Universidad Tecnológica Metropolitana

Departamento de Biotecnología

Bioquímica y fisiología microbiana

Laboratorio

1. MATERIALES QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

- Delantal blanco obligatorio para todos. Los alumnos deben ponerse su de

delantal
lantal antes de entrar al
laboratorio.
- Cuaderno para registrar las observaciones y resultados del práctico
- Lápiz marcador de vidrio (por mesón o grupo)

2. EVALUACION

- Controles de entrada:
Se realizarán en cada clase durante los 15 primeros minut
minutos.
os. Se evaluará el contenido teórico de la guía
que corresponde a la actividad práctica.

- Informes:
Los informes de laboratorio deben incluir:
• Portada con el Título del práctico, fecha del práctico, Sección, nombres del grupo que
elaboró el informe.
• Introducción:
troducción: breve, 1 página máximo. Debe incluir solo información básica acerca del tema
del práctico. Evitar el “copiar y pegar” textual
• Procedimientos: Técnicas y etapas principales, sin excesivos detalles. No es una copia de los
procedimientos de la gu guía.
ía. Se debe describir lo que se realizó en el práctico en tiempo
pasado.
• Resultados: todos los resultados obtenidos en el práctico. Los resultados deben ser descritos
con claridad Las tablas y gráficos deben ser brevemente explicados e incluir parámetros y
unidades.
• Discusión: discutir, comentar los resultados y el desarrollo del práctico
• Conclusiones: Incluir solo los resultados obtenidos en forma resumida
• Respuesta al cuestionario o pregunta de investigación cuando corresponda

Se deben entregar 2 semanass después de realizado el práctico correspondiente

Ponderación:
Controles de entrada 35 %
Informes 35 %
Prueba final 30 %

- La asistencia a los laboratorios es de 100%. Se ace

aceptará
ptará sólo una inasistencia debidamente
justificada. Una inasistencia superior será motivo de reprobación
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Laboratorio de Bioquímica y fisiología microbiana

Centrifugación

Introducción
La célula es la unidad estructural y fisiológica de todos los organismos y puede ser visualizada a
través de los microscopios ópticos y electrónicos. Estas células están compuestas de pequeños
organelos cuya estructura puede ser definida por microsco
microscopía.
pía. Sin embargo, para estudiar la
función de los organelos es necesario aislarlos en fracciones puras. Cada organelo tiene
características (tamaño, forma y densidad, por ejemplo) que lo hacen diferente de otros
organelos dentro de la misma célula. Si la ccélula
élula es rota por algún procedimiento suave, cada
uno de sus organelos puede ser separado posteriormente. El proceso de abrir las células es la
homogenización y el posterior aislamiento de los organelos es el fraccionamiento.
fraccionamiento El
aislamiento de los organelosos requiere el uso de técnicas físico
físico-químicas
químicas y éstas pueden consistir
en simples filtros, sedimentación por gravedad o precipitación diferencial, a ultracentrifugación
de organelos marcados por fluorescencia en gradientes de densidad.

Centrifugación
La técnica de centrifugación es un procedimiento poderoso y de aplicación general para separar
y analizar células, organelos, y macromoléculas biológicas. Una partícula moviéndose en un
círculo de radio r a una velocidad angular ω queda sujeta a una aceleración
ión o campo centrifugo
2
de magnitud ω r. La fuerza centrífuga sobre la partícula queda definida por la expresión

Fc = m(1-vρ) ω2r

(1-vρ) es el factor de flotación,, que toma en cuenta el hecho de que el fluido que es desplazado
por la partícula ejerce una fuerza
uerza opositora; v es el volumen de la partícula y ρ la densidad de la
solución. Además, el movimiento de la partícula encuentra la resistencia producida por la
viscosidad del medio, expresada en la fuerza de roce (Fr) , que viene dada por

Fr = fv donde f es el coeficiente de roce y v la velocidad de la partícula

En un campo centrífugo se alcanza un equilibrio en que la fuerza centrífuga se iguala a la fuerza

de roce: Fc = Fr

por lo tanto m(1-vρ) ω2r = fv

 Despejando v

v = m(1-vρ) ω2r/ f

Así, durante una centrifugación, una partícula o molécula se mueve con una velocidad
constante, la velocidad de sedimentación v

Se puede apreciar de esta expresión que la velocidad de sedimentación v depende

directamente de la masa de la partícula (m), el volumen de la partícula (v), la densidad de la
solución (ρ), el coeficiente de roce (f) y de la aceleración o campo centrifugo de magnitud ω2r
(es decir de la velocidad de rotación ω).

Las diferencias en el valor de v que tienen diferentes moléculas y partículas hacen de la

centrifugación una herramienta útil como método de separación.

Se ha definido también un parámetro de sedimentación que depende de las propiedades de la

partícula, pero que es independiente de la velocidad de centrifugación. Así, se define el
coeficiente de sedimentación (S) como la velocidad de la partícula dividida por la intensidad del
campo centrífugo:
S = v / ω2r

Este parámetro tiene unidades de segundos y los valores típicos para las moléculas son del
orden de 10-13 seg, por lo que esta cantidad se ha designado como 1 unidad Svedberg (1S = 10-13
seg). Por ejemplo, la hemoglobina tiene un coeficiente de sedimentación de 4x 10-13 seg, o 4S.
Las partículas y organelos celulares tienen valores de S mayores, y algunas se las identifica con
su valor (los ribosomas 70S y 80S). S aumenta con la masa de la partícula, pero la relación no es
lineal y solo se puede utilizar el valor de S como una medida estimativa del peso molecular.

Existen diversas tipos de centrifugación que se utilizan de acuerdo a lo que se desee separar,
empleando distintos rotores, velocidades, tiempos, y medios.

Centrifugación diferencial
La centrifugación diferencial permite separar componentes celulares por diferencias en
coeficientes de sedimentación, a partir de un homogenizado celular.

En una centrifugación diferencial, se realizan centrifugaciones sucesivas a velocidades

crecientes y se obtienen fracciones que están constituidas por los pellets (sedimentos en el
fondo del tubo de centrífuga) obtenidos en estas centrifugaciones
En un esquema típico de centrifugación diferencial, se mezcla una solución 0.25 – 0.35 M de
sacarosa con células o un trozo de algún tejido animal o vegetal. La mezcla es colocada en un
homogenizador, un disruptor celular ultrasónico, o simplemente un mortero y las membranas
celulares serán rotas para liberar el contenido celular. La mezcla resultante de organelos
subcelulares puede ser colocada en una centrífuga a 1000 revoluciones por minuto (rpm) por 5
minutos. Células intactas y núcleos sedimentarán en el fondo del tubo de centrífuga como
pellet.
Después el sobrenadante es centrifugado a 12.000 rpm por 20 minutos y partículas subcelulares
tales como mitocondrias, lisosomas pueden ser colectados como pellet.
Las partículas más pequeñas y livianas (ribosomas, fragmentos de retículo endoplasmático
membranas celulares y microsomas) pueden ser separados desde el sobrenadante del
procedimiento anterior por centrifugación a 60.000 rpm por 60 minutos. El sobrenadante final
puede ser considerado como la porción soluble de citoplasma celular.

Centrifugación en gradientes
Existen varios tipos de centrifugación en los cuales la sedimentación ocurre a través de una
solución con un soluto que está en una gradiente de concentración a lo largo del tubo de
centrifugación, lo que produce una gradiente de densidad. Estos métodos permiten obtener una
mayor resolución en la separación.

Por ejemplo, cada fracción obtenida a través de la centrifugación diferencial contiene diferentes
tipos de organelos con velocidades de sedimentación semejantes. Estas fracciones pueden ser a
su vez fraccionadas mediante la centrifugación en gradiente de densidad que se basa en la
densidad de las partículas. La gradiente de densidad puede formarse utilizando un formador de
gradientes, o bien en forma manual, colocando en capas volúmenes de soluciones de diferentes
concentraciones, de manera que en un tubo estarán las más densas en el fondo y las más
livianas en el tope. La fracción a ser separada es colocada en la superficie de la capa menos
densa (arriba).
Si se está separando fracciones de un extracto celular, los componentes subcelulares migraran a
través de la gradiente durante la centrifugación hasta llegar a un punto donde la densidad de la
gradiente es igual al de la partícula, lugar donde permanecerán. Esto permite la separación de
partículas y moléculas en base a sus distintas densidades

Centrifugación en gradiente de sacarosa

Cada componente migra a través de una gradiente de sacarosa (por ejemplo 20 – 70%) hasta
que alcanza una posición donde la densidad de la solución es igual a su propia densidad.
Se obtienen comúnmente zonas o bandas después de la centrifugación.
Tamaño y densidad de algunos organelos típicos
------------------------------------------------------------------------------------
Organelo Diámetro (µm) Densidad (g/cm3)
------------------------------------------------------------------------------------
Núcleos 5 –10 1.4
Mitocondria 1 –2 1.1
Ribosomas 0.02 1.6
Lisosomas 1- 2 1.1
------------------------------------------------------------------------------------

Objetivos
• Entender el principio y los aspectos básicos de la separación por centrifugación
• Aplicar los principios de la centrifugación en el fraccionamiento celular en una gradiente
de sacarosa
• Medir la concentración de sacarosa de cada fracción y asociar con densidad de los
organelos presentes en el fraccionamiento celular.
Materiales
Hojas frescas de Espinacas
Soluciones de sacarosa: 33%, 44%, 50%, 57%, 60% (w/v)
Medio para Homogenizar: 0.4 M Sacarosa; 0.165 M Tris-HCl buffer, pH 7,5; 0,01 M KCl; 0,01M
MgCl2 0,01M EDTA ajustado a pH 7.5; 0,01M ditiotreitol
Mortero, gasa para filtrar
Centrifuga Sigma
Ultracentrífuga Beckman con rotor swinging bucket SW 28.1
Refractómetros de 0 a 30% y de 28 a 60%

Procedimientos
1. Pesar 15 g de hojas frescas de espinacas y cortarlas en trozos pequeños (1 cm2) descartando
las nervaduras. Molerlas en un mortero mientras agrega lentamente 30 ml de medio
homogenizante frío. Rápidamente filtrar la pulpa a través de gasa. Apriete suavemente la pulpa
para extraer líquido residual. Mantener extracto en frío.

2. Transferir 15 ml del filtrado a tubos de centrífuga y centrifugue a 4º C por 5 minutos a 1000

r/min para remover células enteras y otros restos de tejidos vegetales. Utilizar la centrífuga
Sigma.

2. Retirar el sobrenadante de la primera centrifugación en dos tubos de centrífuga limpios y

fríos y volver a centrifugar a 4ºC por 10 minutos a 12.000 g en la centrífuga Sigma.
3. Preparar dos tubos de centrífuga para la gradiente de sacarosa. Colocar las siguientes
soluciones lentamente y en orden, escurriendo el líquido por las paredes del tubo:

1.5 ml de sacarosa 60%

3.0 ml de sacarosa 57%
4.5 ml de sacarosa 50%
4.5 ml de sacarosa 44%
1.5 ml de sacarosa 33%

4. Retirar el sobrenadante de la segunda centrifugación (este se podría seguir centrifugando en

un procedimiento de centrifugación diferencial) y resuspender el pellet en 1,5 ml de medio
homogenizante. Cuidadosamente colocar 1 ml de pellet resuspendido sobre la gradiente de
sacarosa de los dos tubos de centrífuga que habrá preparado previamente. Balancear el peso
de ambos tubos agregando de manera de obtener el mismo peso en ambos tubos. Sea
cuidadoso al respecto.

5. Centrifugar los tubos a 4ºC por 1 hora a 25.000 rpm en un rotor SW 28.1 en la ultracentrífuga
Beckman

6. Después de completada la centrifugación, observar las zonas formadas y fraccionar el

contenido del tubo. Para esto utilizar una micropipeta de 1000 µl, tomando volúmenes de 1,0
ml, colocándolos en tubos eppendorf.

7. Mediante un refractómetro determinar el % de sacarosa en cada fracción y su

correspondiente densidad según Tabla 1. Indicar en qué fracción es posible encontrar los
diferentes organelos según la Tabla 2

Trabajo de Investigación (1 página)

Investigue sobre una aplicación industrial de la centrifugación
ANEXOS

Tabla. 1 Concentración (g/100 ml) y densidad de soluciones de sacarosa

Porcentaje Densidad (g/cm Porcentaje Densidad (g/cm

g /100 ml ) g /100 ml )
0 0.9982 29 1.1222
1 1.0021 30 1.1270
2 1.0060 31 1.1318
3 1.0099 32 1.1366
4 1.0139 33 1.1415
5 1.0179 34 1.1463
6 1.0219 35 1.1513
7 1.0259 36 1.1562
8 1.0299 37 1.1612
9 1.0340 38 1.1663
10 1.0381 39 1.1713
11 1.0423 40 1.1764
12 1.0465 41 1.1816
13 1.0507 42 1.1868
14 1.0549 43 1.1920
15 1.0592 44 1.1972
16 1.0635 45 1.2025
17 1.0678 50 1.2296
18 1.0721 55 1.2575
19 1.0765 60 1.2865
20 1.0810 65 1.3163
21 1.0854
22 1.0899
23 1.0944
24 1.0990
25 1.1036
26 1.1082
27 1.1128
28 1.1175
Tabla 2. Densidades de estructuras celulares

Estructura Densidad (g/cm3)

Aparato de Golgi 1.06-1.10

Membrana plasmáticas 1.16

Retículo endoplasmico liso 1.16

Mitocondrias 1.19

Lisosomas 1.21

Peroxisomas 1.23

Virus de plantas 1.30-1.45

Proteínas solubles 1.30

Rhino- y enterovirus 1.30-1.45

Ribosomas y ácidos, nucleicos 1.60-1.75

Glicógeno 1.70
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Laboratorio de Bioquímica y fisiología microbiana

Cuantificación de proteínas por espectroscopia de absorción Método
de Bradford

Introducción
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe en longitud de ondas que pertenecen al espectro visible;
el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones
ultravioleta, visibles e infrarrojass depende de la estructura de las moléculas, y es característica
para cada sustancia química. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas
longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas
llas longitudes de onda no absorbida.

La espectrofotometría UV-visible
visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución.
Se basa en que las moléculas absorben radiación electromagnética y que la cantidad absorbida
absor
depende de forma lineal de la concentración.

Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro.

En este instrumento se puede seleccionar la longitud de onda

(λ) de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de
luz absorbida por esta.

Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre A

Absorbancia de luz monocromática
mática y la concentración de la
l
sustancia que absorbe en solución (cromóforo):

A=εxlxC

en que

ε: coeficiente de extinción
l: distancia
ncia que recorre la luz por la solución (1 cm en cubetas)
C: concentración del cromóforo
La espectrometría de absorción permite determinar la concentración de proteínas, ácidos
nucleicos y otras moléculas biológicas en una muestra, gracias a la propiedad de estas de
absorber radiación electromagnética.
Existen varios métodos para cuantificar proteínas en una muestra, los que difieren en
procedimiento y sensibilidad, tales como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o
mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas.

Método de Bradford
El método que vamos a utilizar en este trabajo práctico incluye el colorante azul de Coomasie,
un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de acido fosfórico tienen un
color café rojizo. Cuando este colorante se une a una proteína, el entorno más hidrofóbico del
interior de esta, origina que el complejo azul de Coomasie - proteína adquiera un color azul
intenso.
Esto permite se pueda medir fácilmente en un espectrofotómetro ya que absorbe fuertemente
en a 595 nm.

El método de Bradford es rápido y muy sensible. Este método es útil en el rango de 10 a 800 µg
de proteínas. Para poder utilizar este método se requiere realizar una recta estándar, con
soluciones de proteínas de concentración conocida, a las cuales se les mide la absorbancia con
un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Luego se mide la absorbancia de la
muestra y se interpola el valor de la concentración en la recta estándar (gráfico Absorbancia vs
Concentración de proteínas)

Albúminas y globulinas
Tradicionalmente la clasificación de ciertas proteínas -especialmente proteínas de
almacenamiento- está basada en sus propiedades de solubilidad:
albúminas: proteínas que son solubles en agua o en disoluciones salinas diluidas
globulinas: requieren concentraciones salinas más elevadas para permanecer en solución
Esta antigua clasificación aún tiene validez operativa, especialmente en relación con
propiedades técnicas de estas proteínas.

Las proteínas en legumbres constituyen del 20 % (arvejas) al 40% (soya, lupino) del peso seco de
la semilla por lo que las legumbres están entre los alimentos más ricos en proteínas para la
alimentación humana. En semillas de legumbres, las globulinas y albúminas son las proteínas
más abundantes aunque las primeras están en mayor proporción. En animales, la albúmina
sérica -la proteína más abundante en el plasma- contribuye al transporte de las sustancias
hidrofóbicas a través del cuerpo y a regular la presión osmótica de la sangre.
Otras globulinas y albúminas importantes incluyen la ß-lactoglobulina (50%) y α-lactalbumina
(25%) -las principales proteínas del suero de la leche- y la ovoalbúmina –principal proteína de la
clara del huevo.
Objetivos
• Extraer albúminas de diferentes legumbres
• Aplicar el método de Bradford para determinar la concentración de proteínas de una
muestra biológica

Materiales
Solución de proteína (albúmina de suero de bovino, BSA) de 1 mg/ml y 0,1 mg/ml
Reactivo de Bradford (azul de Coomasie)
Semillas de diferentes legumbres
Morteros
Solución de extracción (sulfato de potasio 5 %, pH 7)
Espectrofotómetro

Procedimientos
I. Procesamiento de las muestras
Extracción de albúminas de semillas
1. Colocar 3-5 semillas (garbanzo, haba, lenteja, poroto) en un mortero (2 por mesón y moler
hasta obtener una pasta homogénea).
2. Pesar 0,1 g de esta pasta en un tubo eppendorf y agregar 1 ml de solución de extracción.
3. Agitar por 1 minuto y dejar reposar en hielo por 1 minuto y repetir esta operación dos veces
más.
4. Luego centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos a 4º C. El sobrenadante contiene la fracción
enriquecida en albúminas. Tomar 500 µl de sobrenadante y poner en tubos eppendorf
limpios, mantener en hielo.

Cuantificación de concentración de proteínas por método de Bradford

5. Diluir los sobrenadantes 1: 10 (100 µl de sobrenadante en 900 µl de solución de extracción)
6. Tomar 100 µl de cada dilución y poner en tubos de vidrio
7. Agregar 5 ml de reactivo de Bradford, mezclar por inversión y esperar 5 minutos
8. Seleccionar longitud de onda en el espectrofotómetro: 595 nm
9. Preparar blanco con 100 µl de solución de extracción más 5 ml de reactivo de Bradford.
Mezclar y ajustar Absorbancia a 0 en el espectrofotómetro con este blanco.
10. Poner muestras en espectrofotómetro y leer las respectivas absorbancias. Registrar
resultados
11. Interpolar el valor de las concentraciones correspondientes a las absorbancias obtenidas
utilizando la recta estándar (con la ecuación de la recta despejar la concentración). Para
obtener la concentración de proteínas de las muestras originales, considerar la dilución
realizada.
II. Elaboración de recta estándar
1. Colocar en una gradilla 8 tubos eppendorf y rotular: 1-8
2. Preparar en estos tubos un conjunto de 8 soluciones estándar (500 µl cada una) en el rango
0,1 – 0,8 mg/ml a partir de una solución stock de BSA (albúmina de suero de bovino) 1
mg/ml (Tabla 1)
3. Una vez preparadas, pipetear 100 µl de cada solución en un correspondiente tubo de ensayo
4. Agregar 5 ml de reactivo de Bradford y mezclar por inversión. Esperar 5 minutos para que se
desarrolle el color.
5. Seleccionar longitud de onda en el espectrofotómetro: 595 nm
6. Preparar blanco con 100 µl de solución de agua destilada más 5 ml de reactivo de Bradford.
Mezclar y ajustar Absorbancia a 0 en el espectrofotómetro con este blanco.
7. Poner soluciones en espectrofotómetro y leer las respectivas absorbancias. Registrar
resultados
8. Graficar la Absorbancia vs la Concentración de proteína (recta estándar). Obtener la recta
ajustada a sus datos y la ecuación de esta, la que se utilizará para obtener (interpolar) la
concentración de albúmina de las muestras.

Tabla 1

Soluciones recta estándar Método de Bradford

Tubo Concentra Volumen de Volumen Volumen de Volumen Abs a 595 nm

ción BSA 1mg/ml de Agua sol estándar Reactivo de
(mg/ml) destilada Bradford
Blanco 0 0 500 µl 100 µl 5 ml 0

1 0,1 100 µl 5 ml

2 0,2 100 µl 5 ml

3 0,3 100 µl 5 ml

4 0,4 100 µl 5 ml

5 0,5 100 µl 5 ml

6 0,6 100 µl 5 ml

7 0,7 100 µl 5 ml

8 0,8 100 µl 5 ml
Ejemplo de recta estándar 0.7
y = 5.2361x + 0.0102
Y representa la absorbancia y X la 2
R = 0.998
0.6
concentración de las soluciones de albúmina
(BSA en este caso) en la ecuación de la recta 0.5

0.4

Abs (595 nm )
0.3

0.2

0.1

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

-0.1
Albúmina (mg)

Abs promedio (Lineal (Abs promedio

Informe
• Debe incluir recta estándar con los datos correspondientes y concentración de proteínas de
las fracciones de albúminas obtenidas
• Incluir (máximo 1 página) investigación sobre:
- un método alternativo para cuantificar proteínas
- calidad nutricional de proteínas de legumbres

En general, para todos los trabajos prácticos e informes:

1. Todas las gráficas y tablas deben incluir un título apropiado
2. Las gráficas deben tener los ejes debidamente identificados.
3. Incluya siempre las unidades, en las gráficas, tablas y resultados para muestras problema.
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Práctico 3

Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida-

poliacrilamida
SDS
Introducción

Electroforesis es el proceso de migración de moléculas cargad

cargadas
as a través de soluciones en un
campo eléctrico. Estos métodos son empleados frecuentemente en la separación de proteínas,
ya que las cadenas laterales de varios aminoácidos existen en forma disociada a un determinado
pH, contribuyendo con cargas positivas y negativas a las macromoléculas. Estos procedimientos
no son utilizados normalmente para purificar proteínas en grandes cantidades ya que hay otros
métodos más apropiados para este fin como cromatografía en columna. Sin embargo, la
electroforesis es muy útil como método analítico, ya que permite visualizar y hacer una
estimación rápida del número de proteínas en una mezcla y de su peso molecular aproximado.
Además, la electroforesis permite determinar el grado de pureza de una preparación.

foresis la fuerza que mueve las macromoléculas es el potencial eléctrico aplicado

En la electroforesis
por dos electrodos que se sumergen en una solución de un electrolito, y las macromoléculas
aceleran hacia el electrodo de signo opuesto. Como las partículas que migran enfrentan
enfren una
resistencia friccional a su movimiento, cada una alcanza una velocidad máxima de migración, y
las separaciones de moléculas en una mezcla dependerá de factores como el tamaño de la
macromolécula y de la matriz de soporte.

La electroforesis de proteínas
oteínas se lleva a cabo en geles
formados por el polímero poliacrilamida. El gel de
poliacrilamida se prepara por polimerización de
acrilamida y el entrecruzamiento de la poliacrilamida con
N,N-metilenbisacrilamida.
metilenbisacrilamida. El resultado es una matriz
inerte que forma
orma un tamiz molecular a través del cual
migran las macromoléculas.

Para lograr una mayor resolución se ha introducido el

sistema discontinuo en el que el gel consiste en dos
regiones: el gel concentrador donde se cargan las
muestras y el gel separador donde se produce la separación de las macromoléculas. El gel
concentrador tiene una concentración de poliacrilamida menor, una fuerza iónica menor y un
pH más bajo que el gel separador.
El efecto conjunto es que las macromoléculas se
moverán rápidamente al entrar en el gel
concentrador, acumulándose en estrechas
bandas en el espacio entre el gel concentrador y el
gel separador, apilándose en un orden de
acuerdo a sus movilidades electroforéticas.

A medida que las moléculas migran a través del gel

separador las distintas proteínas se separan en
bandas discretas de acuerdo a su movilidad.
Al término de la corrida electroforética el gel se
puede teñir por inmersión en un colorante que se une fuertemente a proteínas (Azul de
Coomassie), lo que es seguido por el lavado exhaustivo para remover el colorante no unido.

Geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes

Las proteínas pueden ser separadas sobre la base de su masa molecular unicamente, si se
realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes, lo que se logra
por adición del detergente aniónico Dodecilsulfato de Sodio (SDS). Esta molécula rompe las
interacciones no covalentes en las proteínas uniéndose a ellas en forma uniforme, lo cual
resulta en un complejo proteína denaturada-SDS que posee una carga negativa neta que es
proporcional a la masa de la proteína. Así, todas las proteínas de la mezcla se mueven hacia el
ánodo por su carga negativa, sin interferencia de su carga original. Las proteinas se pueden
separa entonces solo en base a su masa molecular.

Durante la electroforesis los complejos proteínas-SDS se moverán a

través de los poros de la matriz la cual opondrá mayor resistencia
friccional a las moléculas con mayor tamaño. Debido a estos
factores la electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes separará proteínas basándose en el tamaño de las
moléculas y la velocidad de migración electroforética será
proporcional al logaritmo del peso molecular de la proteína.

Este procedimiento se utiliza para determinar el peso molecular de proteínas al realizar

conjuntamente la electroforesis de un conjunto de proteínas estándar (serie de proteínas de
peso molecular conocido) y la muestra analizar. Al graficar la distancia de migración versus el
logaritmo del peso molecular se obtendrá una recta.

OBJETIVOS:

• Conocer los fundamentos y aplicaciones de la electroforesis de proteínas en gel de

poliacrilamida.
• Comparar la movilidad electroforetica de proteínas (albúminas) de distintas legumbres
MATERIALES
Cámara de electroforesis Mini-PROTEAN 3
Preparación de albúminas obtenidas en actividad práctica anterior

Reactivos y Soluciones

Estos reactivos ya están preparados:

• Solución 30 (acrilamida 30% – bisacrilamida 0,8 %) Manipular con las debidas precauciones
por su toxicidad.
• Solución B (Buffer gel separador): 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
• Solución C (Buffer gel concentrador): 1 M Tris-HCl, pH 6.
• Buffer de corrida: Tris-glicina pH 8
• N:N;N’,N’- Tretametilendiamino (TEMED)
• SDS al 10 %
• Persulfato de amonio (APS) al 10%

PROCEDIMIENTOS

Electroforesis
Preparación de las muestras:
Rotular 6 tubos Eppendorf y depositar en cada uno de ellos 10 µl de una preparación de
albúminas obtenidas en práctico anterior y 10 µl de buffer de carga. Se le proporcionará
también un tubo con 10 µl de estándar de peso molecular.

Colocar los tubos bien cerrados, en un baño de agua hirviendo por 3 minutos. La finalidad de
esta etapa es denaturar las proteínas por acción del detergente SDS y el β- mercaptoetanol. Con
una pipeta Hamilton cargue 10 µl de muestra en cada pocillo evitando la formación de burbujas
que derramarían la muestra a las celdillas vecinas. Cargue además 10 µl de estándar de peso
molecular en un pocillo.
Conectar la cámara a la fuente de poder y aplicar el voltaje adecuado según la concentración del
gel y el tiempo de corrida necesario. Para un gel al 10% de acrilamida 90 volts por 90 minutos
aproximadamente permiten una buena separación.

Tinción del gel

Los geles serán teñidos por las asistentes técnicas. Después de 3 días de realizado el práctico, ir
al laboratorio para tomar una fotografía de este y utilizarla para confeccionar el informe.
Mida las distancias de migración o Rf (en mm) de las bandas obtenidas en el estándar de
proteínas y grafique distancia (eje x) vs log PM (eje y).

INFORME
-Determine el PM de una banda en las preparaciones de albúminas
Investigue sobre otra técnica para determinar el peso molecular de una proteína
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IVERSIDAD TECNOLÓGICA METROPOLITANA
Departamento de Biotecnología

Laboratorio
torio de Bioquímica y fisiología microbiana
Práctico 4
Actividad de β-galactosidasa

Introducción
Actividad enzimática

Las enzimas son proteínas globulares con actividad catalítica que se encuentran ampliamente
distribuidas en células, tejidos y fluidos de los organismos vivos. Aunque en la naturaleza se
encuentran junto a muchas especies moleculares, es posible detectarla
detectarlass por la reacción que
catalizan.
Como en muchas preparaciones enzimáticas la cantidad o concentración de la enzima es
desconocida, esta se expresa en términos de su actividad, medida en concentración de
producto producido en la reacción catalizada por unidad de tiempo.. Una de las definiciones más
utilizadas para medir la actividad de una enzima es la establecida por la Comisión de Enzimas
(de la International Union of Biochemistry):

Una Unidad Internacional de enzima (U) es la cantidad (de enzima) que cataliza la formación
de 1 µmol de producto por minuto, en condiciones experimentales definidas.

Durante el aislamiento o purificación de una enzima de cualquier fuente, se debe hacer una
determinación de la cantidad de proteína presente en las distintas etapas del proceso (por
ejemplo, con el método de Bradford). Puesto que la purificación de enzimas involucra la
remoción selectiva de otras proteínas, es necesario establecer la cantidad de actividad
enzimática relativa a la cantidad de proteína presente een n cada etapa del proceso de
purificación. La actividad específica es una medida de la actividad enzimática por miligramo de
proteína, y puede ser empleada para indicar el grado de pureza de la enzima en las fracciones
obtenidas durante la purificación

Actividad específica = Actividad = µ moles

oles de producto formado / minuto
mg de proteína mg de proteína

A medida que una enzima sigue un proceso de purificación, su actividad específica aumentará
hasta llegar a un límite, que corresponde a la enzima pura. Como la velocidad de una reacción
depende de factores como concentración de sustrato, temperatura, pH y otros, la actividad
específica se informa usualmente en condiciones óptimas de ensayo, y con los sustratos
presentes en concentraciones saturantes.
Velocidad de una reacción enzimática

Para medir la velocidad de una reacción catalizada por una enzima se requiere determinar la
formación de un producto P (o el consumo de un sustrato S) de la reacción en función del
tiempo. La determinación cuantitativa de P (o de S) puede hacerse por diferentes métodos
analíticos siendo los espectrofotométricos los más comunes.
Si P puede medirse en presencia de los otros componentes de la mezcla de reacción, la reacción
enzimática podría seguirse continuamente en función del tiempo. Es decir, se pueden obtener
numerosos puntos experimentales de la producción de P en función del tiempo, a partir de un
único medio de reacción.

[Producto] ug/ml
La figura muestra una curva típica de
formación de un producto P en función del
tiempo para una reacción catalizada
enzimáticamente.

Tiempo (seg)

Se observa que la velocidad (Δ[P] / Δ[T]) disminuye con el tiempo, lo que puede deberse a las
siguientes causas:

• El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración de

sustrato (S)
• La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al
aumentar la concentración de P
• Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima

Para conocer la velocidad de una reacción enzimática (o su actividad) en condiciones

establecidas, se requiere por lo tanto determinar la velocidad en los tiempos iniciales, para
evitar estas situaciones y donde la relación V vs T se mantiene lineal. Esta es la velocidad inicial
(pendiente de la parte recta de esta curva).

β- galactosidasas

Las β- galactosidasas (EC 3.2.1.23) están ampliamente distribuidas en la naturaleza,

encontrándose en animales, plantas y una variedad de microorganismos, incluyendo bacterias y
hongos. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces galactosídicos β-1,4. Las β-galactosidasas
son enzimas que tienen potenciales aplicaciones industriales debido a sus actividades de
hidrolasa y transferasa.

En la reacción hidrolítica normal, las β- galactosidasas hidrolizan lactosa, transfiriendo el grupo

galactosil al grupo hidroxilo del agua, liberando galactosa y glucosa. Esta actividad ha sido
aplicada por ejemplo en la industria de alimentos, para reducir la lactosa en productos lácteos.
En este laboratorio evaluaremos la actividad de β β-galactosidasa
galactosidasa utilizando el sustrato
cromogénico artificial o-nitrofenil
nitrofenil-β-D-galactopiranosa (ONPG).

Este compuesto es normalmente incoloro, pero la acción

de la β-galactosidasa
galactosidasa lo hidroliza a galactosa y orto
orto-nitrofenol
(ONP).

Velocidad de la reacción catalizada por la enzima

El ONP presenta una coloración amarilla y abso absorbe

rbe fuertemente en la región 380 - 420 nm,
(dependiendo del pH), por lo que la cantidad de orto
orto-nitrofenol
nitrofenol producido puede ser medido a
través de la Absorbancia en un espectrofotómetro. Por lo tanto se puede determinar la
velocidad de la reacción catalizad
catalizadaa por la enzima como Δ[ONP] / Δt, o como la pendiente de la
recta en un gráfico [ONP] vs Tiempo.
Para determinar las propiedades cinéticas de una enzima, por ejemplo, Vmax y Km,
generalmente se estudia la variación de la velocidad de una reacción con la concentración de
sustrato.

Objetivos

• Medirr la velocidad de una reacción enzimática mediante espectrofotometría, utilizando

un sustrato cromogénico
• Observar la variación de la velocidad con respecto a la concentración de sustrato, en la
reacción catalizada por la β-galactosidasa

Reactivos
Buffer 2x: Na2HPO4 30mM, NaH2PO4 20 mM, KCl 10mM, pH 7,5
ONP 2 mM
ONPG 10 mM
Preparación de β-galactosidasa
galactosidasa 2mg/ml

Procedimientos
Recta estándar de o-nitrofenol

Para poder determinar la velocidad de una reacción catalizada por una enzima podemos medir
el aumento de la concentración del producto en el tiempo
tiempo.. Un método frecuentemente usado
consiste en medir la absorbancia del producto en un espectrofotómetro, pero para conocer la
concentración debemos encontrar una relación entre estos dos parámetros. La formaf más
directa de hacerlo es elaborar experimentalmente una recta estandar utilizando una serie de
soluciones de concentración conocida del producto de la reacción, en este caso el o-nitrofenol.

A partir de la solución stock de o-nitrofenol (2 mM) preparar 7 soluciones de 2,5 ml en el rango

50-500 µM, agregando buffer 2x (1,25 ml) y agua destilada (adicionar volumen para completar
2,5 ml) de acuerdo a la Tabla 1. (Se debe calcular el volumen de solución stock de o-nitrofenol 2
mM que es necesario agregar en cada punto de la columna 2)

Tabla 1

[ONP] µM Vol. sol. 2mM Buffer 2x Agua destilada Absorbancia

50 µM 1250 µl

75 µM 1250 µl

100 µM 1250 µl

200 µM 1250 µl

300 µM 1250 µl

400 µM 1250 µl

500 µM 1250 µl

Blanco - 1250 µl

Una vez preparadas las soluciones leer en espectrofotómetro a 420 nm, y confeccionar con
estos datos la recta estándar

Dependencia de la velocidad de la reacción con la concentración de sustrato

Para estudiar la variación de la velocidad de la reacción catalizada por la β-galactosidasa con la

concentración de sustrato se deberán preparar mezclas de reacción con diferentes
concentraciones de ONPG en el rango de 0,15 a 1,5 mM, según la tabla 2. Calcular los valores
que faltan en la tabla, considerando el volumen final de reacción 2,5 ml.
Tabla 2. Reacciones utilizando cantidad constante de β-galactosidasa con diferentes
concentraciones de sustrato

[ONPG] Vol. [ONPG] Buffer 2x Agua destilada β-galactosidasa

final mM 10 mM
0,15 1,25 ml 100 µl
0,3 1,25 ml 100 µl
0,6 1,25 ml 100 µl
0,9 1,25 ml 100 µl
1,2 1,25 ml 100 µl
1,5 1,25 ml 100 µl
Blanco - 1,25 ml 1,15 ml 100 µl

Para iniciar cada reacción, agregar 100 µl de enzima y rápidamente traspasar la mezcla a un
tubo del espectrofotómetro, e iniciar simultáneamente la cuenta del tiempo. Medir la
absorbancia cada 15 - 30 segundos y registrar las lecturas de cada tiempo. Continuar midiendo
hasta completar 5 mediciones.

Antes de empezar las reacciones, hay que ajustar la lectura del instrumento a cero absorbancia
con el blanco. Para preparar el blanco, utilizar agua destilada en vez de sustrato, agregando la
misma cantidad de enzima.

El informe debe incluir en Resultados:

• Recta estándar
• Para cada reacción graficar Concentración vs Tiempo y calcular la velocidad inicial
correspondiente (pendiente del segmento recto de la curva)
• Gráfico final Velocidad vs [ONPG]
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Departamento de Biotecnología

Laboratorio de Bioquímica y fisiología microbiana

Práctico 5
Cultivo de Microorganismos
Introducción al Laboratorio de Microbiología
Para estudiar los microorganismos se han desarrollado una serie de técnicas que incluyen su aislamiento,
cultivo, observación, caracterización, identificación y mantención de estos en el laboratorio. Los
laboratorios de microbiología utilizan material y equipos que se ocupan también en laboratorios de
biología, química y bioquímica, como material de vidrio, refrigerador y centrífugo. Sin embargo, ciertos
materiales y equipos se utilizan
n más frecuentemente en microbiología:

Placas de Petri
Las placas de Petri de vidrio de uso habitual en microbiología, aunque
actualmente están siendo reemplazadas por material de plástico desechable.

Microscopio
El conocimiento actual de la Biología Celular y la Microbiología ha sido
posible en gran medida, gracias al desarrollo de la Microscopia. El continuo
avance de la tecnología ha permitido contar con microscopios y
metodologías cada vez más poderosos y sofisticados. La microscopia actual
proporciona
ciona aumentos que permiten la observación de células, estructuras
celulares y macromoléculas.

Autoclave
Se utiliza para esterilizar material termoestable (hasta aproximadamente
121° C) por acción de calor húmedo y es particularmente indicado para
medios
os de cultivo y soluciones. Consiste de una cámara de presión que
permite obtener en su interior condiciones de temperatura y presión para
denaturar proteínas estructurales, enzimas, macromoléculas y alterar
estructuras de los microorganismos en un tiempo óptimo. El tratamiento
generalmente consiste en mantener una temperatura de 121°C en una atmósfera saturada de
vapor de agua por 15 minutos. El número de microorganismos decrece en forma exponencial
con el tiempo de exposición a estas condiciones.

Horno Pasteur
Se compone de una caja metálica de pared triple, determinando espacios
concéntricos que se comunican entre sí. El central que ocupa el mayor
volumen, contiene espaciadores metálicos para colocar el material a
esterilizar. Como fuente de calor utiliza resistencias eléctricas que elevan la
temperatura lentamente hasta alcanzar los 180° C. El calor se transmite a través del aire que
circula por todo el interior y el mantenimiento de esta temperatura por 2 horas asegura la
destrucción de bacterias y esporas. Este equipo se utiliza principalmente para esterilizar
material de vidrio.

Incubador
Un incubador 0 estufa de incubación es una cabina aislada con un sistema de
calefacción eléctrico regulado que permite mantener constante una determinada
temperatura. Estos equipos poseen generalmente dos termostatos
independientes, de control y de seguridad, este último para prevenir alzas de
temperatura, si falla el de control. Existen diferentes tipos de incubadores: de aire, de aire más
CO2, con baño de agua.

Jarras para incubación en atmósferas especiales

Jarras de vidrio o plástico son usadas para incubar algunos microorganismos
que requieren de una atmósfera con concentración de oxígeno menor que la del
aire. La atmósfera artificial es generada en el interior de la jarra por reacciones
químicas que retiran oxígeno y producen CO2 (microaerofilia o anaerobiosis).

Refrigeradores y Freezers
Estos equipos son necesarios en un laboratorio para conservar medios, soluciones y cultivos
(refrigerador) o para mantener cepas de microorganismos en stock y reactivos especialmente
lábiles (freezers desde-20°C a –80°C).

Medios de Cultivos
Para aislar y estudiar un microorganismo es necesario observar su crecimiento en medios
preparados en el laboratorio que contienen las sustancias nutritivas necesarias. El material
nutritivo en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Los medios de cultivo son preparados estériles.
Para que un microorganismo pueda crecer en cultivos in vitro, debemos suministrarle todos los
nutrientes que necesita para su desarrollo. Dichas sustancias se requieren con dos objetivos:
energéticos (los microorganismos requieren energía del exterior) y biosínteticos (para formar
los constituyentes celulares). De acuerdo a sus necesidades los nutrientes pueden clasificarse
como a) universales: son aquellos nutrientes que todos, o bien la mayoría de los
microorganismos requieren para su crecimiento; b) particulares: son nutrientes que varían de
acuerdo a la capacidad biosintéticas del microorganismo.

Los medios de cultivo según su estado físico pueden ser sólidos o líquidos y se emplean de acuerdo a las
necesidades y objetivos de cada estudio. En medios líquidos o caldos los microorganismos se multiplican
formando una suspensión de células que por lo general produce enturbiamiento del medio de cultivo.
Aquí no podemos distinguir entre las distintas poblaciones que puedan haberse desarrollado pues es un
medio liquido donde células de un grupo y otros están mezcladas. En un medio de cultivo sólido o agar
los microorganismos pueden crecer formando colonias aisladas, es decir,
grupos de células originadas de una sola célula parental. Por esto, una
colonia representaría una especie pura. Además, las especies y géneros
de grupos no estrechamente relacionados originan colonias con
características macroscópicas particulares (textura, color, tamaño, entre
otras), cuya observación es muy importante en las primeras etapas de la
obtención de cultivos puros.

A pesar del gran avance en el desarrollo de medios de cultivo, ninguno es lo suficientemente

selectivo como para permitir el crecimiento exclusivo de solo una especie de microorganismos.
Para subsanar este problema se deben tomar en cuenta características bioquímicas
(metabólicas) más específicas del o los grupos de microorganismos que nos interesa aislar. De
este modo en medios de cultivo sólidos, donde los microorganismos se desarrollan formando
colonias, podemos agregar uno o más sustratos que sabemos serán utilizados solo por el grupo
de microorganismos que nos interesa y no por los contaminantes. La forma de visualizar la
metabolización de estos sustratos debe ser fácil y rápida, por ejemplo, cambio en el pH del
medio de cultivo alrededor de la colonia con un subsecuente cambio en el color o tonalidad en
esa zona, o bien la formación de un compuesto coloreado.

Los medios de cultivo pueden ser clasificados según su uso:

1. Medios de Preenriquecimiento: Tienen la función de reanimar o iniciar la proliferaci6n

de microorganismos afectados en su viabilidad debido a los tratamientos a que son
sometidos (utilizados frecuentemente en Microbiología de Alimentos)

2. Medios de Enriquecimiento: Favorecen el desarrollo de un grupo particular de

microorganismos

3. Medios de cultivo nutritivos: Permiten el desarrollo y conservación de la mayoría de

microorganismos
 4. Medios Selectivos: Favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos inhibiendo a
otros no deseados

5. Medios Diferenciales: Permiten obtener colonias de aspecto

característico para poderlas distinguirlas de aquellas formadas por
otros microorganismos no deseados.

Preparación de los medios de cultivo:

Los medios de cultivos son comercializados en formato listo para usar (en placas o tubos) o bien
en un estado deshidratado y deben ser preparados en laboratorio. Para la hidratación de estos,
se debe utilizar agua destilada o desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del
medio que se quiere preparar. Para su esterilización, generalmente se aplica un protocolo de
tiempo/ temperatura de 15 minutos a 121° C.

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente y también colonizan a

organismos más complejos, incluido el ser humano. Para aislar los microorganismos presentes tanto en
muestras ambientales, de alimentos o en muestras clínicas es necesario aplicar técnicas de toma de
muestras específicas en cada caso. Los procedimientos de toma de muestra deben realizarse en forma
aséptica para evitar riesgo de contaminación.
Cuando las muestras son obtenidas en terreno el traslado al laboratorio debe efectuarse en un período
de tiempo breve (dependerá del tipo de muestra), en envases estériles y empleando métodos de
conservación.

Las técnicas de aislamiento, permiten la recuperar los microorganismos de matrices complejas (suelo,
agua, alimentos, etc) en las que hay una gran diversidad de microorganismos y también permiten
comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están formados por un solo organismo
y que constituye lo que se llama cepa; y son indispensables para conocer las características morfológicas,
propiedades de tinción, actividad bioquímicas e identificación de las especies microbianas. El aislamiento
de cultivos microbianos puede realizarse por siembras en estrías en medios sólidos. Siempre es
necesario trabajar en áreas asépticas (al lado del mechero o emplear una campana de flujo laminar) para
evitar contaminaciones que pueden llevar a resultados erróneos en el análisis de una muestra problema.

En este paso práctico se realizarán siembras de distintas muestras de bacterias mediante diferentes
técnicas, en medios de cultivo sólido. Para ello es necesario proporcionarle los nutrientes y condiciones
físicas (temperatura, humedad) adecuadas para permitir su crecimiento. Pasado el período de
incubación se observarán los crecimientos bacterianos.
Objetivos:
• Familiarizarse con el cultivo de microorganismo en el laboratorio
• Caracterizar colonias bacterianas que se desarrollen en los medios de cultivo
• Apreciar la diversidad de microorganismos que se encuentran en nuestro entorno inmediato
Actividades

Toma de muestras e inoculación:

Rotule placas Petri con agar nutritivo con los datos correspondientes: carrera, sección, mesón,
tipo de muestra.

Inocule las placas de agar con diferentes muestras como se lo indique el profesor.

• Siembra con tórula.

Con una tórula estéril tomar muestra (si se trata de una muestra seca humedecer la tórula en solución
salina estéril) y luego diseminar por toda la superficie del agar. El objetivo es ocupar toda la superficie
del agar para tener más posibilidades de obtener colonias de los distintos microorganismos presentes en
la muestra

• Siembra con asa por agotamiento

Con un asa de argolla tomar muestra de un tubo con cultivo líquido y
diseminarla en la superficie del agar de una placa Petri haciendo estrías en
un patrón definido, como se muestra en las figuras
siguientes. El objetivo es obtener colonias aisladas
Después de la incubación en la estufa (1 - 2 días) observar el crecimiento microbiano.
Caracterizar las colonias de acuerdo a su tamaño (en mm), color y forma

Morfología
de colonias
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Facultad de Ciencias
encias Naturales, Matemática y del Medio Ambiente
Departamento de Biotecnología

Laboratorio de Microbiología
Práctico 6
Tinción y observación microscópica de cultivos

La observación microscópica se puede realizar en fresco o en preparaciones fijadas. Con el primer

procedimiento se pueden observar los microorganismos generalmente vivos y su motilidad, y es
especialmente indicado en algunas muestras clínicas. Para observar con más detalle la morfología de una
bacteria es necesario fijar la muestra a un p
portaobjetos
ortaobjetos y luego aplicar la tinción apropiada.

Para mejorar la observación microscópica de las muestras se utilizan los colorantes,

colorantes que son
compuestos orgánicos que tienen afinidad por determinadas estructuras celulares. Muchos de
los utilizados en microbiología
crobiología son colorantes catiónicos, y se combinan fuertemente con
estructuras celulares cargadas negativamente como ácidos nucleicos y pared celular bacteriana.
Azul de metileno, cristal violeta y safranina son colorantes catiónicos que se combinan con
estructuras de la superficie celular, y que tienen una aplicación general.

Las tinciones pueden ser simples (un solo colorante, aplicación general), diferenciales (no tiñen
de la misma manera a todos los tipos de células) y especiales o específicas (para la l observación
de estructuras celulares como flagelo, cápsula o esporas). La tinción diferencial más importante
en microbiología es la tinción de Gram, que permite la clasificación de la mayoría de las
bacterias en Gram positivas y Gram negativas. La distinta ta tinción de estos dos grupos de
bacterias se basa en diferencias en su pared celular. En la identificación y caracterización de una
especie bacteriana, es muy frecuente iniciarla con una tinción de Gram.

Los Géneros Bacillus y Clostridium producen estructuras

turas altamente resistentes a temperatura,
radiaciones y agentes químicos, denominadas endosporas.. Las esporas no se tiñen fácilmente y
es necesario aplicar calor para que penetre el colorante. Se emplea una tinción diferencial que
permite distinguir la endospora
dospora de la célula vegetativa. También, muchas especies bacterianas
producen cápsula, la que requiere una tinción especial para ser visualizada en el microscopio.

A B. C. D. E.
Figura 1. Tinciones de: A. Gram, B. es
esporas, C. cápsula, D. flagelo, E. pili
Objetivos:

• Preparar muestras bacterianas para su observación al microscopio

• Aprender el procedimiento de la tinción de Gram
• Identificar morfologías bacterianas mediante observación microscópica

Preparación de una muestra para tinción

Seleccione tres colonias diferentes y fije
las muestras en un portaobjeto limpio,
según figura 2.
En el caso de muestra en medio sólido,
la punta del asa solo debe tocar el
crecimiento bacteriano (colonia) de
manera de extraer una pequeña
cantidad. Se debe obtener una
suspensión con muy poca turbidez en la
gota de agua en el portaobjeto.

Para fijar con la llama del mechero se

debe sostener el portaobjeto sobre esta
muy brevemente (1-2 segundos)
dejando enfriar para luego repetir hasta
lograr la evaporación.

Las asas metálicas son usadas para el

aislamiento y traspaso de una
determinada especie bacteriana en
forma estéril. Las asas se deben
esterilizar con la llama del mechero
antes y después de usarlas con
bacterias.

Figura 2. Preparación de una muestra

para tinción
Tinción de Gram

Figura 3. Tinción de
Gram

Actividades

• En un portaobjetos haga una preparación de E. coli, S. aureus, Lactobacillus

• En otro portaobjetos haga una preparación de 3 colonias que aisló en el práctico
pasado
• Tiña las muestras según el procedimiento descrito en Figura 3
• Observe con lente de inmersión (se enfoca primero con lupa, objetivo menor)
• Identificar morfologías bacterianas mediante observación microscópica
•
Anexo
Microscopia óptica
El microscopio óptico utiliza radiación luminosa y un sistema de lentes para producir la imagen
aumentada. Este tipo de microscopia incluye diferentes microscopios y técnicas.

De campo claro, es el más empleado para trabajos de rutina y es el que será usado en el
laboratorio de microbiología.
De fluorescencia, que utiliza colorantes especiales (fluorescentes) y frecuentemente
anticuerpos específicos para moléculas biológicas. Esta técnica permite visualizar estructuras y
organelos dentro de la célula.
De barrido confocal, en el que una pequeña parte de la muestra es iluminada por un rayo laser
que se mueve enfocando diferentes puntos de un plano definido de la muestra. Las imágenes
son grabadas, procesadas y distintos planos son combinados en un computador, produciendo
imágenes tridimensionales.
De contraste de fases permite observar células vivas.

Estructura del Microscopio de Campo Claro

La figura muestra un microscopio óptico de campo claro. Este consta de una parte fija llamada
columna o brazo, y una plataforma con un orificio central por donde pasan los rayos luminosos.
La platina está destinada a sostener y mover
la preparación para la cual lleva un par de
pinzas y un carro móvil que permite
desplazarla utilizando tornillos de control.
En la parte superior, la columna sostiene un
tubo o cañón, que lleva los oculares arriba y
el revólver abajo; el cual es una pieza
giratoria que lleva los objetivos.

Los tornillos de focalización permiten variar la distancia entre los objetivos y la platina, y
corresponden a los tornillos macrométrico y micrométrico, ubicados a cada lado de la columna.
El primero se usa para el enfoque aproximado, y el segundo para el enfoque de precisión. En
algunos modelos existe un solo tornillo con ambas funciones incorporadas.
Sobre la fuente de luz, se encuentra el condensador, que es un sistema de lentes que concentra
los rayos luminosos y los dirige hacia el objeto. El diafragma o iris, ubicado también en el
condensador, permite variar el diámetro del rayo luz.
Los oculares, próximos al ojo del observador, constan de dos lentes planoconvexas. Los oculares
pueden ser de variados aumentos, de los cuales el 10x es el más usado.
Los objetivos, son 4 lentes marcados con el aumento. Uno de ellos corresponde al objetivo de
inmersión, que requiere de una sustancia refractante entre él y la preparación. Su índice de
refracción debe ser lo más cercano al vidrio. Los oculares y los objetivos constituyen el sistema
de amplificación del microscopio.

Preparación de la muestra
Para observar una muestra al microscopio, esta se deposita en un portaobjetos, pequeño
rectángulo de vidrio que se coloca en la platina.
Existen dos tipos de preparaciones microscópicas, éstas corresponden a las preparaciones
permanentes y a las preparaciones temporales. Ambas deben ser lo suficientemente delgadas
para dejar pasar la luz a través de la muestra.

Preparaciones temporales
Los preparados temporales se realizan generalmente en un medio líquido, generalmente agua
(agua destilada o agua corriente) o glicerina y se utiliza para observar alguna estructura u
organismo "in vivo", por ejemplo protozoos que habitan en cuerpos de agua dulce. Se toma una
gota de agua de esta agua, se la coloca entre porta y cubreobjeto (cuadrado de vidrio muy
delgado) y se la mira al microscopio, tienen una duración limitada.
También se pueden observar cortes frescos del material. Una vez realizados los cortes, se
coloca una gota de agua en un portaobjetos, y en ella se ubica un trozo del material a observar,
el que debe quedar completamente cubierto por el agua. Sobre esta preparación se coloca
cuidadosamente un cubreobjeto, evitando la formación de burbujas que interfieren en la
observación microscópica.

Preparaciones permanentes
Son aquellas que se han sometido a un proceso de preparación, el que permite que se
mantengan en buenas condiciones para su observación por periodos prolongados de tiemp
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Metropolitana
Facultad de Ciencias Naturales, Matemática y del Medio Ambiente
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Laboratorio de Bioquímica y Fisiología Microbiana

Factores que condicionan el crecimiento microbiano

Introducción
Factores que Condicionan el Crecimiento
El crecimiento microbiano se ve condicionado por factores fisicoquímicos del medio de
crecimiento,
ecimiento, como son el pH, la concentración de NaCl, actividad de agua. Al mismo
tiempo, el crecimiento se ve afectado por los factores ambientales (extrínsecos) como la
temperatura, tensión de oxígeno, humedad, radiaciones.
La temperatura es uno de los ffactores
actores más importantes que influyen en la actividad de las
enzimas bacterianas. A diferencia de los animales de sangre caliente, las bacterias carecen
de mecanismos que permitan conservar o disipar el calor generado por el metabolismo y
por lo tanto sus sistemas
istemas enzimáticos son directamente afectados por la temperatura
ambiente. Las enzimas tienen temperaturas mínima, óptima y máxima. A la temperatura
óptima las reacciones
nes enzimáticas tienen lugar a velocidad máxima. Por debajo del
mínimo y por encima de las temperaturas máximas de las enzimas se vuelven inactivas. En
algún punto por encima de la temperatura máxima, se producirá la destrucción de la
enzima. Las bajas temperaturas
peraturas son menos dañinas para las enzimas y proteínas en
general.

Además de la temperatura, la concentración de iones de hidrógeno del medio ambiente

ejerce una importante influencia en el crecimiento de un microorganismo. La
concentración de los iones de hidrógeno (pH), limita la actividad de las enzimas. Como en
el caso de la temperatura, existe para cada organismo una concentración óptima de iones
de hidrógeno en la que crece mejor. Los rangos de pH en los cuales pueden crecer
(mínimos, óptimos y máximos)
imos) son definidos manteniendo los otros factores ambientales
constantes. Si se varía la composición del medio, temperatura de incubación, o la presión
osmótica, los requisitos de iones de hidrógeno pueden ser diferentes.

Para controlar el crecimiento de los microorganismos se emplean procedimientos físicos

(calor, radiaciones) y métodos químicos (desinfectantes, antisépticos y antibióticos).

Objetivos
Evaluar el efecto de distintos factores sobre el crecimiento microbiano

Observar el comportamiento de di
diferentes
ferentes especies bacterianas con estos factores
Actividades
Parte I
En la siguiente actividad práctica se cultivaran distintas especies bacterianas para observar
el efecto de diferentes factores sobre su crecimiento. Se sembraran una cepa de
Staphylococcus aureus, una de Escherichia coli y cepas ambientales en tubos con caldo
nutritivo

1. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento:

Sembrar por cada cepa tres tubos con caldo nutritivo. Rotular los tubos: TA 37 y 45
Incubar a temperatura ambiente, a 37° C y a 45 °C respectivamente

2. Efecto del pH sobre el crecimiento:

Sembrar por cada cepa los tubos de caldo nutritivo con pH 4; 7.0 y 10,0.
Rotular apropiadamente. Incubar a 37°C

3. Efecto de la concentración de NaCl:

Sembrar las cepas en medio de cultivo que contiene diferentes concentraciones de NaCl:

1 %, 5% 10%. Incubar a 37°C

Rotular apropiadamente

4. Efecto de la concentración de nutrientes

Sembrar las cepas en medios de cultivo con diferente concentración de nutrientes:
medio nutritivo y medios mínimo. Incubar a 37°C

5. Efecto de la radiación UV
Cultivar cepas en medio de cultivo sólido y expuestas a radiación ultravioleta por 30
segundos, 90 segundos, y 3 minutos. Incubar a 37°C

6. Efecto de presencia de antibióticos

Cultivar cepas en medios de cultivo sólido en presencia de diferentes antibióticos
Incubar a 37°C

Incubar por 48 horas.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, los cultivos serán guardados a
Parte II
Cuantificar el crecimiento mediante medición de la absorbancia a 600 nm.

La concentración de células en un cultivo puede ser estimada con un espectrofotómetro a

600 nm. Utilizaremos una relación aproximada entre densidad óptica (DO) medida e
espectrofotómetro y concentración de células bacterianas:
1 unidad de DO equivale aproximadamente a 5 × 108 células /ml.

Se cuantificará el crecimiento bacteriano en los ensayos 1 a 4.

En los ensayos 5 y 6 se observará el resultado directamente en las placas de agar.

Para el informe:
En cada ensayo, comparar los resultados obtenidos para las cepas sembradas.
Discutir los resultados