Taller 1 Genética.

Departamento de Biología Celular e Histología

1° Unidad Académica, FMED, UBA.

TALLER 1GENÉTICA

GENOMA HUMANO Y
TÉCNICASDE BIOLOGÍA
MOLECULAR

2018

1
 Taller 1 Genética.
Departamento de Biología Celular e Histología
1° Unidad Académica, FMED, UBA.

Taller 1:

Los objetivos de este taller son: conceptualizar el término gen, caracterizar tipos de secuencias del
genoma humano, aplicar distintas técnicas de biología moleculares según su alcance e interpretar la
información que surge de ellas.

La resolución de los siguientes ejercicios se basa en contenidos de los seminarios de integración de

genética 1 y 2. Se recomienda estudiar las características del genoma humano y los fundamentos de las
técnicas de Secuenciación (Enzimática de Sanger; Sanger Automatizada; Masiva-de alto rendimiento),
Southern blot, Enzimas de Restricción, electroforesis de ADN, PCR alelo específica, PCR RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms).

Ejercicio 1:
1.1 Identifique ejemplos de secuencias de ADN nuclear humano de copia única o de bajo número
de copias; secuencias de ADN moderadas o altamente repetitivas (en tándem y dispersas)
1.2 ¿Qué eventos pueden explicar la aparición de secuencias repetitivas dispersas en el genoma
humano?
1.3 ¿Qué eventos pueden asociarse a la aparición de pseudogenes? ¿qué implicancia podría tener
un evento de recombinación entre un gen y su correspondiente pseudogen?
1.4 ¿A qué se denomina gen? Mencione las principales características de las secuencias que son
consideradas génicas. ¿En toda secuencia considerada génica puede establecerse una relación
directa (1:1:1) entre una secuencia de ADN, un ARN y un polipéptido? Justifique.
1.5 A continuación le mostramos ejemplos de secuencias consideradas génicas, analice si las
mismas cumplen con la definición de gen que usted describió en el punto anterior.

Ejemplo A:
Gen DMD (locus Xp21.2) de 2.4MB
La secuencia de referencia la puede encontrar en
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_012232.1?report=fasta&from=5001&to=2225382
Contiene 79 exones y 8 promotores (que participan en la regulación de la expresión tejido específica)
Codifica para la proteína Distrofina

Ejemplo B: Gen Xist y el gen Tsix (locus Xq13.2). Nota: observe la orientación de los promotores de ambos
genes y la superposición espacial dentro de la secuencia de ADN (Tsix es el antisentido de Xist).
Xist contiene 8 exones y codifica para un long non protein coding RNA
Tsix
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Ejercicio 2
A excepción de los gemelos monocigóticos, el material genético de cada individuo es único. Se ha _

estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en 1 cada 500
nucleótidos. Esa variabilidad interindividual puede ser estudiada a nivel genotípico mediante el análisis
directo del ADN.
Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad de ADN es su aplicación en pruebas de filiación
(paternidad, otras relaciones filiales como abuelidad), o en la identificación de muestras pertenecientes a
un individuo humano específico (hechos delictivos, medicina forense).Para ello se ha utilizado un
subgrupo de secuencias repetitivas en tándem (STR: short tándem repeat; microsatélites)

En la siguiente tabla se observa ejemplos de STR utilizados en estudios de paternidad

Nombre del STR Cromosoma Rango de n repeticiones
TPOX 2 6-13
D2S1338 2 11-28
D3S1358 3 9-20
FGA 4 15-51
CSF1PO 5 6-16
D5S818 5 7-16
D7S820 7 6-15
D8S1179 8 8-19
TH01 11 3-14
VWA 12 10-24
D13S317 13 5-15
PENTA E 15 5-26
D16S539 16 5-15
D18S51 18 7-27
D19S433 19 5-20
D21S11 21 24-38
PENTA D 21 2-18

M 1 2

La calle M corresponde a un marcador que

contiene los posibles fragmentos de cada STR
Las calles 1 y 2 a muestras a analizar

2.1. Indique qué características presentan los microsatélites que permiten que sean utilizados para este
tipo de estudios.

Nota: Para estimar el grado de certeza con que se asigna la paternidad es necesario contrastar la
probabilidad de que los alelos presentes en el hijo provengan del presunto padre versus la probabilidad
que los haya recibido de cualquier otro individuo en la población. De acuerdo a eso, se calcula la razón
entre ambas probabilidades, denominada índice de paternidad (IP). Si al comparar los perfiles del hijo/a
con los del presunto padre hay dos o más STR en que los que no se observan alelos que tengan el
mismo número de repeticiones, se excluye la paternidad sin necesidad de realizar un cálculo
probabilístico.
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2.2 Observe la siguiente tabla perteneciente a un caso en que se quiere establecer una relación de
paternidad entre un niño y un presunto padre A (p-padre A), versus presunto padre B (p-padre B). ¿Qué
conclusiones obtiene? ¿Alguno de los dos es el padre biológico del niño? Justifique.
Nombre del Alelos de Alelos Alelos del Alelos del
STR la madre del hijo p-padre A p-padre B
TPOX 8 8 8 8 8 11 8 11
D2S1338 19 19 19 20 20 22 21 22
D3S1358 15 15 15 16 15 16 15 18
FGA 23 25 23 23 21 23 21 22
CSF1PO 11 12 11 12 12 12 6 16
D5S818 11 13 12 13 11 12 11 11
D7S820 10 11 11 12 12 12 12 12
D8S1179 11 13 11 15 13 15 11 13
TH01 9 9 6 9 6 7 7 8
VWA 16 17 17 18 15 18 15 16
D13S317 8 11 8 13 12 12 11 11
D16S539 11 14 11 14 11 13 12 12
D18S51 17 18 17 18 13 17 14 16
D19S433 13 15 15 15 15 15 13 14
D21S11 29 31 29 31 29 30 24 25

Ejercicio 3:
Un estudio sobre infertilidad masculina tiene como objetivo: asociar mutaciones del exón 3 del gen
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) cuyo locus es 7q31.2, con la presencia
de azoospermia. Se recolectan muestras de sangre de distintos individuos (un grupo con azoospermia:
grupo casos; y otro grupo con espermogramas normales: grupo controles) y se realiza extracciones de
ADN a partir de esas muestras; previa firma de consentimiento informado.
De cada muestra de ADN estudiada se obtiene un producto de amplificación por PCR de 309 pb
correspondientes al exón 3 del gen CFTR. Se busca en bases de datos la secuencia wild type del exón
3 y si tiene sitios de restricción conocidos para alguna enzima. Se encuentra que la enzima de
restricción HinfI corta en la secuencia wild type. Se realiza una digestión con enzima de restricción HinfI
y luego se hace la electroforesis en gel de agarosa para la observación de los productos de restricción.
Los productos de digestión esperados corresponden a bandas de 172, 105 y 32 pb en individuos con la
variante wild type homocigota para la secuencia estudiada.

3.1 Observe los resultados obtenidos de distintas muestras (calles 3, 4 y 5) e interprete los genotipos
posibles indicando si corresponden a homocigotas para la variante wild type; heterocigotas; homocigota
para una variante distinta a la wild type.

1 2 3 4 5
310pb
La calle 1: corresponde al ADN ladder o marcador de peso molecular
La calle 2: producto de la amplificación sin digerir
La calle 3: muestra de un individuo del grupo control
170pb La calle 4: muestra de un individuo del grupo de casos
La calle 5: muestra de un individuo del grupo control

20pb

3.2 Este grupo de investigación observó que el perfil de bandas de la calle 4 se presentó en el 80% de
los individuos del grupo de casos y sólo en el 1% de los individuos del grupo control. Por lo cual en una
segunda etapa se propusieron conocer la secuencia del exón 3 de los individuos del grupo de casos con
el perfil de bandas de la calle 4. Hubo una discusión dentro del grupo de investigadores sobre si
comenzar con una estrategia de secuenciación de alto rendimiento, versus una secuenciación de
Sanger automatizada. ¿Qué estrategia elegiría usted? Fundamente. ¿Qué estrategia utilizaría para el
20% restante del grupo de casos? Fundamente.
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3.3 Del resultado de la segunda etapa obtuvieron que los casos que correspondían al 80%; tenían todos
una sustitución (cambio en un nucleótido A por G en la misma posición del exón 3) respecto a la
secuencia Wild Type que anulaba un sitio de restricción de la enzima HinfI. Y por la frecuencia obtenida
de esta variante en homocigosis en los casos enviaron a publicar un artículo asociando esta variante a
la producción de azoospermia. Uno de los revisores del artículo le solicitó la frecuencia alélica en
población general masculina de esta variante antes de autorizar la publicación del estudio. ¿Qué
importancia tiene esta observación realizada?

3.4 Como los investigadores no tenían datos de frecuencia alélica en población general, se les ocurrió
utilizar 100 muestras de donantes masculinos de sangre de distintos hospitales, y realizar con cada una
de las muestras una estrategia de PCR alelo específica. El ensayo que diseñaron fue: cada muestra era
dividida en dos tubos que diferían en el primer forward; en el primer tubo se colocaba el primer forward
que aparea con la secuencia Wild type y en el segundo tubo el primer forward que aparea con la
variante de la sustitución. Se observaron 3 grandes patrones de productos de amplificación (patrón de
bandas en el gel), graficados a continuación. ¿Qué patrón podría corresponder a los individuos
homocigotas para la variante wild type, heterocigotas y homocigotas para la variante posiblemente
patogénica?
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2

3.5 De las 100 muestras analizadas sólo 4 individuos era heterocigotas, 94 fueron interpretados como
homocigotas para la variante wild type y 2 individuos fueron interpretados como homocigotas para la
variante posiblemente patogénica. Contentos con esta frecuencia baja del alelo posiblemente
patogénico en la muestra, volvieron a enviar el artículo para publicar. Esta vez otro revisor le solicitó
que: a) En los individuos interpretados como homocigotas, confirmaran el genotipo por secuenciación b)
Describieran el efecto podría tener esta sustitución en la transcripción del gen, en la traducción del
polipéptido y a nivel del epitelio de los conductillos eferentes. c) Y explicitaran si hay algún gen ortólogo
del CFTR en ratón y/o modelo animal sobre esta patología ¿Qué importancia tienen estas
observaciones realizadas?