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Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas


2º Semestre de 2018

Aula 2: Purificação de Proteínas


(revisão) e Determinação de Estruturas
(difração de raio-X)
Prof. Marcos Túlio de Oliveira
marcos.t.oliveira@unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal


Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Trabalhando com Proteínas

• Compreensão sobre estrutura e função de


proteínas  proteínas individuais.

• Separadas de outras de forma pura


considerando suas propriedades.

• Proteína pura  essencial para que suas


propriedades e atividades sejam determinadas.
Análise de Proteínas

• Absorbância;

• Eletroforese em gel desnaturante;

• Western blot (imunoblot).


A280
• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade
dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda
específicos.
• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a
concentração de soluto em uma determinada solução ou
material biológico.
Métodos de Quantificação Proteica
Principais ensaios de quantificação de proteínas

Fonte:
http://www.labome.com.br/method/Protein-
Quantitation.html
Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)

• Eletroforese: separação com


base na migração de
proteínas carregadas em um
campo elétrico.

• Não é utilizado para


purificar proteínas porque
afetam sua estrutura e a
função.
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da
proteína.
Eletroforese de Proteínas
SDS-PAGE

• SDS (sodium dodecyl sulfate)

• 1 molécula de SDS para cada 2


resíduos de aminoácidos.

• Contribui com grande carga negativa.

• SDS desdobra parcialmente as


proteínas, assumindo forma
semelhantes.
Eletroforese de Proteínas

• Método analítico: útil tanto para separar quanto para


visualizar proteínas.

• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas


presentes em uma amostra ou o grau de pureza.

• Permite determinação da
massa molecular
aproximada.
Eletroforese de Proteínas
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.

• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
Western blot (imunoblot)
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína

Métodos clássicos Métodos modernos

Diferença de Clonagem de DNA,


propriedades das sequenciamento
proteínas: carga, genômico, proteínas
tamanho, ligantes. recombinantes, etc.
Trabalhando com Proteínas

• Proteína nova  precedentes estabelecidos e bom senso.

• Mais de um método de purificação utilizado.

• Escolha do método: empírico.

• Levar em consideração métodos descritos para proteínas


semelhantes.

• Iniciar com métodos de baixo custo.


Purificação Proteica: Fonte Proteica
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
Isolamento
• Extração 1. Material de Partida -----
Separação
- Extrato Bruto
2. Desintegração celular

Fracionamento

Diálise
•Solubilidade
Ultra filtração
•Tamanho
•Carga Coluna
Cromatografica
•Afinidade Ligação
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
Métodos Cromatográficos

Cromatografia em Coluna

• Poderoso método de fracionamento.

• Diferença de tamanho, carga, afinidade de


ligação e outros.

• Velocidade da migração depende da


propriedade da proteína.
Lehninger, 6ª ed. 2010
Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:

o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);

o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;

o Afinidade;

o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).


0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN

C+ Ind S FT W1

Blue-Sepharose

Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4


1 2 3 4
S FT W1 W2

Fosfocelulose
Coloração com Prata Western Blot

Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646

©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology


Proteínas Recombinantes
Cromatografia de Afinidade
Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot

Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Sistemas de Expressão
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.


Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.


Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.


ou

6 códons para His (CAT ou CAC)


Inclusão dos códons de His
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática – Vetor de
Expressão para Células Humanas
Tags de Fusão de Proteína Comuns
Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:

1 - Abundância

2 - Especificidade pela Coluna


Cromatográfica
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante

Quilos de ovos de D. Coluna de DNA- Expressão em Sf9


melanogaster celulose
Extrato Celular
Extrato Celular Coluna de Octil-
sefarose Coluna de
Centrifugação Fosfocelulose
diferencial Coluna de Blue-
agarose Precipitação com
Coluna de (NH4)2SO4
Fosfocelulose Sedimentação em
Gradiente de Glicerol Coluna de Ni-NTA
Precipitação com
(NH4)2SO4 Sedimentação em
Gradiente de Glicerol
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster

Nativa vs
Recombinante
Determinação da Estrutura
Tridimensional de Proteínas por
Difração de Raios-X
Níveis estruturais das proteínas

Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.


Estrutura proteica

• A conformação tridimensional (3D) depende da


sequência de aminoácidos

• A função depende da estrutura

• Cada proteína existe em um ou em pequeno número


de formas estruturalmente estáveis

• As principais forças para a estabilização de estruturas


são forças não-covalentes
Estrutura tridimensional

• Arranjo espacial de todos os átomos de uma


proteína  conformação

• As conformações possíveis de uma proteína


incluem qualquer estado estrutural que ela
possa assumir sem a quebra das ligações
covalentes.

• Porém, poucas são as conformações nativas.

• Algumas proteínas são formadas por mais de


um complexo polipeptídico (quaternária)
Determinação da estrutura
tridimensional proteica

• O primeiro passo para o estudo sobre as


propriedades de um composto orgânico
é a determinação de suas estruturas
cristalinas.

• Diversas propriedades estão


intimamente ligadas à maneira como os
átomos estão dispostos pela molécula.
Mas...o que são cristais?

• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja


estrutura se repete numa forma periódica
tridimensional.

• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de


Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de
sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e
vice-versa.
Sólidos cristalinos
• Formas regulares e simétricas assim
como a ordenação das partículas que os
formam.
Como observar os cristais?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível através
da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz
visível.
Como observar os cristais?
• Para resolver objetos tão pequenos
quanto proteínas, precisamos usar raios
X, que possuem comprimentos de onda
na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
Cristalografia de raios-x

• Uma das técnicas mais conhecidas para


a determinação dos padrões de uma
estrutura é cristalografia por difração de
raios-X.
• O primeiro passo é obter proteína com
alto grau de pureza!!!
• Segundo, obter cristais!!!
Cristalografia de raios-x
Cristalografia de raios-x

• Raio X incide no cristal, onde parte de


sua energia é absorvida e reemitida em
todas as direções (cada átomo se torna
uma fonte secundária de raios X);
Padrão de difração dos raios x

Fonte: Paula Kuser Falcão.


Cristalografia de raios-x

• Não há lentes que reagrupem os raios X


para formar a imagem.

• Ao invés disso, o padrão de difração dos


raios X é coletado diretamente e a
imagem é reconstruída por técnicas
matemáticas.
Cristalografia de raios-x

• A difração de raios-X
aplicada à análise de cristais
de macromoléculas
biológicas tem influenciado
a bioquímica estrutural,
tendo contribuído para o
conhecimento da estrutura
3D de proteínas, ácidos
nucleicos, vírus e outras
macromoléculas.
Padrão de difração dos raios x
Cristalografia de raios-x

• A quantidade de informação obtida em


uma cristalografia por raios X depende do
grau de organização estrutural da amostra.

• Informações da estrutura 3D detalhadas


precisam de cristais proteicos altamente
ordenados.

• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.


Cristalografia de raios-x

• O ambiente físico em um cristal não é


idêntico ao em solução ou na célula viva.

• Poucas informações são fornecidas em


termos de movimentos moleculares no
interior da proteína.
A partir da cristalografia de raios-x, é
possível...

• Compreender melhor os princípios


básicos da arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros
catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das
reações que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre
sequencia primária, estrutura e função.
ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA
ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS
Exemplo de proteínas cristalizadas

Fonte: Paula Kuser Falcão.


Oliveira et al. 2015. Genome Biol Evol.
Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

2º Semestre de 2018

Próxima aula 21/08: Prática – Entendendo Cristalografia


e Visualizando Estruturas Proteicas

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