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BIOQUÍMICA E METABOLISMO

ANO LECTIVO 2010/11

PRÁTICA LABORATORIAL
PROTOCOLO 1

TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
Duração 2 horas
Sala 26.2.10
Horário 10/10 11:00-13:00 P1
11/10 11:00-13:00 P3
11/10 15:00-17:00 P5
17/10 11:00-13:00 P2
18/10 11:00-13:00 P4
18/10 15:00-17:00 P6

DOCENTE RESPONSÁVEL
Etelvina Figueira efigueira@ua.pt
INTRODUÇÃO
Os aminoácidos são as unidades estruturais básicas das proteínas. Um α-
aminoácido possui o seu átomo de carbono α ligado a um grupo amina (-NH2), um
grupo carboxílico (-COOH), um hidrogénio e um radical R, que se denomina cadeia
lateral (Fig.1). Esta cadeia pode ser ácida, básica ou neutra, e dela dependem
muitas das propriedades do aminoácido.

GLICINA

Fig.1. Estrutura geral de um aminoácido

(A) (B) (C)

NH3+ NH3+ NH2

R Cα COOH ← R Cα COO- ← R Cα COO-


→ →
H H H
pH
crescente

Fig. 2. Equilíbrios ácido-base de um aminoácido com cadeia lateral sem carácter ácido ou base.

Em solução neutra, os aminoácidos estão predominantemente na forma ião


dipolar ou forma zwitteriónica (B). Nesta forma, o grupo amina encontra-se
protonado (-NH3+) e o grupo carboxílico dissociado (-COO-). Como resultado final,
possui uma carga eléctrica líquida zero. O valor de pH no qual o aminoácido se
encontra predominantemente na forma zwitteriónica em solução é designado pH
isoeléctrico (pHi), ou simplesmente, ponto isoeléctrico (pI).

O ião dipolar pode comportar-se como ácido ou base e por isso chama-se ião
anfotérico. A acidificação gradual do meio é acompanhada de um enriquecimento
em H+, proveniente da dissociação do ácido. O grupo –COO- do ião dipolar irá
captar esses protões, apresentando assim características de base. Neste caso, o
número de moléculas da forma dipolar vai diminuindo à medida que vai aumentado
o número de moléculas com o grupo carboxílico não dissociado (Fig. 2A), até se
atingir um valor de pH no qual o número de moléculas na forma catiónica (Fig. 2A)
é igual ao número de moléculas na forma zwitteriónica (Fig. 2B). Este valor de pH é
denominado pK1 (matematicamente correspondente a – log K1), apresentando a
solução, a este pH, uma carga global de +1/2. A continuação da acidificação do
meio para valores inferiores ao pK1 permite atingir um valor de pH em que apenas
existem em solução moléculas na forma catiónica, apresentando a solução neste
ponto uma carga eléctrica de +1.

O ião dipolar comporta-se como ácido quando o meio é progressivamente


alcalinizado (enriquecimento em iões OH-). Os grupos NH3+ vão cedendo protões,
que se combinam com OH-, formando água e a reacção desloca-se no sentido de
formação da forma iónica (Fig. 2C). O valor de pH no qual o número de moléculas
na forma aniónica é igual ao número de moléculas na forma zwitteriónica é
denominado pK2, apresentando a solução, a este pH, uma carga global de –1/2. A
continuação da alcalinização do meio permite chegar a um valor de pH no qual só
estão presentes a forma aniónica e a solução tem por isso uma carga global de –1.

Os valores de pK são os pontos médios de uma região na escala de pH, na


qual ocorrem pequenas variações de pH, mesmo quando são adicionadas grandes
quantidades de ácido ou de bases. Esta região é designada região tampão, e é
localizada no intervalo de pHs de pK ± 1.

Graficamente, o ponto isoeléctrico corresponde a um ponto de inflexão na


curva de titulação e o seu valor localiza-se entre os dois valores de pK, podendo ser
calculado através da expressão:

pK 1 + pK 2
pI =
2

OBJECTIVOS

Estudar o comportamento ácido-básico da glicina e determinar os seus pKs e pI.


Identificar um aminoácido a partir dos seus pKs e pI

REAGENTES E MATERIAL
HCl 0.1 M
NaOH 0.1 M
Glicina 0.1 M
2 Buretas de 25 ml
Suporte para buretas (c/garras)
Funil
Placa de agitação (+ barra magnética)
Eléctrodo de pH
1 Pipeta de 10 ou 20 ml

2 Copos de 50 ml
PROCEDIMENTO
1. Prepare uma solução de glicina numa concentração de 0.1 M.

2. Retire 5 ml da solução de glicina para um copo e coloque dentro do copo


uma barra magnética.

3. Encha uma bureta com HCl 0.1 M (verifique previamente se a torneira da


bureta se encontra fechada).

4. Mergulhe os eléctrodos na solução de glicina e registe o valor de pH.

5. Titule a solução de aminoácido até atingir pH=1.5. Para isso adicione o ácido
gota a gota (pelo menos durante os primeiros 5 ml) e registe os valores de
pH após cada adição, agitando suavemente.

6. Lave o eléctrodo com água destilada e mergulhe-o temporariamente num


copo com água destilada. De seguida seque o eléctrodo.

7. Repita os passos 2 – 6, utilizando a solução de 0.1 M NaOH como titulante.


Pare quando chegar a pH=11.5.

8. Lave bem o eléctrodo e deixe-o mergulhado em água.

Repita todo o processo com um 2º aminoácido desconhecido

ANÁLISE DOS RESULTADOS


- A partir dos valores de pH obtidos nas experiências, represente os valores de pH
obtidos em função do volume de ácido ou de base adicionados e em seguida trace a
curva de titulação dos aminoácidos.

Para a glicina:

- Determinar quais os valores de pK e pI obtidos experimentalmente e compará-los


com os valores tabelados

- Indicar as espécies presentes em cada ramo da curva de titulação.

- Nos pontos em que pH = pK, qual é a relação entre a concentração das espécies
presentes.

- Em que gamas de pH se pode usar a glicina como tampão?

Para o aminoácido desconhecido:

- Determinar quais os valores de pK e pI obtidos experimentalmente

- Com base nos valores de pK e pI determinados identificar o aminoácido,


justificando
BIBLIOGRAFIA BASE
 Nelson D.L. & Cox M.M. “Lehninger Principles of Biochemistry” 4th edition.
Bedford, Freeman & Worth. 2004.

INFORMAÇÃO COMPLEMENTAR