diseños de biorreactores para FES pero no existen muchos a
una escala mayor a 1 L, esto se debe a los problemas de escalamiento (21, 38). Los
métodos de escalamiento disponibles no se pueden aplicar directamente en este
proceso (19).

Además de los medios de producción también se han estudiado otros parámetros

como el tiempo de fermentación, la humedad y el inoculo, que ayuda a la adaptación
del microorganismo en el sustrato sólido (20, 11, 40).

A nivel industrial se conocen dos biorreactores de charolas con aeración forzada,

Prophyta comercializado por una compañía alemana, trabaja bajo condiciones de
esterilidad, y PlafractorTM de la empresa india Biocon (21).

11
 3 JUSTIFICACIÓN

La FES cuenta con varias ventajas sobre la tradicional FSm, en países orientales se
utiliza desde siglos para obtener productos de alto valor agregado, principalmente
alimentos. Sin embargo en la región occidente del planeta su desarrollo a nivel
industrial es escaso y principalmente se cuenta con investigación a nivel de
laboratorio. Uno de los procesos industriales que utilizan este tipo de fermentación es
la producción de enzimas por hongos filamentosos, en particular la producción de
fitasa se desarrolla en FES. La fitasa es una hidrolasa que libera el fósforo contenido
en el ácido fítico para que este sea aprovechado por los animales del ganado y se
evite la contaminación del suelo con fósforo. La producción de fitasa se realiza en FES
debido a que sus rendimientos de producción son mayores comparados con la FSm.
En México se produce esta enzima por la técnica Koji. La producción de fitasa se lleva
a cabo por A. niger sobre sustratos naturales, generalmente se utiliza salvado de trigo,
por otro lado existen indicios de que los rendimientos pueden aumentar si se agregan
diferentes nutrientes al medio de producción. Una forma de determinar que
compuestos podrían tener efecto sobre la producción de fitasa es utilizar procesos de
optimización.

La mayoría de investigaciones realizadas sobre FES, entre ella la optimización, se

lleva a cabo en matraces donde no se cuenta con instrumentación por lo que no se
consideran ciertos parámetros como humedad, oxígeno y calor, importantes para
realizar este proceso, es por esto que obtener una cámara de fermentación que simule
las condiciones industriales es necesaria para el estudio y aplicación de esta
fermentación. Los tipos principales de biorreactores para FES son de charolas
(llamado también cámara de fermentación) y tambor rotatorio, siendo el de charolas el
más común, por su similitud con la técnica Koji considerada el mejor prototipo de la
FES.

Es por estas razones que en el presente trabajo se realizaron diseños experimentales

Plackett-Burman y superficie de respuesta para optimizar la producción de fitasa a
nivel laboratorio, y se diseñó una cámara piloto de charolas que mantenga las
condiciones de humedad y temperatura durante el proceso de fermentación.

12
 4 OBJETIVOS

4.1 Objetivos Generales

• Desarrollar un estudio de optimización de un medio de fermentación en

estado sólido para producción de fitasa.
• Diseñar una cámara piloto para fermentación en estado sólido.

4.2 Objetivos Específicos

• Determinar la actividad enzimática de la fitasa.

• Realizar fermentaciones en estado sólido.
• Discriminar los factores con efecto positivo en la formulación de medio de
cultivo mediante un diseño de Plackett Burman
• Optimizar el medio de fermentación mediante un diseño de superficie de
respuesta.
•Diseño de una cámara piloto para fermentación en estado sólido.
• Estimación de costos de fabricación de la cámara piloto.

13
 5 MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Optimización de la producción de Fitasa

Microorganismo
Para las fermentaciones se utilizó una cepa de Aspergillus niger productora de fitasa.
La cual se fue mantenida en tubos de ensayo con medio PDA (Agar dextrosa papa) en
refrigeración.

Inóculo
Un medio líquido que contiene una fuente de carbón, una fuente de nitrógeno, sales y
salvado de trigo fue esterilizado por 20 min a 121°C y deshidratado en un horno a
100°C, en este medio se coloca una colonia de A. niger, se incubó a 30±2°C a 200
rpm durante 72 h (S2, ver Anexo 1)

Fermentación en estado sólido (fermentación Koji)

Las FES se llevaron a cabo en matraces erlenmeyer de 500 mL con 10 g de salvado
de trigo. Fueron inoculados con 8 mL de una dilución 1:20 de la fermentación líquida,
inoculo (S2). Se incubaron a 30±2°C por 5 días.

Extracción de la enzima
Se adicionaron 200 mL de buffer de acetatos 5mM 5.5±0.5 de pH (solución de acetato
de sodio 0.2 M pH 5.5±0.5 al 2.5 % v/v con agua) a los matraces Koji fermentados. Se
molió con un procesador de alimentos y se dejó reposar por 1.5 h con una leve
agitación cada 30 min. Posterior se filtró con algodón; el filtrado se ocupó para los
ensayos enzimáticos.

Actividad enzimática
La actividad enzimática de la fitasa se midió obteniendo la densidad óptica de la
liberación de fósforo a partir de una solución de ácido fítico. Con el filtrado obtenido en
la extracción se realizaron diluciones con buffer de acetatos 5mM 5.5±0.5 de pH para
obtener una dilución final de 1:14000. Con 0.5 mL de esta dilución se preparó la
mezcla de reacción la cual contenía 0.5 mL de solución sustrato (ácido fítico 2.71 g/L);
la reacción se dejó durante 10 min a 37 °C. Una vez cumplido este tiempo se
adicionaron 2 mL de solución de paro (1:1:2 partes de molibdato de amonio 10 mM,
ácido sulfúrico 5 N y acetona) y 0.1 mL de ácido cítrico 1 M. Se midió la densidad
óptica de las muestras utilizando un espectrofotómetro a 380 nm utilizando un blanco

14
el cual contenía las mismas soluciones que la mezcla de reacción pero la solución de
paro se agrega antes que la muestra. Se definió la unidad de fitasa (UP) como la
cantidad de fitasa que libera 1 µmol de fosfato inorgánico por minuto a 37°C y pH 5.5 a
partir de ácido fítico.

Optimización de medio utilizando el diseño Plackett-Burman

Se utilizó un diseño Plackett-Burman para observar el efecto de 31 factores a dos
niveles (+ y -) (Tabla 2). Las concentraciones ocupadas para el diseño se
establecieron en base a la literatura consultada. Se realizaron FES Koji que contenían
16.5 mL de los nutrientes. Posteriormente se realizó un diseño con solo 11 factores,
los cuales según la bibliografía tienen influencia sobre la actividad de la fitasa (Tabla
3). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y los resultados presentados
en este trabajo son un promedio.

Tabla 2 . Concentraciones de factores para Plackett-Burman 32 x 32

Factores Concentración Factores Concentración

+ - + -

X1 Lactosa 50g/L 5g/L X17 Ác fosfórico 1mL/L 500 µL/L

X2 Glucosa 50g/L 5g/L X18 Ác. fítico 1mL/L 500 µL/L

X3 Sacarosa 50g/L 5g/L X19 Ác. oleico 1mL/L 500µL/L

X4 Manitol 50g/L 5g/L X20 EDTA 5g/L 0.5 g/L

X5 Almidón de maíz 50g/L 5g/L X21 STTP 5g/L 0.5 g/L

X6 Maltosa 50g/L 5g/L X22 Tween 20 1mL/L 500µL/L

X7 Nitrato de amonio 5g/L 0.5 g/L X23 Tween 80 1mL/L 500µL/L

X8 Sulfato de amonio 5g/L 0.5 g/L X24 Tritón X-100 1mL/L 500µL/L

X9 Nitrato de sodio 5g/L 0.5 g/L X25 Cloruro de calcio 5g/L 0.5 g/L

X10 Extracto de 5g/L 0.5 g/L X26 Sulfato de cobre 5g/L 0.5 g/L
levadura
X11 Peptona 5g/L 0.5 g/L X27 Sulfato de 5g/L 0.5 g/L
magnesio
X12 Urea 5g/L 0.5 g/L X28 Cloruro férrico 5g/L 0.5 g/L

X13 Ác. láctico 1mL/L 500µL/L X29 Biotina 1mg/L 0.1mg/L

X14 Ác. fórmico 1mL/L 500µL/L X30 Tiamina 1mg/L 0.1mg/L

X15 Ác. Cítrico 1mL/L 500µL/L X31 Fosfato de 5g/L 0.5 g/L
potasio
X16 Ác. sulfúrico 1mL/L 500µL/L

15
Determinación de humedad y tiempo de incubación óptimos por el método de
superficie de respuesta
Se realizaron FES determinando la actividad de fitasa a los 5, 6, 7, 8, 9 y 10 días, las
humedades fueron de 48%, 53%, 57% y 60% de humedad relativa. Estas humedades
se alcanzaron adicionando agua estéril hasta la humedad requerida. Todos los
experimentos se realizaron por duplicado y los resultados presentados en este trabajo
son un promedio. Los datos experimentales se ajustaron a una ecuación cuadrática
(Ecuación 3) (41) para describir una superficie de respuesta y obtener los parámetros
óptimos.

2 2
Y β 0 + β 1⋅ X1 + β 2⋅ X2 + β 3⋅ X1 + β 4⋅ X2 + β 5⋅ X1⋅ X2
3

Tabla 3 Factores empleados en Plackett-Burman de 11 factores

Concentración g/L Concentración g/L

Factores Factores
+ - + -
X1 Lactosa 60 6 X7 Tween 20 2.65 1.32
X2 Glucosa 60 6 X8 Tween 80 2.87 1.44
Extracto de
X3 levadura 10 1 X9 Tritón X-100 2.71 1.35
X4 Peptona 10 1 X10 Cloruro de calcio 0.01 0.01
X5 EDTA 0.04 0.02
X11 Fosfato de potasio 2.5 1.25
X6 Ác. Oléico 3.11 1.56

5.2 Diseño de cámara piloto

Microorganismo de diseño
El microorganismo de diseño fue Aspergillus niger, a partir de sus características de
crecimiento en sustrato sólido se diseño el proceso.

Descripción del proceso

La cámara diseñada mantendrá las condiciones de humedad y temperatura por el
método de enfriamiento evaporativo, para esto se diseño el proceso de humidificación
del aire que entrará a la cámara. Se propusieron cuatro diferentes configuraciones de
equipos para poder controlar los parámetros mencionados y se realizaron los balances
de materia y energía correspondientes para escoger en base al consumo de energía,
el sistema a desarrollar. Los criterios de diseño fueron: 1) esterilización, se realizará in

16
situ; 2) control de temperatura, principalmente retirando el calor metabólico; 3) control
de humedad y 4) oferta de oxígeno.

Calor metabólico
El control de la temperatura se centró en la remoción del calor generado por el
metabolismo del microorganismo a emplear, este calor guarda una relación directa con
el consumo de oxígeno (Ecuación 4). Para calcular el calor metabólico se siguieron
dos alternativas: 1) utilizando la demanda de oxígeno reportada en la literatura y 2)
realizando un balance estequiométrico.

Utilizando la demanda de oxígeno (DO) reportada para A. niger sobre salvado de trigo,
0.2 molO2 kgX -1 h-1 (12) se calculó el calor metabólico generado:

Q = DO ⋅ X ⋅ ε [W] 4

Donde X es la biomasa esperada (Tabla 11), ε es la cantidad de calor generado por

mol de oxígeno.

Para el balance estequiométrico se utilizó la ecuación 5 (12) para calcular el

rendimiento de oxígeno en base a biomasa (YO2/X) y el calor metabólico generado con
la ecuación 6.

[CH1.98 O0.63 N0.26 ]+Y O2/S O2----->YX/S [CH1.72 O0.52 N0.17 ]+Y CO2/S +Y A/S H2 O
5

Yo 2 / X
Q= ⋅ µ ⋅ X ⋅ ε [W] 6
PM X

Psicrometría
La psicrometría estudia las propiedades termodinámicas de una mezcla gas- vapor. La
mayoría de las aplicaciones se refiere al aire húmedo, considerado como la mezcla de
aire seco y vapor de agua. La psicrometría resulta útil en el diseño de equipos que
exigen un control del contenido de humedad en el aire. Para la técnica de enfriamiento
evaporativo se necesita humidificar el aire que entrara a la cámara de fermentación, el
proceso de humidificación se diseñó en base a la tabla psicrométrica sobre la cual se
trazaron cuatro diferentes trayectorias que nos brindan aire con una temperatura de
26 °C y una humedad relativa cerca del 100% (Anexo 2) (42, 43, 44).

17
Balances de materia y energía
Los balances de materia y energía se realizaron a partir del calor metabólico a retirar
en la cámara de fermentación.
Qmet
F= [Kgaire seco/s] 7
hn − hn +1
Donde F es el flujo de aire seco a la entrada de la cámara, Qmet es el calor metabólico
generado obtenido de la ecuación 4 o de la 6, h n es la entalpía de aire a la entrada de
la cámara y h n+1 es la entalpía del aire a la salida de la cámara. A partir de este
balance se realizaron los balances para los equipos que humidificarán el aire (Anexo
2). De acuerdo a estos balances se determinó la configuración de equipos que se
utilizará en base al consumo de energía.

Velocidad de transferencia de oxígeno (VTO)

Una vez que se diseñó el sistema de control de temperatura y humedad el siguiente
parámetro que debe considerarse en una fermentación aerobia es la oferta de
oxígeno. Con los flujos de aire obtenidos de los balances de materia y energía, las
dimensiones de la cámara y correlaciones se estimó un coeficiente de transferencia de
masa. Con las concentraciones de oxígeno a la entrada y a la salida se obtiene la VTO
(Anexo 3). Estos parámetros se determinaron considerando la transferencia en las
charolas como placas y en el área transversal donde la velocidad del aire es la menor.
La ecuación 8 es la correlación para el cálculo del coeficiente de transferencia de
masa para placas (45).

l ⋅υ υ
1 1
kL
= 0.646 ⋅ ( 0 ) 2 ( ) 3 8
D υ D

Donde D es el coeficiente de difusión del oxígeno, υ es la viscosidad cinemática, υ0 es

la velocidad del aire, l es la longitud de las charolas y k es el coeficiente de
transferencia de masa.

La VTO debe ser mayor a la velocidad de consumo de oxígeno (VCO), la cual se

puede calcular con las ecuaciones 9 y 10.

Yo 2 / X
DO = ⋅µ ⎯[molO2/kgX h] 9
PM X

VCO = DO ⋅ X ⋅ PM O 2 [kgO2/h] 10

18
 6. RESULTADOS Y ANALISIS

6.1. Optimización de medio utilizando el diseño Plackett-Burman

Los métodos estadísticos para la optimización de medios de producción han probado

ser una herramienta poderosa para la biotecnología (24). En el primer diseño Plackett-
Burman no se obtuvieron resultados confiables, en los experimentos 4, 5, 6, 7, 11, 12,
13, 15, 16, 23, 26, 27 y 28 (Tabla 5) la actividad de fitasa tuvo valores negativos. Estos
valores negativos podrían deberse a interacciones de algunas sales probadas con el
ácido fítico, en experimentos posteriores se observó que los valores negativos se
presentaban cuando se presentaban contaminaciones en las fermentaciones; estas
dos posibles explicaciones deberán probarse con otra serie de experimentos que no
se realizaron para este trabajo.

Se decidió consultar bibliografía para realizar un diseño Plackett-Burman más pequeño

(Tabla 6) para evitar posibles interacciones de los compuestos probados. Los
compuestos elegidos fueron aquellos que tenían, según la literatura, un efecto sobre la
producción de fitasa en FES (Tabla 4).

Tabla 4. Compuestos reportados en la literatura que influyen en la producción de fitasa

en FES. No todos los compuestos tienen el mismo efecto en diferentes experimentos.

Efecto sobre la producción de

fitasa en FES (Referencia)
Compuesto
Positivo Negativo

Lactosa 3
Glucosa 3, 46, 47, 6, 3
Extracto de
levadura 47
Peptona 47 33
Ácido oléico 46
EDTA 6 5, 47
Tween 20 46
Tween 80 20, 46, 47, 6
Tritón X-100 20 46, 47
Cloruro de calcio 5 20, 47, 6
Fosfato de potasio 46, 20 47

19
 Tabla 5. Matriz de diseño Plackett-Burman de 31 factores (37). Algunas actividades (UP/g) tuvieron valor negativo por lo que no se analizó la
respuesta

Factores Producción
Experimentos X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 de fitasa
UP/g
1 - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + 58
2 - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - 328
3 - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - 56
4 - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - -119
5 + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - -75
6 - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + -116
7 + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - -107
8 - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + 57
9 + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - 256
10 + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + 224
11 + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + -105
12 - + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + -58
13 + + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - -26
14 + - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + 49
15 - - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + -36
16 - - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - -49
17 - + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - 331
18 + + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - 59
19 + + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + 41
20 + + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + 74
21 + + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + 203
22 + - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + 98
23 - - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + -22
24 - + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - 12
25 + + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - 91
26 + - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + -27
27 - + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + -24
28 + - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - -26
29 - - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + 252
30 - + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - 137
31 + - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + - - + + - + - - 140
32 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 522

20
 Tabla 6 Matriz de diseño Plackett-Burman de 11 factores (37)

Factores Producción
Experimentos X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 de fitasa
UP/g
1 + + - + + + - - - + - 231
2 + - + + + - - - + - + 599
3 - + + + - - - + - + + 517
4 + + + - - - + - + + - 816
5 + + - - - + - + + - + 465
6 + - - - + - + + - + + 626
7 - - - + - + + - + + + 640
8 - - + - + + - + + + - 629
9 - + - + + - + + + - - 591
10 + - + + - + + + - - - 540
11 - + + - + + + - - - + 871
12 - - - - - - - - - - - 649

El nuevo análisis experimental nos mostró que cuatro sustancias tienen un efecto
positivo en el proceso (Tabla 7). Estos factores son: extracto de levadura, Tween-20,
Tritón X-100 y fosfato de potasio.

Tabla 7 Respuestas del diseño Plackett-Burman para 11 factores

Factores Respuesta
1 Lactosa -103
2 Glucosa -32
3 Extracto de levadura 129
4 Peptona -157
5 EDTA -13
6 Ác. Oleico -70
7 Tween 20 166
8 Tween 80 -73
9 Triton X-100 51
10 Cloruro de calcio -43
11 Fosfato de potasio 44

Durante las fermentaciones realizadas en los diseños experimentales se observó una

variación amplia en los resultados de la actividad de fitasa, aun cuando los
experimentos se realizaban bajo las mismas condiciones y el inóculo era el mismo.
Una posible explicación para esto es el propio inóculo, la forma de inocular se siguió

21
de acuerdo al protocolo de una empresa productora de fitasa por FES (Anexo 1,
confidencial), este proviene de una fermentación sumergida la cual aumenta la
producción de fitasa (11), pero es difícil estandarizar la cantidad de biomasa que se
utiliza como inóculo para la FES.

1200

1000

800

UP/g
600

400

200

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Koji
Experimentos

Gráfica 1 Actividad de fitasa del diseño para 11 factores, el experimento llamado Koji
es un control el cual no tiene ningún nutriente. Las barras de error en algunos
experimentos son amplias, posiblemente por la diferencia en la cantidad de biomasa
inicial en las repeticiones.

6.2. Determinación de humedad y tiempo de incubación óptimos por el

método de superficie de respuesta.

Con los datos obtenidos experimentalmente se realizó una estimación lineal, esta
estimación resulto en una ecuación cuadrática (Ecuación 11) con un coeficiente de
correlación (R2) de 0.95

2 2
Y −909.63 + 157.02X1 + 23.10X2 − 8.37X1 − 0.35X2 + 1.35X1⋅ X2
11

“Y” es la respuesta del experimento (UP/g), X1 son los días, X2 son las humedades.

Utilizando la ecuación 11 se realizó la gráfica de superficie (Gráfica 2) donde se

determinó que la humedad y tiempo de incubación óptimos para este proceso son 60%
y 14 días respectivamente.

22
 1000

800

600

UP/g

400

22.5
20
200 17.5
15 Días
12.5
0 10
48

56

64

7.5
72

80

88

Humedad Relativa %

22.5

21.5

20.5

19.5

18.5

17.5

16.5

15.5
Días
14.5

13.5

12.5

11.5

10.5

9.5 800-1000
600-800
8.5 UP/g
400-600
7.5 200-400
48

56

64

72

80

88

0-200
Humedad Relativa %

Gráfica 2 Superficie de respuesta, el óptimo es cuando hay un maximo en la

superficie, la flecha roja muestra el punto óptimo a los 14 días y 60% de humedad.

23
 6.3. Diseño de cámara piloto de fermentación

Espesor de las paredes del tanque (cámara)

Tomando en cuenta que la temperatura y presión máximas de trabajo en la cámara
serán las de esterilización, 121°C y 1 atm respectivamente. Se realizaron los cálculos
(Anexo 4) para obtener el espesor de la cámara, agregando un 10 % a los valores, los
resultados se muestran en la Tabla 8.

La cámara diseñada cuenta con las siguientes características: 1) Tanque cilíndrico

vertical con cabeza sometida a presión interna, 2) tapa toriesférica bridada, este tipo
de tapa soporta mejor los esfuerzos generados por la presión, 3) base toriesférica
soldada con salida inferior en la base de la tapa y 4) material de acero inoxidable
grado 316 acabado industrial, ninguna parte de la cámara esta en contacto con el
salvado por lo que no es necesario un acabado más liso.

Tabla 8 Espesores de pared

Espesor de pared del fermentador

Parte del fermentador Espesor calculado Espesor comercial a emplear
Tanque cilíndrico 0,701 mm 5 mm
Tapa toriesférica 1,185 mm 5 mm
Base toriesférica 1,185 mm 5 mm

Las dimensiones de la cámara se muestran en la Figura 3.

Calor metabólico
Capacidad: salvado y biomasa esperada
La cámara cuenta con seis charolas donde se colocará el sustrato para la
fermentación (salvado de trigo). Las dimensiones de estas charolas se encuentran en
la Tabla 9, el volumen de operación será 90% del volumen total. Para realizar los
cálculos correspondientes al calor metabólico se propuso que el 25% del volumen de
operación es biomasa, cabe mencionar que esto es un sobrestimado (Tabla 10). La
biomasa que se espera es de aproximadamente 3 kg. Para observar los cálculos ver
Anexo 2.

24
 Tabla 9 Dimensión de una charola de fermentación.

Dimensión de las charolas de fermentación

Altura 5 cm
Ancho 30 cm
Largo 46 cm
.

Tabla 10 Volumen total y de operación de la cámara de fermentación (biorreactor de

charolas).

Características del sistema de fermentación

Capacidad de charolas 0.0069 m3
Volumen total 0.0414 m3
Volumen de operación (10% del 0.037 m3
total)
Cantidad de salvado de trigo 11.178 kg

Calor metabólico calculado

El calor metabólico fue calculado utilizando datos reportados en literatura con la
ecuación 4; en la Tabla 11 se muestra el calor metabólico generado así como los
parámetros que fueron considerados.

Tabla 11 Datos necesarios para el calculo de calor metabólico y calor metabólico

resultante para A. niger teniendo como sustrato salvado de trigo.
Calor metabólico.
Biomasa 2.795 kg.
Demanda de oxígeno 0.2 mmolO2/gX h
Velocidad de consumo de O2 1.5525x10-4 molO2/s
Calor metabólico 71.415 J/s

Otra forma de calcular el calor metabólico es a travéz de un balance estequiometrico,

con el balance estequimetrico se puden obtener los rendimientos para esta

25
fermentacion (48) (Anexo 5); sin embargo se observó que estequiometricamente el
salvado de trigo no necesariamente se debe oxidar para formar los productos
(Biomasa, agua y CO2), sabiendo que la produccion de fitasa es un proceso aerobio
podemos decir que los elementos contenidos en el salvado de trigo no estan
totalmente disponibles. Por este motivo no se pudo obtener ningun rendimiento. Sin
embargo se realizó el calculo de calor generado con la ecuación 6 utilizando un
rendimiento reportado en la literatura bajo un sistema similar al propuesto, en este
trabajo se reporta un rendimiento de 0.826 molO2/molX (12). Por otro lado, observamos
que el calor metabolico esta en función de la velocidad específica de crecimiento (µ)
(Gráfica 3), la µ de A. niger sobre slavado de trigo no esta reportada, esto dio lugar a
buscar el valor máximo de µ que el diseño puede operar el diseño.

6500

5500

4500
Qmet [Watts]

3500

2500

1500

500

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

-500

µ [hr-1]

Gráfica 3 Calor generado por diferentes velocidades específicas de crecimiento

Psicrometría
Para humidificar del aire se plantearon cuatro sistemas, los equipos y esquemas de
sus trayectorias en la carta psicrométrica se muestran en la Figura 4. En la Figura 2 se
presenta un ejemplo de cómo se utilizaron las trayectorias en la carta psicrométrica
para conocer la humedad, temperatura y entalpía del aire en los diferentes puntos
antes de llegar a la humedad y temperatura deseada.

26
Figura 2 Ejemplo de utilización de la carta psicrométrica (49) para el sistema 4. A)
equipos a utilizar, B) esquema de trayectoria y C) carta psicrométrica.

27
Figura 3. Dimensiones de la cámara de fermentación.

28
 Trayectorias de diseño

Sistema 1
Sistema 2 Sistema 3
Sistema 4

Figura 4. Sistemas de humidificacion planteados y esquemas de sus trayectorias a seguir en la carta psicrométrica

29
Balances de materia y energía
Con los balances de materia y energía de los diferentes sistemas empleados se
determinó en base al consumo de energía (Gráfica 4) y a la cantidad de aire necesario
(Gráfica 5) cual es el sistema más conveniente para desarrollar. Ver aAnexo 2 para
cálculos.

Gráfica 4 Energía que ocupa el proceso, sistema 2; sistema 3; sistema 4

Gráfica 5 Flujo de aire en el sistema en cada sistema, el flujo de aire se calculó de

acuerdo al calor metabólico a retirar y este a su vez es función de µ Flujo de aire
en el sistema 1; Flujo de aire en el sistema 2; Flujo de aire en el sistema 3;
Flujo de aire en el sistema 4

30
Como se muestra en las gráficas Gráfica 4 y Gráfica 5 el sistema 4, con recirculación,
promete ser el de menor costo de operación ya que requiere menos energía y el flujo
inicial de aire es el menor. Por estos motivos se eligió el sistema 4 (Figura 5) para
trabajar.

Figura 5. Diagrama de flujo del sistema 4.

De acuerdo con la ecuación 7, el flujo de aire esta en función del calor metabólico a
retirar, el calor metabólico calculado para A. niger (72 W) requiere de un flujo másico
de aire de 74 kgaire seco/ h para retirarlo. Por otro lado para determinar la µ máxima con
que se puede trabajar en el sistema se consideró la VTO y la velocidad del aire.

VTO
Como se observa en la Gráfica 6 la VTO calculada es mayor que la VCO por lo que la
transferencia de oxígeno no es un limitante para el proceso.

Velocidad superficial del aire

La velocidad superficial del aire (ecuación 12) debe ser baja para evitar problemas
con el sustrato ya que una velocidad alta en el tanque puede removerlo, por otro lado
una velocidad alta en las tuberías puede generar caídas de presión altas y
contaminación por ruido.

31
Gráfica 6 Velocidad de transferencia de oxígeno, observamos que para valores de µ
de 0 a 0.5 la VTO es mayor al consumo de oxígeno. VTO; VCO

Gráfica 7 Velocidad de aire humedo en tuberia de 3”-SS 316, es recomendable que la

velocidad en tuberias para un gas sea menor a la velocidad del sonido (340 m/s) para
evitar altas caídas de presión y contaminación por ruido.

32
Gráfica 8 Velocidad de aire humedo en la cámara para las velocidades de crecimiento
probadas, la velocidad dentro de la cámara es pequeña por lo que no influye en la
eleccion de la µ máxima..

F
V= [m/s] 12
A

Donde: F es el flujo volumétrico y A es el área transversal.

La velocidad alcanzada con el flujo necesario para retirar el calor generado a la

velocidad de crecimiento de 0.34 h-1 es la máxima que el sistema en base a los
criterios establecidos (Gráfica 8) puede manejar. Las tablas 12, 13 y 14 (50, 51, 52)
muestran las tuberías que se emplearán y sus dimensiones.

Soporte de las charolas

El tipo de biorreactor a diseñar fue de charolas. Las charolas a emplear son de acero
inoxidable acabado espejo con una capacidad de fermentación de 1.863 kg de salvado
de trigo en cada una. Se propone un arreglo de 6 charolas para obtener una volumen
de fermentación de 11.18 kg distribuidas sobre una soporte de aluminio reforzado,
Tabla 15.

Distribución espacial del equipo

La distribución del equipo está diseñada para facilitar su manejo, control y limpieza del
mismo, la cámara de fermentación la dividimos en dos secciones:

• Equipo de fermentación (Cámara de Fermentación).

33
 • Equipos auxiliares (Soplador, Filtro HEPA, Sistema de calentamiento y
enfriamiento, y Humidificador).

Dicha distribución se llevo a cabo sobre una estructura que confiere soporte a todos
los equipos empleados.

Tabla 12 Tubería de servicios acero inoxidable-calibre 40

Tubería sanitaria de Acero inoxidable 316 L Calibre 40

Diámetro a B c d e
0,5" 5.1 cm 249.3 cm 5.1 cm

1" 142 cm 176.7 cm 57.7 cm 71.5 cm 37.4 cm

1" 35 cm 65.2 cm

1" 9.7 cm 53.3 cm 76.7 cm

34
 Tabla 13. Tubería principal acero inoxidable-calibre 40

Tubería sanitaria de Acero inoxidable 316 L

Calibre Diámetro A b c D
40 3" 13.9 cm 32 cm

40 3" 13.9 cm 22 cm

40 3" 30 cm

40 3" 14.9 cm 17.8 cm 14.9 cm

40 3" 22.23 cm 50.8 cm 44.9 cm 14.9 cm

Tabla 14 Tubería de descarga acero inoxidable-calibre 40

Tubería sanitaria de Acero inoxidable 316 L Calibre 40

Diámetro a b c d e F
abcdef 9.0 cm. 53.7cm. 50.0cm. 50.0cm. 53.7cm. 9.0 cm.
2"

g
3"

0,5 " 7.1 cm. 24.3cm. 5,2 cm.

35
 Tabla 15 Dimensiones del soporte

Dimensiones del soporte de las charolas

Largo 0.585 m
Ancho 0.425 m
Alto 0.667 m
Espesor de lamina 1 mm

Estructura de soporte
La estructura se diseño con la principal característica de hacer una distribución de tal
forma que todos los equipos y tuberías empleadas sean accesibles para su fácil
manipulación y limpieza, y para garantizar la seguridad del operador y del equipo.

Figura 6 Soporte de aluminio.

La estructura de soporte (Figura 6) estará construida de tubo rectangular de laminillas

rígidas de aluminio, sus dimensiones son: 2.00 m de largo, 1.40 m de ancho y 2.65 m
de altura; cuenta con un soporte principal situado a 1.00 m de altura; se planea cuente
con ruedas giratorias para facilitar el traslado del equipo. La distribución de los equipos
se realizó de tal forma que los equipos auxiliares se encuentren el la parte inferior del

36
soporte principal. En la parte superior de la base principal del soporte se encontrará la
cámara de fermentación, se planeó para que se tenga suficiente espacio para realizar
las maniobras de carga y descarga de las charolas de fermentación (Figura 7). En la
parte izquierda de la estructura se plantea añadir una repisa para la colocación del
sistema de control.

Figura 7 Esquema de la estructura de soporte y distribución espacial del equipo

Evaluación del costo de la cámara piloto de fermentación

Una vez terminado las cuestiones de diseño se prosiguió a realizar un estimación del
costo de diseño, para ello se seleccionaron las partes que conforman la cámara piloto
y se realizaron estimaciones partir de catálogos Cole-Parmer obteniendo un costo
aproximado de $ 187,804.56 (ciento ochenta y siete mil ochocientos cuatro pesos
56/100 M.N.) sin instrumentación, cabe recalcar que esta nos es una cotización en
forma ya que necesitamos consultarla directamente de distribuidores pero por el
momento sirve para conocer el costo aproximado para su realización.

37
 Tabla 16 Cotización de equipos de la cámara piloto de fermentación.

Cotización de accesorias de la cámara de fermentación

cantidad costo unitario MN subtotal
Soplador 1 $ 1027,5 $ 11,549.1
Intercambiador de calor 2 $ 4500 $ 9,000
Fermentador 1 $ 112275 $ 112,275
Recipientes 2 $ 1989,48 $ 3,978.96
Filtro 1 $ 7907,34 $ 7,907.34
Filtro de reemplazo 2 $ 1584,84 $ 3,169.68
Abrazadera 3” 12 $ 632,25 $ 7,587
Abrazadera 2.5” 2 $ 379,35 $ 758.7
Abrazadera 3” 3 puertos 2 $ 5277,18 $ 10,554.36
Junta sanitaria 3” 20 $ 74,184 $ 1,483.68
Junta sanitaria 2.5” 1 $ 463,65 $ 463.65
Junta sanitaria 3” - 3 1 $ 1,374.09
puertos $ 1374,09
Válvula de mariposa 2 $ 8851,5 $ 17,703
Total (MN) $ 187,804.56

Instrumentación del equipo

La etapa final del diseño de la cámara piloto de fermentación es la instrumentación; ya
una vez establecidas las variables de operación se prosiguió a diseñar el sistema de
control de proceso, debido a que esta nos mantendrá y controlará los parámetros de
proceso diseñados.

En la Figura 8 se representa de manera general el esquema básico de instrumentación

que se empleará en la cámara piloto de fermentación, enfocado en el control de
temperatura, flujo y de humedad debido a que desde un principio se planteo la
necesidad de remover el calor metabólico generado.

Variables a controlar:
Temperatura: se plantea que las mediciones de temperatura sean registradas por un
indicador–controlador a través de un termopar el cual cuente con salidas análogas
para poder ser adjuntado a una tarjeta de adquisición de datos.

38
Humedad: el contenido de humedad en el aire es importante en nuestro proceso, por
ello se plantea que las mediciones sean registradas por un indicador–controlador el
cual cuente con salidas análogas para poder ser adjuntado a una tarjeta de
adquisición de datos

Flujo: El flujo es fundamental debido a que nos retira el calor generado y el CO2
producido, además de brindar el oxígeno necesario, por ello se plantea que las
mediciones sean registradas por un indicador–controlador el cual cuente con salidas
análogas para poder ser adjuntado a una tarjeta de adquisición de datos

El sistema de humidificación presentado en la Figura 8 se encuentra constituido por un

soplador, un filtro, un humidificador, dos intercambiadores de calor y la cámara de
fermentación bajo este arreglo se determinaron los principales puntos de control
quedado de la siguiente manera:

• Control del flujo de aire en la alimentación

• Control del nivel de agua en el humidificador (H-130)
• Control de vapor de agua en el intercambiador de calor (I-120)
• Control de agua en intercambiador de calor (I-140)

Descripción
El flujo de aire en la alimentación pretende ser controlado con una válvula de
mariposa, la cual esta conectada a un controlador de flujo con la finalidad de mantener
los volúmenes de aire constantes, para mantener el flujo de aire al momento de que se
mezcle el aire de entrada con el aire del recirculado, posteriormente el aire pasa por el
sistema de calentamiento I-120, el cual tiene un sistema de control en la válvula del
vapor de agua la cual esta en función de la temperatura establecida a la salida del aire
caliente el I-120, después este aire pasa por el humidificador H-130, el cual tiene un
sistema de control de nivel, debido a que va a haber una transferencia de masa entre
el aire y el agua del humidificador, por lo tanto se necesita que el volumen de agua en
el humidificador se mantenga constante, finalmente el aire húmedo pasa por el
sistema de enfriamiento I-140,el cual tiene un sistema de control en la válvula de agua
fría, la cual esta en función de la temperatura y humedad establecida a la salida
intercambiador I-140.

39
Figura 8 Esquema básico de instrumentación de la cámara piloto de fermentación.

40
 7. DISCUSIÓN:

Le FES cuenta con varias ventajas sobre la FSm que le brindan características para su
desarrollo industrial, desafortunadamente el auge de la FSm evito que la FES se
afianzara como el bioproceso mayormente usado. En la actualidad la FES se
encuentra en etapas de investigación y solo en algunos casos se utiliza en procesos
industriales, sin embargo estos procesos se realizan de forma casi artesanal con
conocimiento limitado y poco control.

Entre las ventajas de la FES sobre la FSm está un aumento en los rendimientos de
producción. Aun así se cuenta con información de que los rendimientos en FES
pueden ser mayores a los obtenidos (53, 54, 55), esto se alcanza optimizando los
medios de producción ya que en algunos sustratos utilizados no se encuentran todos
sus nutrientes disponibles, este caso se observa que en la optimización aquí realizada
que según la ecuación condensada del salvado de trigo no requiere de fuentes de
carbono ni nitrógeno y en los resultados del diseño Plackett-Burman las fuentes
probadas de nitrógeno dieron resultados positivos, siendo el extracto de levadura el de
mayor efecto positivo de los compuestos probados; no así sucedió con las fuentes de
carbono.

La FES cuenta con una principal desventaja, el tiempo de fermentación, se reporta que
en la mayoría de las fermentaciones los rendimientos máximos se obtienen a partir del
séptimo día (54), esto concuerda con los resultados obtenidos en el método de
superficie de respuesta donde el día óptimo es el 14.

Por definición en la FES no se cuenta con un flujo libre de agua, sin embargo es
necesaria cierta humedad para que la transferencia de masa y de calor sean buenas o
por lo menos de un grado suficiente (12). A nivel piloto e industrial la humedad se
controla con al aire que entra en las cámaras de fermentación, este aire atraviesa por
un proceso de humidificación antes de introducirlo. Uno de los métodos más utilizados,
enfriamiento evaporativo, fue el método utilizado en el diseño del biorreactor aquí
presentado. Sin embargo cuando se estudia la fermentación a escala laboratorio no se
puede mantener un control en los matraces por lo que la humedad se alcanza
adicionando agua al medio de cultivo, la cantidad de agua es importante ya que debe
ser suficiente para mantener una película de agua entre el ambiente y el sustrato con
el fin de que los nutrientes así como el oxígeno estén disueltos y disponibles para el

41
microorganismo, pero no debe ser tanta que evite el crecimiento. Para la producción
de fitasa con el sistema probado un 60% de humedad relativa es la humedad óptima
para que se lleve a cabo la fermentación.

Otra desventaja que se tiene en la FES es la dificultad de medir ciertos parámetros

para el seguimiento de la fermentación, el principal de estos parámetros es la cantidad
de biomasa. Se ha reportado que la mejor forma de aclimatar a los microorganismos,
principalmente a los hongos filamentosos, para la FES mantenerlos primero en un
medio líquido (11) en el cual es igualmente difícil de medir la biomasa. En este trabajo
la inoculación de las FES se llevo acabo a partir de una fermentación líquida
observando que el no conocer la cantidad de biomasa inicial puede generar amplias
variaciones en los experimentos. Una forma de evitar esto podría ser realizando
pruebas donde el inóculo parta de una suspensión de células o esporas de cantidad
conocida. Sin embargo la heterogeneidad del medio puede afectar la distribución de
estas.

Se tienen pruebas de que la FES puede ser un mejor proceso de producción que la
FSm aun así se cuenta con información de que este proceso puede mejorar.
Desafortunadamente la mayor parte de la investigación se realiza en matraces los
cuales no cuentan con control de ningún parámetro, es por esto que los biorreactores
piloto son buenas herramientas para un acercamiento de los procesos a nivel
industrial. El biorreactor de charolas (cámara piloto) aquí presentado podría mantener
las condiciones de humedad y temperatura así como controlarlas para realizar
estudios de este tipo de fermentaciones.

El crecimiento de hongos filamentosos en FES es bueno pues simula las condiciones

ambientales en las que estos microorganismos crecen, esta reportado que algunos
hongos cuentan con velocidades de crecimiento de hasta 0.29 h-1 (12) en sustratos
sólidos. De acuerdo a los cálculos realizados y a las consideraciones en este trabajo la
cámara de fermentación diseñada puede trabajar en fermentaciones donde las
velocidades especificas de crecimiento sean de hasta 0.34 h-1. La producción de fitasa
por A. niger sobre un sustrato de salvado de trigo puede realizarse en el biorreactor
diseñado.

42
 8. CONCLUSIONES

La optimización de procesos nos lleva a aumentar la producción y disminuir costos, en

el caso de las fermentaciones nos ayuda a conocer los nutrientes que aumentan la
producción de la fitasa y así poder tomar una decisión sobre su utilización a nivel
industrial.

El proceso utilizado fue basado en aquel utilizado por una industria, no está bien
estandarizado puesto que las fuentes de variación son diversas, por ejemplo el inóculo
que aunque se sabe es la mejor forma de adaptar al microorganismo a la FES no es
recomendable para fines de investigación pues no se sabe con exactitud que cantidad
de biomasa inicial se tiene; la naturaleza heterogénea del proceso es importante pues
observamos que aun en fermentaciones provenientes del mismo inoculo e iniciadas el
mismo día la variación es importante.

De acuerdo con los resultados de los diseños experimentales concluimos que

principalmente los detergentes, fuentes de nitrógeno como extracto de levadura y
fuentes de fosfato ayudan al aumento en la producción de fitasa. Esto es un poco
sorprendente dada la formula condensada del salvado, hemos de suponer que el
nitrógeno no está fácilmente disponible por lo que nitrógeno adicional (o en exceso)
favorece la producción. Esto concuerda con el hecho de que las fuentes de carbono
tuvieron poco efecto positivo pero se contradice con la literatura.

En particular, la optimización presentada se realizó en matraces lo cuales no contaban

con instrumentación por lo que no sabemos si hubo limitaciones por oxígeno,
humedad o calor. Por esto se requiere una cámara piloto que simule las condiciones
industriales y permita una optimización más útil. De cualquier forma, aparentemente se
puede obtener un mayor rendimiento.

En este trabajo se presentó el diseño de un biorreactor piloto de charolas para FES el

cual consta con un sistema de humidificación que satisface la demanda de oxígeno y
remueve la generación de calor, este diseño puede operar en fermentaciones donde la
velocidad específica de crecimiento sea menor de 0.34 h-1 o la generación de calor no
rebase los 4418 W. Nuestros cálculos son conservadores así que es probable que
funcione aún por encima de estas demandas pero no sabemos hasta donde. La
producción de fitasa por A. niger en FES puede ser llevada acabo en la cámara

43
diseñada. Se demostró que la recirculación es efectiva para FES en Koji ya que
reduce considerablemente la demanda de energía sin despreciar los requerimientos
del microorganismo.

44
 9. REFERENCIAS

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50
 10. ANEXOS

Anexo 1: Protocolos de FES

Inoculación de semilla 2 (Matraz S2)

El S2 es una fermentación sumergida para preparar al microorganismo para su
posterior inoculación a la fermentación en estado sólido (Matraz Koji).

Material y equipo:
Cepa (SLAM 1) para producción Asa estériles
Medio de semillas 2 Campana de flujo laminar

Procedimiento:
1. En condiciones estériles, transferir con ayuda de una asa toda la cepa (SLANT) a
un medio para segunda semilla.
2. Incube la semilla a 30+ 2°C y con agitación. Durante 72 horas

Siembra de koji

Material y equipo:
Pipetas de 10mL Asas
Autoclave Balanza digital
Matraces de 500ml, 125 mL. Salvado de trigo
Tapones de algodón natural Campana de flujo laminar
Mechero Muestra a inocular o sembrar

Procedimiento:

a) Preparación del Koji.

1. Se pesar 10 gr. de salvado de trigo en un matraz de 500ml totalmente seco y
se les coloca un tapón de algodón y cinta testigo.
2. Esterilizar a 121 ºC durante 20 minutos.

b) Inoculación del Koji.

1. Tomar una muestra del S2 y se trasfiere a un frasco con 100 ml de agua estéril,
mezclar y se inocula a Koji.
2. Incubar a 30+ 2º C durante 5 dias

A
Extracción de la enzima

Material y equipo:
Probetas de 250 mL Embolo de plástico
Vaso de precipitado de 2L Algodón
Tubos para preparar diluciones licuadora

Procedimiento:
1. Adicionar 200 mL de agua de proceso a cada matraz Koji.
2. Dejar reposar por 90 minutos y filtrar con algodón.
3. Realizar diluciones, dilución inicial 1:21.

Determinación de la actividad de Fitasa

Material y equipo:

Matraces aforados de 50 mL Tubos de ensaye de 10 mL

Matraces aforados de 1 L Baño de agua a 37±0.5°C
Potenciómetro Cronómetro con segundero
Balanza analítica Campana de vapores
Vasos precipitados de 1L Espectrofotómetro
Recipientes para baño de hielo Micropipeta de 1000 µL

Procedimiento:

a) Reacción:

1. Pipetee 0.5 mL en solución sustrato en tres tubos para la muestra en un

tubo de 10 mL (12x200 mm) y coloque los tubos en baño a 37°C
2. Al tiempo cero, adicione 0.5 mL de la muestra diluida a los tubos con
sustrato. Incubar por 10 min.
3. Una vez transcurridos los 10 min. de incubación adicione 2.0mL de
solución de paro
4. Treinta segundos después de adicionar 0.1 mL de ácido cítrico 1M
5. Determine la absorbancia a 380 nm contra agua.

B
 b) Blancos:

1. En un tubo de 10 mL pipetee 0.5 mL de la muestra, incube por 15 min.

2. Adicione 2.0 mL de solución de paro al tubo.
3. A continuación adicione 0.5 mL de solución de sustrato.
4. Después de 30 segundos adicione 0.1 mL de ácido cítrico 1M.
5. Determine la absorbancia de la muestra (blanco de ensayo) (ODSB)

c) Curva tipo:

1. Pipetee 1 mL de la solución estándar en un tubo de ensayo de 10 mL.

2. Adicione 2 mL de solución de paro y repóselas por 30 segundos.
3. Después de los 30 segundos adicione 0.1 mL de ácido cítrico.
4. Determine la absorbancia de la muestra.
5. Determine la absorbancia de las otras tres soluciones estándar de la
misma manera (ODS1, ODS2,ODS3, ODS4)

CALCULOS:

Unidad de fitasa micromolar:

• Una unidad de fitasa micromolar (PU) es la cantidad de enzima que libera 1

micromol de fosfato inorgánico por minuto a partir de una solución 2.5 mM de
fitato de sodio a 37°C y pH 5.5.
• Reste el valor de absorbancia del blanco de los estándares (ODSB) de cada
uno de los valores de absorbancia de los estándares de la curva tipo (ODS1,
ODS2, ODS3, ODS4).
• Grafique las diferencias de absorbancia contra la concentración de cada una de
las soluciones estándar (en µmol/mL), grafique las concentraciones en el eje de
las “X” y las absorbencias en el eje de las “Y”.
• Calcule la pendiente de la recta obtenida en términos de µmol/mL de fosfato al
valor de 1.000 de absorbancia a 380 nm. A este valor de la pendiente se le
denomina F (Pendiente de Curva Estándar de Fitasa).

C
Actividad de fitasa por gramo:

(ODT − ODTB ) * F * 2
Actividad = ……..1
10 * W * Dilución

Donde:

PU: Unidad de fitasa.

ODT: Densidad óptica de ensayo.
ODTB: Densidad óptica del blanco de ensayo.
F: Pendiente de la curva estándar.
2: Corrección de volumen.
1/10: Corrección de tiempo.
W Es el peso original de la muestra.
Dilución: Es la usada para diluir la muestra hasta lograr un valor de
unidades de fitasa entre 0.4 y 0.6 PU/mL.

D
 Anexo 2: Balances de materia

Datos:
BTU kJ
840⋅ = 1953.84
lb kg
kJ
hw := 2454⋅
kg Entalpía del agua a 20ºC
kg
ρw := 1000
3
m Densidad del agua
kJ
cp := 4.185 ⋅
kg ⋅ K Calor especifico del agua

xr := 0.30 % de recirculación

Ecuaciones:
9
F( C) := ⋅ C + 32
5 Ec ºC a ºF

R( C) := F( C) + 459.4 Ec ºC a ºR

T( C) := ( C + 273.15) ⋅ K Ec ºC a ºK

Tc := 647⋅ K p c := 219.4 ⋅ bar

Agua:

( 3
λ( C) := 2.499 × 10 − 2.09798⋅ C − 0.003247⋅ C ⋅
2 ) kJ
kg
( C + 273.15) ⋅ K
x( C) := 1 −
Tc

⎛ −7.76451⋅ x( C) + 1.45838⋅ x( C) 1.5 − 2.7758⋅ x( C) 3 − 1.23303⋅ x( C) 6 ⎞

p vap ( C) := p c ⋅ exp⎜
⎝ 1 − x( C) ⎠

Presión atmosférica: p := 0.77⋅ bar

E
 p vap ( C ) 18.02
H 100 ( C ) := ⋅
p − p vap ( C ) 28.07
100% de saturación:

f
H% ( C , f) := H 100 ( C ) ⋅
saturación relativa 100

v H( C, f) := ⎛⎜ ⎞ ⋅ 22.4⋅ L ⋅ C + 273.15⋅ 1⋅ bar

1 H%( C, f)
+
g g mol 273.15 p
⎜ 28.97⋅ 18.02⋅
volumen húmedo: ⎝ mol mol ⎠

3
m
v H( 0 , 100) = 1.012 3
Volumen Húmedo al kg m por kg de aire seco

100% de humedad y 0 ºC

kJ
cH( C, f) := ( 1.005 + 1.884⋅ H%( C, f) ) ⋅
Calor húmedo: kg kJ por kg de aire
seco

Entalpía de gas húmedo (Referencia 0°C):

h ( C , f) := c H ( C , f) ⋅ C + H% ( C , f) ⋅ λ ( 0)

kJ
h ( 10, 100) = 36.283
Entalpía de gas Húmedo kg kJ por Kg de aire
seco
al 100% de humedad y 10 ºC

Balance de materia Sistema 1

F
De acuerdo a la tabla psicrométrica y a la trayectoria siguiente:

Tenemos:
F1A F1V F11 F12 F13

f1A := 17 f1V := 100 f11 := 13 f12 := 100 f13 := 90 Humedad

C1A := 20 C1V:= 121 C11 := 53 C12 := 26 C13 := 28 Temperatura ºC

Obtenemos:

Entalpías Volumen Húmedo Densidades

1
v1A := v H( C1A, f1A) ρ1A :=
h1A := h ( C1A, f1A) v1A
1
v11 := vH( C11, f11) ρ11 :=
h11 := h( C11, f11) v11
1
v12 := vH( C12, f12) ρ12 :=
h12 := h( C12, f12) v12
1
v13 := vH( C13, f13) ρ13 :=
h13 := h( C13, f13) v13
3 kg
kJ m ρ1V = 0.842
h1A = 28.781 v1V := 1.188 3
kg kg m
3 kg
kJ m ρ1A = 0.923
h1V := 2711.4 v1A = 1.084 3
kg kg m
3 kg
kJ m ρ11 = 0.809
h11 = 102.723 v11 = 1.236 3
kg kg m
3 kg
kJ m ρ12 = 0.868
h12 = 100.892 v12 = 1.152 3
kg kg m
3 kg
kJ m ρ13 = 0.862
h13 = 104.347 v13 = 1.16 3
kg kg m

G
Balances de energía:

FA⋅ hA + FV⋅ hV F1⋅ h1 Mezcla vapor saturado – aire

F1 ⋅ h1 + Fw ⋅ hw F2 ⋅ h2 Humidificador

F2 ⋅ h2 + Qmet F3 ⋅ h3 Para el fermentador

FA ⋅ hA + FV ⋅ hV + Fw ⋅ hw + Qmet F3 ⋅ h3 Global

Con el calor metabólico (Qmet) calculado (Anexo 5) y los balances obtenemos:

J
Qmet := 4418.156
s

Para el fermentador

F12 ⋅ h12 + Qmet F13 ⋅ h13

Como el flujo másico de aire es igual en todos los puntos:

Qmet
F1( Qmet) :=
h13 − h12

El flujo de aire seco necesario es:

kg
F1( Qmet) = 76.72
min

Para el punto de mezcla vapor saturado - aire

h11 − h1A
x :=
x⋅ F⋅ hV + ( 1 − x) ⋅ F⋅ hA F⋅ h1 h1V − h1A x = 0.028

y con el balance de materia:

F1V( Qmet) := x⋅ F1( Qmet) F1A( Qmet) := ( 1 − x)F1( Qmet)

H
Por lo que el flujo volumétrico en cada punto de balance es:

3 3
F1A( Qmet) m 3 ft
Fh1A ( Qmet) := Fh1A( Qmet) = 1.347 Fh1A ( Qmet) = 2.855 × 10
ρ1A s min
3 3
F1( Qmet) m 3 ft
Fh11( Qmet) := Fh11( Qmet) = 1.58 Fh11( Qmet) = 3.348 × 10
ρ11 s min
3 3
F1( Qmet) m 3 ft
Fh12( Qmet) := Fh12( Qmet) = 1.473 Fh12( Qmet) = 3.12 × 10
ρ12 s min
3 3
F1( Qmet) m 3 ft
Fh13( Qmet) := Fh13( Qmet) = 1.484 Fh13( Qmet) = 3.144 × 10
ρ13 s min
3 3
F1V( Qmet) m ft
Fh1V( Qmet) := Fh1V( Qmet) = 0.042 Fh1V( Qmet) = 88.717
ρ1V s min

Balance de materia en el humidificador

F1 ⋅ h1 + Fw ⋅ hw F2 ⋅ h2

F1( Qmet) ⋅ ( h13 − h12)

Fw1( Qmet) :=
hw⋅ ρw

El flujo de agua es:

3
−6 m
Fw1( Qmet) = 1.8 × 10
s
L
Fw1( Qmet) = 6.481
hr

I
 Balance de materia Sistema 2

F1 F2 F3 F4
f21 := 17 f22 := 1 f23 := 100 f24 := 90 Humedad
C21 := 20 C22 := 73 C23 := 26 C24 := 28 Temperatura ºC

De acuerdo con la tabla psicrométrica y la trayectoria:

Tenemos:

Obtenemos:

Entalpías Volumen Húmedo Densidades

1
h21 := h( C21, f21) v21 := vH( C21, f21) ρ21 :=
v21
1
h22 := h( C22, f22) v22 := vH( C22, f22) ρ22 :=
v22
1
h23 := h( C23, f23) v23 := vH( C23, f23) ρ23 :=
v23
1
h24 := h( C24, f24) v24 := vH( C24, f24) ρ24 :=
v24

J
 3
kJ m kg
h21 = 28.781 v21 = 1.084 ρ21 = 0.923
kg kg 3
m
3
kJ m kg
h22 = 87.778 v22 = 1.284 ρ22 = 0.779
kg kg 3
m
3
kJ kg m
h23 = 100.892 ρ23 = 0.868 v23 = 1.152
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h24 = 104.347 ρ24 = 0.862 v24 = 1.16
kg 3 kg
m

Balances:

F1⋅ h1 + Qcal F2⋅ h2 Para el intercambiador 1

F2⋅ h2 + Fw⋅ hw F3⋅ h3 Para el humidificador

F3⋅ h3 − Qenf F4⋅ h4 Para el Fermentador

Con el calor metabólico (Qmet) calculado y los balances obtenemos:

J
Qmet := 4418.156
s

Para el fermentador:

F3⋅ h3 + Qmet F4⋅ h4

Como el flujo másico de aire es igual en todos los puntos:

Qmet
F2( Qmet) :=
h24 − h23

El flujo de aire seco necesario es:

kg
F2( Qmet) = 76.72
min

K
 3
F2( Qmet) m
Fh21( Qmet) := Fh21( Qmet) = 1.386
ρ21 s

3
3 ft F2( Qmet)
Fh21( Qmet) = 2.936 × 10 Fh22( Qmet) :=
min ρ22
3 3
m 3 ft
Fh22( Qmet) = 1.641 Fh22( Qmet) = 3.478 × 10
s min
3
F2( Qmet) m
Fh23( Qmet) := Fh23( Qmet) = 1.473
ρ23 s

3
3 ft F2( Qmet)
Fh23( Qmet) = 3.12 × 10 Fh24( Qmet) :=
min ρ24
3 3
m 3 ft
Fh24( Qmet) = 1.484 Fh24( Qmet) = 3.144 × 10
s min

Servicios

Intercambiador de calor 1 (calentamiento)

F1⋅ h1 + Qcal F1⋅ h2

Qcal2( Qmet) := F2( Qmet) ⋅ ( h22 − h21)

El calor a retirar es:

Qcal2 ( Qmet ) = 75.437 kW

Por lo que empleando agua como fluido de servicio tenemos

Qcal w ⋅ cp ⋅ ∆ T

si las condiciones de entrada y salida de nuestro fluido de servicio son

kg
Tentrada := T( 121) Tsalida := T( 90) ρV := 0.842
3
m

L
Tenemos el flujo de vapor de agua necesario para calentar:

Qcal2( Qmet)
vw2( Qmet) :=
cp ⋅ ( Tentrada − Tsalida ) ⋅ ρV
3
3m
vw2( Qmet) = 2.49 × 10
hr

Para el humidificador
F2 ⋅ h2 + Fw ⋅ hw F3 ⋅ h3

F2( Qmet) ⋅ ( h23 − h22)

Fw2( Qmet) :=
hw⋅ ρw

El flujo de agua es:

L
Fw2( Qmet) = 24.599
hr

Balance de materia Sistema 3

De acuerdo con la tabla psicrométrica y la trayectoria:

M
Tenemos:

F1 F2 F3 F4 F5

f31 := 17 f32 := 1 f33 := 70 f34 := 100 f35 := 90 Humedad

C31 := 20 C32 := 75 C33 := 32 C34 := 26 C35 := 28 Temperatura °C

Obtenemos:

Entalpías Volumen Húmedo Densidades

1
h31 := h( C31, f31) v31 := vH( C31, f31) ρ31 :=
v31
1
h32 := h( C32, f32) v32 := vH( C32, f32) ρ32 :=
v32
1
h33 := h( C33, f33) v33 := vH( C33, f33) ρ33 :=
v33
1
h34 := h( C34, f34) v34 := vH( C34, f34) ρ34 :=
v34
1
h35 := h( C35, f35) v35 := vH( C35, f35) ρ35 :=
v35
3
kJ m kg
h31 = 28.781 v31 = 1.084 ρ31 = 0.923
kg kg 3
m
3
kJ m kg
h32 = 92.345 v32 = 1.293 ρ32 = 0.773
kg kg 3
m
3
kJ kg m
h33 = 107.946 ρ33 = 0.851 v33 = 1.175
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h34 = 100.892 ρ34 = 0.868 v34 = 1.152
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h35 = 104.347 ρ35 = 0.862 v35 = 1.16
kg 3 kg
m

N
Balances:

F1⋅ h1 + Qcal F2⋅ h2 Para el intercambiador 1

F2⋅ h2 + Fw⋅ hw F3⋅ h3 Para el humidificador

F3⋅ h3 − Qenf F4⋅ h4 Para el intercambiador 2

F4⋅ h4 + Qmet F5⋅ h5 Para el Fermentador

Con el calor metabólico (Qmet) calculado y los balances obtenemos:

J
Qmet := 4418.156
s

Para el fermentador:

F4⋅ h4 + Qmet F5⋅ h5

Como el flujo masico de aire es igual en todos los puntos:

Qmet
F3( Qmet) :=
h35 − h34
El flujo de aire seco necesario es:

kg
F3( Qmet) = 76.72
min

3 3
m 3 ft
Fh31( Qmet) = 1.386 Fh31( Qmet) = 2.936 × 10
F3( Qmet) s min
Fh31( Qmet) :=
ρ31
3 3
m 3 ft
Fh32( Qmet) = 1.653 Fh32( Qmet) = 3.503 × 10
F3( Qmet) s min
Fh32( Qmet) :=
ρ32

3 3
m 3 ft
Fh33( Qmet) = 1.503 Fh33( Qmet) = 3.184 × 10
F3( Qmet) s min
Fh33( Qmet) :=
ρ33

O
 3 3
m 3 ft
Fh34( Qmet) = 1.473 Fh34( Qmet) = 3.12 × 10
F3( Qmet) s min
Fh34( Qmet) :=
ρ34

3
m
Fh35( Qmet) = 1.484 3
F3( Qmet) s 3 ft
Fh35( Qmet) := Fh35( Qmet) = 3.144 × 10
ρ35 min

Servicios

Intercambiador de calor 2 (Enfriamiento) Intercambiador de calor 1 (Calentamiento)

F3⋅ h3 − Qenf F4⋅ h4 F1⋅ h1 + Qcal F2⋅ h2

Qenf3( Qmet) := F3( Qmet) ⋅ ( h33 − h34) Qcal3( Qmet) := F3( Qmet) ⋅ ( h32 − h31)

El calor a retirar es: El calor necesario es:

3
Qcal3 ( Qmet ) = 81.276 kW Qenf3( Qmet) = 9.02 × 10 W

Por lo que empleando agua Por lo que empleando vapor de agua

como fluido de servicio tenemos como fluido de servicio
tenemos

Qenf w ⋅ cp ⋅ ∆ T Qcal w ⋅ cp ⋅ ∆ T

si las condiciones de entrada y salida de nuestro fluido de servicio son:

Tentrada := T( 20) Tvap_entrada := T( 121)

Tsalida := T( 24) Tvap_salida := T( 90)

Tenemos el flujo de agua Tenemos el flujo de vapor de agua necesario

necesario para enfriar para calentar:

P
 −Qenf3( Qmet)
w3( Qmet) :=
cp ⋅ ( Tentrada − Tsalida ) ⋅ ρw
Qcal3( Qmet)
vw3( Qmet) :=
cp ⋅ ( Tvap_entrada − Tvap_salida ) ⋅ ρw

3 3
m m
w3( Qmet) = 1.94 vw3( Qmet) = 2.255
hr hr

Para el humidificador

F2 ⋅ h2 + Fw ⋅ hw F3 ⋅ h3

F3( Qmet) ⋅ ( h33 − h32)

Fw3( Qmet) :=
hw⋅ ρw

El flujo de agua es:

L
Fw3( Qmet) = 29.264
hr

Balance de materia Sistema 4

De acuerdo con la tabla psicrométrica y la trayectoria:

Q
Tenemos:
FA F1 F2 F3
fA := 17 f1 := 40 f2 := 4 f3 := 70 Humedad
CA := 20 C1 := 23 C2 := 65 C3 := 32 Temperatura ºC

F4 F5 F6
f4 := 100 f5 := 90 f6 := f5 Humedad
C4 := 26 C5 := 28 C6 := C5 Temperatura ºC

Obtenemos:

Entalpías Volumen Húmedo Densidades

1
h4A := h( C4A, f4A) v4A := vH( C4A, f4A) ρ4A :=
v4A
1
h41 := h( C41, f41) v41 := vH( C41, f41) ρ41 :=
v41
1
h42 := h( C42, f42) v42 := vH( C42, f42) ρ42 :=
v42
1
h43 := h( C43, f43) v43 := vH( C43, f43) ρ43 :=
v43
1
h44 := h( C44, f44) v44 := vH( C44, f44) ρ44 :=
v44
1
h45 := h( C45, f45) v45 := vH( C45, f45) ρ45 :=
v45
1
h46 := h( C46, f46) v46 := vH( C46, f46) ρ46 :=
v46

3
kJ m kg
h4A = 28.781 v4A = 1.084 ρ 4A = 0.923
kg kg 3
m

R
 3
kJ m kg
h41 = 47.868 v41 = 1.106 ρ 41 = 0.904
kg kg 3
m
3
kJ m kg
h42 = 97.695 v42 = 1.268 ρ 42 = 0.789
kg kg 3
m
3
kJ kg m
h43 = 107.946 ρ 43 = 0.851 v43 = 1.175
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h44 = 100.892 ρ 44 = 0.868 v44 = 1.152
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h45 = 104.347 ρ 45 = 0.862 v45 = 1.16
kg 3 kg
m
3
kJ kg m
h46 = 104.347 ρ 46 = 0.862 v46 = 1.16
kg 3 kg
m

Balances:

FA⋅ hA + x⋅ F5⋅ h5 F1⋅ h1 % de Reflujo

F1⋅ h1 + Qcal F2⋅ h2 Intercambiador de calor 1 (Calentamiento)

F2⋅ h2 + Fw⋅ hw F3⋅ h3 Humidificado

F3⋅ h3 − Qenf F4⋅ h4 Intercambiador de calor 2 (Enfriamiento)

F4⋅ h4 + Qmet F5⋅ h5 Fermentador

Con el calor metabólico (Qmet) calculado y los balances obtenemos:

J
Qmet := 4418.156
s

Para el fermentador:

S
 F4⋅ h4 + Qmet F5⋅ h5

Como el flujo másico de aire es igual en todos los puntos:

Qmet
F4( Qmet) :=
h45 − h44

El flujo de aire seco necesario es:

kg
F4( Qmet) = 76.72
min

Por lo que el flujo volumétrico en cada punto de balance es:

3 3
F4( Qmet) m 3 ft
Fh41( Qmet) := Fh41( Qmet) = 1.414 Fh41( Qmet) = 2.996 × 10
ρ41 s min

3 3
F4( Qmet) m 3 ft
Fh42( Qmet) := Fh42( Qmet) = 1.621 Fh42( Qmet) = 3.435 × 10
ρ42 s min

3 3
F4( Qmet) m 3 ft
Fh43( Qmet) := Fh43( Qmet) = 1.503 Fh43( Qmet) = 3.184 × 10
ρ43 s min

3 3
F4( Qmet) m 3 ft
Fh44( Qmet) := Fh44( Qmet) = 1.473 Fh44( Qmet) = 3.12 × 10
ρ44 s min

3 3
F4( Qmet) m 3 ft
Fh45( Qmet) := Fh45( Qmet) = 1.484 Fh45( Qmet) = 3.144 × 10
ρ45 s min
3
m
Fh46( Qmet) := xr⋅ Fh45( Qmet) Fh46( Qmet) = 0.7418
s
3
3 ft
Fh46( Qmet) = 1.572 × 10
min
3 3
m 3 ft
Fh4A( Qmet) := Fh41( Qmet) − Fh46( Qmet) Fh4A( Qmet) = 0.672 Fh4A ( Qmet) = 1.424 × 10
s min

Servicios

Intercambiador de calor 2 (Enfriamiento) Intercambiador de calor 1 (Calentamiento)

F3⋅ h3 − Qenf F4⋅ h4 F1⋅ h1 + Qcal F2⋅ h2

Qenf4( Qmet) := F4( Qmet) ⋅ ( h43 − h44) Qcal4( Qmet) := F4( Qmet) ⋅ ( h42 − h41)

T
 El calor a retirar es: El calor necesario es:
3
Qenf4( Qmet) = 9.02 × 10 W Qcal4 ( Qmet ) = 63.711 kW

Por lo que empleando agua Por lo que empleando vapor de agua

como fluido de servicio tenemos: como fluido de servicio tenemos:

Qenf w ⋅ cp ⋅ ∆ T Qcal w ⋅ cp ⋅ ∆ T

si las condiciones de entrada y salida de nuestro fluido de servicio son:

Tentrada := T( 20) Tvap_entrada := T( 121)

Tsalida := T( 24) Tvap_salida := T( 90)
kg
ρ V := 0.842
3
m

Tenemos el flujo de agua necesario Tenemos el flujo de vapor de agua

para enfriar: necesario para calentar:

−Qenf4( Qmet)
w4( Qmet) :=
cp ⋅ ( Tentrada − Tsalida ) ⋅ ρw
Qcal4( Qmet)
vw4( Qmet) :=
cp ⋅ ( Tvap_entrada − Tvap_salida ) ⋅ ρV
3 3
m 3m
w4( Qmet) = 1.94 vw4( Qmet) = 2.1 × 10
hr hr

Para el humidificador:
F2 ⋅ h2 + Fw ⋅ hw F3 ⋅ h3

F4( Qmet) ⋅ ( h43 − h42)

Fw4( Qmet) :=
hw⋅ ρw

El flujo de agua es:

L
Fw4( Qmet) = 19.229
hr

Anexo 3: Determinación de VTO y VCO

U
Datos:
Dimensiones

Charolas Tanque

No := 6 Charolas Dt := 76cm Diámetro

h := 5cm Altura ht := 70 cm Altura

an := 30 cm Ancho
l := 46 cm Largo

Ac := l⋅ h⋅ No Área de las charolas

At := Dt⋅ ht Área del tanque
Avto := At − Ac Área transversal

Flujo volumétrico
3
m
Fh44 ( Qmet ) = 1.473
s

Propiedades del Aire

2
cm
D := 0.2 Coeficiente de difusión para oxígeno
s
kg
ρ := 0.868 Densidad del aire
3
m

− 5 kg
µa := 1.846⋅ 10 Viscosidad del aire
s⋅m

µa
υ := Viscosidad cinemática del aire
ρ
Flujo
υ 0( Flujo) := Velocidad del aire
Avto

l⋅ υ 0
( )
Re υ 0 :=
υ Numero de Reynolds
υ
Sc :=
D Numero de Schmidt

Con la correlación:

V
 1 1
2
kL ⎛ l⋅ υ 0 ⎞ ⎛ υ ⎞ 3
0.646⋅ ⎜ ⋅⎜
D ⎝ υ ⎠ ⎝ D⎠

Tenemos:
1 1
2 3 D
k ( Re ) := 0.646 ⋅ Re ⋅ Sc ⋅
l

Con el área de transferencia

a := l⋅ an⋅ No
Tenemos:

ka( k) := k⋅ a

Para calcular el VTO consideramos:

kg
Cx := 0 C := 0.21⋅ ρ
3
m

C se calculó de acuerdo a la cantidad de agua en el aire húmedo

VTO( ka) := ka⋅ ( C − Cx)

gm
VCO( O2) := O2⋅ X⋅ 32
mol

Velocidad de Transferencia de oxígeno (VTO)

( (( ( )))) = 4.429 hr
kg
VTO ka k Re υ 0( Fh44( Qmet) )

Velocidad de consumo de oxígeno (VCO)

W
 VCO( DO( µ ) ) = 1.106
kg
hr

0.002

( (( (
VTO ka k Re υ 0( Fh44 ( Qmett ) ) ) ) ) )0.001

0
0 2000 4000 6000
Qmett

X
 Anexo 4: Determinación del espesor del biorreactor

Para la estimación de los criterios de operación nos fundamentamos en las

esterilización ya que esta nos de los parámetros de operación como la temperatura de
esterilización y la presión de esterilización.

Top := 121 ºC Temperatura de operación

Pop := 1 atm Presión de operación
ºC ≡ K

Datos de Diseño

Para los criterios de diseño se recomiendo que la temperatura se un 10 % mayor que

la temperatura de operación.

Td := 1.1Top Td = 133.1 ºC Temperatura de

diseño

Pd := 2atm Presión de diseño alcanzado

en un autoclave a 134 ºC

Variables a considerar para el cálculo de los espesores

co := 2 ⋅ mm Corrosion

Td = 133.1 ºC Temperatura de diseño

Pd = 2 atm Presión de diseño

f Esfuerzo del metales

Dt := 76 ⋅ cm Diámetro del tanque

Y
 ⎛⎜ 105 ⎞
Acero 304
f :=
⎜ 110 ⎟⋅ N
⎜ 130 ⎟ mm 2 Acero 316 # especificación
⎜
⎝ 85 ⎠ Acero 321
Acero al carbón

Pi := Pd Rc := Dt Rk es 7% > que Rc Rk := Rc ⋅ 0.07

Rc
3+
Rk
Cs :=
4

5
Pi = 2.03 × 10 Pa Dt = 0.76 m Cs = 1.695

i) Espesor en el casco cilíndrico

Pi ⋅ Dt
c ( f) :=
2 ⋅ f − Pi

⎛⎜ 0.734 ⎞ Acero 316

c ( f) =
⎜ 0.701 ⎟ mm Acero 304
⎜ 0.593 ⎟ Acero 321 Espesores Calculados
⎜
⎝ 0.907 ⎠ Acero al carbón

ii) Espesor en la cabeza bridada (tapa torisférica)

Pi ⋅ Rc ⋅ Cs
t ( f) :=
2 ⋅ f + ( Cs − 0.2) ⋅ Pi

⎛⎜ 1.241 ⎞ Acero 304

t ( f) =
⎜ 1.185 ⎟ mm Acero 316 Espesores Calculados
⎜ 1.003 ⎟
⎜ Acero 321
⎝ 1.533 ⎠
Acero al carbón

Z
ii) Espesor en la base (torisférica)

Pi ⋅ Rc ⋅ Cs
b ( f) :=
2 ⋅ f + ( Cs − 0.2) ⋅ Pi

⎛⎜ 1.241 ⎞ Acero 304

b ( f) =
⎜ 1.185 ⎟ mm Acero 316 Espesores Calculados
⎜ 1.003 ⎟ Acero 321
⎜
⎝ 1.533 ⎠ Acero al carbón

AA
 Anexo 5: Estimación de rendimientos para el sistema Aspergillus niger en
salvado de trigo

Con la reacción:

[CH1.98O0.63N0.26]+YO2/SO2----->YX/S[CH1.72O0.52N0.17]+YCO2/S+YA/SH2O

Tenemos la matríz:
S O X CO w

⎛ 1 0 1 1 0⎞
⎜
E1 := ⎜
1.98 0 1.72 0 2 ⎟
⎜ 0.63 2 0.52 2 1 ⎟
⎜ 0.26
⎝ 0 0.17 0 0 ⎠

Pesos moleculares:

( )
gm kg
PMS := 12⋅ E1 + 1⋅ E1 + 16⋅ E1 + 14⋅ E1 PMS = 0.028
0, 0 1, 0 2, 0 3 , 0 mol mol

( )
gm kg
PMO2 := 12⋅ E1 + 1⋅ E1 + 16⋅ E1 + 14⋅ E1 PMO2 = 0.032
0, 1 1, 1 2, 1 3 , 1 mol mol
gm kg
PMX := ⎡( 12⋅ E1)
3 , 2⎤
+ 1⋅ E1 + 16⋅ E1 + 14⋅ E1 PMX = 0.024
⎣ 0, 2 1, 2 2, 2 ⎦ mol mol

( )
gm kg
PMCO2 := 12⋅ E1 + 1⋅ E1 + 16⋅ E1 + 14⋅ E1 PMCO2 = 0.044
0, 3 1, 3 2, 3 3 , 3 mol mol

( )
gm kg
PMw := 12⋅ E1 + 1⋅ E1 + 16⋅ E1 + 14⋅ E1 PMw = 0.018
0, 4 1, 4 2, 4 3 , 4 mol mol

Como los rendimientos son en base al sustrato:

⎛ 1 ⎞
⎜
E1m:= ⎜
1.98 ⎟
η1m := −1
⎜ 0.63 ⎟
⎜ 0.26
⎝ ⎠

BB
Por lo que podemos calcular los demás rendimientos con:

O X CO2 w
⎛0 1 1 0⎞
⎜
E1c := ⎜
0 1.72 0 2 ⎟ −1
η1c := −E1c ⋅ E1m⋅ η1m
⎜2 0.52 2 1 ⎟
⎜0
⎝ 0.17 0 0 ⎠

⎛ 0.609 ⎞
⎜
η1c = ⎜
1.529 ⎟
⎜ −0.529 ⎟
⎜ −0.325
⎝ ⎠

De acuerdo a los resultados no se requiere oxidar el salvado para formar los productos

Cálculo de Calor metabólico máximo

− 1
µ := 0.3438 hr

J 1
ε := 460000 YO2X := X := 2.8 kg
mol YXO2

YO2X⋅ ε ⋅ X⋅ µ
Q( µ ) := Q( µ) = 4.418× 10 W
3
YO2X = 0.862
PMx

YO2X⋅ µ
DO( µ ) := DO( µ ) = 12.349 Q( µ ) := DO( µ ) ⋅ ε ⋅ X
mol
PMx kg⋅ hr

Qmet := Q ( µ ) Qmet = 4418.247W

CC
 Anexo 6: Lista de Símbolos

Lista de símbolos

Símbolo Descripción Valor Unidades

ρw Densidad del agua 1000 kg/m3

hw Entalpía del agua a 20°C 2454 kJ/kg
Cp Calor específico del agua 4.185 kJ/kg K
xr Porcentaje de recirculación 0.5 %
λ Calor latente del agua --- kJ/kg
Pvap Presión de vapor --- bar
H100 Porcentaje de saturación (kgagua/kgaire seco) --- kg/kg
H% Saturación relativa --- %
3
VH Volumen húmedo --- m /kg
cH Calor húmedo --- kJ/kg
hij Entalpía, i para el sistema y j para el punto de balance --- kJ/kg
X Biomasa máxima esperada (kgX) 3 Kg
PMX Peso molecular de la biomasa 0.027 kg/mol
PMS Peso molecular del salvado de trigo 0.032 kg/mol
µ Velocidad específica de crecimiento --- h-1
Qmet Calor metabólico --- W
Cij Temperatura, i para el sistema y j para el punto de --- °C
balance
fij Porcentaje de humedad, i para el sistema y j para el --- %
punto de balance
rij Densidad del aire húmedo, i para el sistema y j para el --- kg/m3
punto de balance
Fi Flujo másico de aire, i para el sistema --- kg/h
Fhij Flujo volumétrico, i para el sistema y j para el punto de --- m3/h
balance
Fwi Flujo de agua en humidificador, i para el sistema --- m3/h
h Altura de charolas 0.05 m
an Ancho de charola 0.3 m
l Largo de la charola 0.46 m

DD
 Lista de símbolos
Símbolo Descripción Valor Unidades
Descripción Valor Unidades m2
Dt Diámetro de la cámara 0.76 m
ht Altura de la cámara 0.7 m
D Coeficiente de difusión de oxígeno 0.2 cm2/s
ma Viscosidad del aire a 25°C 1.846*10-5 kg/m s
υ Viscosidad cinemática del aire 2.127*10-5 m2/s
Avto Área transversal de la cámara 0.394 m2
υ0 Velocidad del aire en la cámara --- m/s
a Área de transferencia 0.828 m2
k Coeficiente de transferencia de masa --- m/s
C Concentración de oxígeno en el aire a la entrada de la --- kg/m3
cámara
VTO Velocidad de transferencia de oxígeno --- kg/s
YO2/X Rendimiento de oxígeno respecto a la biomasa --- molO2/molX
kgO2/kgX
DO Demanda de oxígeno --- molO2/h kgX

EE