Práctica de Cromatografía

Objetivos:
Ÿ Entender el concepto de cromatografía aplicado a la diferenciación de pigmentos
fotosintéticos de un vegetal.
Ÿ Diferenciar los diferentes pigmentos de un vegetal que intervienen en la
fotosíntesis, mediante su separación por cromatografía.

Conceptos básicos:
- Cromatografía: Técnica, frecuentemente utilizada en química y biología, de separación de
una mezcla compleja de solutos, basándose en la diferente velocidad con que se mueve cada uno
de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento.

- Fotosíntesis: Proceso anabólico (ruta anabólica) por excelencia mediante el cual los
organismos convierten la energía luminosa en energía química estable necesaria para fabricar
sustancias orgánicas a partir de moléculas inorgánicas. Dependiendo de quien sea el dador de
electrones que alimenta la cadena transportadora de electrones haciendo posible la formación de
ATP y poder reductor, los procesos fotosintéticos se dividen en oxigénicos, en los cuales el dador
de electrones es el agua desprendiéndose en el proceso oxígeno, y anoxigénicos en los cuales el
dador de electrones no es el agua sino el sulfuro de hidrógeno, y por tanto no se desprende
oxígeno sino azufre.

- Pigmentos fotosintéticos: moléculas especiales necesarias para que se lleve acabo la

fotosíntesis ya que están encargadas de captar la energía luminosa. Los pigmentos fotosintéticos
son lípidos que se encuentran unidos a proteínas transmembrana presentes en algunas
membranas plasmáticas de células vegetales formando los llamados fotosistemas.
Existen dos tipos de pigmentos en los fotosistemas: los pigmentos de antena o accesorios, que
sólo pueden captar energía luminosa y transmitir la energía captada a otro tipo de pigmentos, y
los pigmentos diana o centrales a los cuales va a parar toda la energía captada por los pigmentos
anteriores. Éstos pigmentos son capaces de transferir el electrón excitado al primer aceptor de
electrones y de reponerlo a partir del primer dador de electrones, es decir son capaces de
excitarse e ionizarse.
Los pigmentos fotosintéticos intervienen en la etapa luminosa de la fotosíntesis y la hacen
posible captando todas las franjas del espectro electromagnético visible (radiaciones el violeta al
rojo).

- Tipos de pigmentos presentes en un vegetal:

Ÿ Carotenoides: Son lípidos isoprenoides que absorben una luz de 440 nm y a su
vez se diferencian en carotenos de un color rojizo y xantofilas de un color
amarillento.
Ÿ Clorofilas: Son lípidos de color verdoso que a su vez se dividen en clorofila α,
de color verde limón y que absorben luz de 683 nm y clorofila β, de un color
verde-azulado y que absorben luz e 660 nm.
- Etapa luminosa: Primera fase de la fotosíntesis oxigénica que tiene como objetivo la
obtención de poder energético y reductor para poder llevar a cabo la etapa oscura y completar así
la fotosíntesis.
Para que se pueda llevar a cabo es necesario la presencia de fotosistemas (el fotosistema II que
presenta clorofila P680 y el fotosistema I con clorofila P700 ), complejos ATP-sintetasas y
cadenas transportadoras de electrones.
Cuando un pigmento accesorio capta el fotón, se excita y un electrón sube a una órbita más
alejada del núcleo atómico. Al bajar de nuevo el electrón, se desprende calor y energía en forma
de radiación, que excitará al pigmento vecino llegando así hasta el pigmento central
(fotosensibilización dinámica).
Tras ésto existen cadenas transportadoras de electrones en las cuales los electrones circularan
debido a que los complejos se encuentran ordenados de potencial redox más negativo a potencial
redox más positivo. El proceso se inicia con la llegada de fotones a la clorofila P680, el
fotosistema II se ioniza y cede su electrón al primer aceptor de electrones, la feofitina (Pheo). Para
reponer los electrones de la clorofila P680 se produce la fotólisis del agua. Los dos electrones que
se libera por cada molécula de agua son transferidos a la plastoquinona (PQ) que al recibirlos
capta dos protones del estroma. La PQ transfiere sus electrones al citocromo b-f que a su vez
introduce los dos protones en el tilacoide, que sumados a los dos protones producidos por la
fotólisis el agua activan las ATP-sintetizas llevando a cabo la fotofosforilación del ADP, formando
ATP.
A continuación inciden los fotones sobre la clorofila P700 del fotosistema I, ésta se ioniza y cede
dos electrones a la ferredoxina (Fd). Los electrones son repuestos por la plastocianina (PC) que
los recibe del complejo citocromo b-f. La Fd pasa los dos electrones a la enzima NADP+-
reductasa, que se activa, capta dos protones del estroma y se los transfiere, junto con los dos
electrones, al NADP+ que se reduce. Esto se llama fotorreducción del NADP+.

Así concluye la etapa luminosa acíclica que será completada con una etapa luminosa cíclica,
donde no hay ni fotólisis del agua, ni reducción del NADP+, ni se desprende oxígeno;
únicamente produce poder energético para subsanar el déficit de ATP obtenido anteriormente y
poder realizar la etapa oscura.
Materiales:
Ÿ Hojas verdes de un vegetal.
Ÿ Mortero.
Ÿ Tubo de ensayo.
Ÿ Vaso de precipitados.
Ÿ Filtro o colador.
Ÿ Papel de filtro o papel para cromatografía (Whatmann).
Ÿ CaCO3
Ÿ Etanol (96%).
Ÿ Acetona.

Procedimiento:
Ÿ Se cogen hojas verdes de cualquier vegetal y se cortan en trozos muy pequeños.
Ÿ En un vaso preparamos una disolución de 50 cm3 de etanol (96%) y una pizca de
CaCO3, para evitar la degradación de los pigmentos, y la vertemos en un mortero
junto con los trozos de la hoja. De esta manera trituramos bien hasta que el
disolvente quede del mismo color que la hoja para extraer los pigmentos presentes en
la hoja.
Ÿ Una vez triturado, filtramos con un colador la masa resultante y colocamos la
disolución en un tubo de ensayo.
Ÿ Cogemos papel de filtro o papel para cromatografía y cortamos una tira de unos
15 cm de largo con la forma siguiente:
 Lugar hasta donde llega el disolvente Lugar donde comienza la cromatografía

El papel de filtro está formado por numerosas fibras de celulosa (polímero de

glucosa con gran cantidad de grupos hidroxilo (-OH) y una microestructura muy
complicada) que aportan un cierto porcentaje de humedad. Las partes individuales de
cada fibra, junto con su humedad asociada, constituyen hipotéticas “células”
elementales. La separación se lleva a cabo al repartirse las sustancias entre la humedad
de las células y el flujo de disolvente sobre ellas, de tal manera que el agua de las
células permanece estacionaria mientras que el disolvente circula sobre ellas.
En la parte señalada como origen de la cromatografía, colocamos un poco de acetona
(CH3-CO-CH3) que actuará como disolvente polar dejando sin disolver a los
pigmentos ya que son compuestos lipídicos insolubles en este tipo de disolventes.

Ÿ Introducimos la tira de papel en el tubo de ensayo suspendiéndola mediante algún

artificio colocado en la parte superior del tubo de ensayo. Esperamos unos 20
minutos (en nuestro caso lo dejamos 2 días) para que el papel de filtro se vaya
empapando con el disolvente y vaya absorbiendo la disolución. Colocamos el
experimento en un lugar oscuro.
Con esta técnica ascendente, considerando que la atmósfera se encuentra saturada con
el vapor del disolvente , el disolvente sólo puede ascender hasta el extremo superior
del papel, cesando en ese momento el flujo del líquido, así los pigmentos
permanecerán sobre el papel y la distancia del disolvente es fija.

Resultado:

Cuando retiramos el papel del tubo de ensayo observamos una franja coloreada en la parte
superior de la tira que presenta diferentes tonos de color, diferenciando así los siguientes
pigmentos: clorofila α (verde limón), clorofila β ( verde azulado) y xantofila (amarillo).

Ésto se debe a la estructura química de los pigmentos fotosintéticos, ya que al tratarse de

compuestos lipídicos y ser apolares son insolubles en acetona, por tanto permanecen junto a ella
en su ascenso por el papel de filtro. Los pigmentos se presentarán ordenados debido a la
velocidad de difusión de cada pigmento formando una franja en la cual podemos distinguir los
distintos colores de los pigmentos al encontrarse separados.