1. FUNDAMENTO TEORICO.

Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos micrómetros
de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas, barras y hélices.
Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, no tienen núcleo ni orgánulos internos. Generalmente
poseen una pared celular compuesta de peptidoglicanos.

Son los organismos más abundantes del planeta. Estas se encuentran en todo hábitat de la tierra,
creciendo en el suelo, en cuerpos de agua, en desechos radioactivos, etc. Algunas bacterias pueden
incluso sobrevivir en las condiciones extremas del espacio exterior. Se estima que hay en torno a 40
millones de células bacterianas en un gramo de tierra y un millón de células bacterianas en un
mililitro de agua dulce

Dado el tamaño de las bacterias su observación a con el microscopio óptico muchas veces se
dificulta. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El
modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los
procedimientos que usan un solo colorante llamados de tinción simple. Sin embargo, a menudo se
utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso denominado tinción
diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción a la
tinción Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: Gram (+) y Gram (-).

Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

2. MATERIALES Y REACTIVOS. -
3.1 MATERIALES. -

 2 esponjas
 2 paños
 1 escoba
 3 caja Petri (Por grupo)
 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml
 Algodón
 Papel Kraft
 Gasa
 Cinta adhesiva
 1 mechero bunsen
 1 espátula
 1 probeta de 100ml
 1 aza de siembra
 4 tubos de cultivo
  1 gradilla
 1 pipeta de 10ml
 1 pipeta de 1ml
 3 pipetas Pasteur de 5 ml
 1 pizeta
 1 pinza metálica
 1 termómetro de mercurio
 3 portaobjetos (Por grupo)
 3 cubreobjetos (Por grupo)
3,2 REACTIVOS. -

 Detergente liquido
 Detergente de ropa en polvo
 Solución de hipoclorito de sodio de concentración 1 gr/L
 Solución acuosa de etanol al 70%
 Agua destila
 Agar nutritivo
 Violeta de genciana
 Lugol (Fijador para la violeta de genciana)
 Solución decolorante
 Safranina
3,3 EQUIPOS. –

 Autoclave de carga vertical

 Balanza analítica
 Incubadora
 Hornilla

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. –
1ra Parte (Preparación del laboratorio y de los materiales a usarse)
Para esta parte primeramente se procedió a preparar una solución de hipoclorito de sodio con una
concentración de 1 g/L, una solución con el detergente de ropa en polvo y una solución de etanol al
70%.

Después de esto se procedió a retirar cualquier objeto de la parte del mesón donde se iba a trabajar,
con el mesón vacío se procedió a limpiar este primeramente con agua, después se dejó secar y se
limpió con la solución de hipoclorito de sodio, después se enjuago con agua destilada y se secó el
mesón con los paños.

También se limpiaron las paredes que estaban cercanas al mesón de trabajo, se las limpio con ayuda
de la escoba, después se les aplico la solución de hipoclorito de sodio se dejó actuar por unos
minutos y se enjuago con agua .

Después de haber desinfectado nuestro lugar de trabajo se procedió con la limpieza y esterilización
del material de vidrio , para esto primeramente se lavó todo el material con el detergente líquido y
se retiró todo el exceso de agua que pueda haber en estos después de enjuagarlos, posteriormente se
envolvió las cajas Petri con rectángulos de papel Kraft de 22x32cm , también se hizo un tapón con
algodón ara los matraces Erlenmeyer que contenían la solución con el agar nutritivo del cual se usó
aproximadamente 7 gramos de agar para 250 ml de agua destilada y se los cubrió con unos
capuchones hechos de papel Kraft , en total solo se hizo esto con 2 matraces Erlenmeyer. También
se fizo unos tapones de algodón para las pipetas.

Finalmente, con todo el material listo se introdujeron en la autoclave primeramente las cajas Petri,
los tubos de cultivo y las pipetas para ser esterilizadas antes que el demás material.

Con las cajas Petri, los tubos de cultivo y las pipetas esterilizadas, se procedió a introducir los
matraces con el agar en la autoclave y todo el material restante para su esterilización.

2da Parte (Preparación del medio de cultivo e inoculación de las muestras). –

Con las cajas Petri, los tubos de cultivo y las pipetas esterilizadas y con el resto del material dentro
del autoclave se procedió a realizar la inoculación de las muestras por el método de por siembra en
profundidad, realizando diluciones 1:10 y 1:100 de nuestra muestra de agua contaminada, para
lograr esto se extrajo 1ml del agua contaminada con ayuda de una pipeta y para depositarlo en uno
de los tubos de cultivo.

Posteriormente con la muestra dentro del tubo se procedió a añadir 9 ml de agua destilada agitando
este para que sea una solución homogénea con esto se obtuvo una dilución 1:10.

Finalmente se extrajo 1ml de la solución 1:10 y se depositó este en otro tubo de cultivo añadiendo
también 9ml e agua destilada siempre agitando el tubo para que la solución sea homogénea, con
esto se obtuvo una dilución de la muestra 1: 100.Se realizó este procedimiento dos veces para
obtener 2 tubos con la muestra diluida (dilución 1:100).

Después se procedió a colocar 1 ml de la muestra diluida (dilución 1:100) en las cajas Petri
esterilizadas.

Pasado el tiempo de esterilización del resto del material se vacío el agar en el interior de las cajas
Petri que contenían las muestras hasta que este cubrió toda la superficie de las cajas.

Con el agar y las muestras dentro se procedió a rotar las cajas para que la muestra se mezcle con el
agar aún caliente.

Todo el procedimiento descrito se realizó en cercanías de un mechero bunsen encendido para

mantener la esterilidad en todo momento.

Con todas las cajas Petri listas se llevó estas a la incubadora a una temperatura aproximada de 35 °C
durante 48 horas.

3da Parte (Observación del moho en el microscopio). –

Pasadas las 48 horas se extrajeron las cajas Petri con las muestras de agua, se puedo ver que estas n
había crecido así que se usaron otras muestras, con las cuales se realizó el conteo de unidades
formadoras de colonia por el método del cuadrante en el cual se divido la caja Petri
imaginariamente en 4 ,y se contó cuantas unidades formadoras de colonia existían en uno de los
cuadrantes , después se asumió que la cantidad total de unidades formadoras de colonia era la
cantidad observada en ese cuadrante por 4.
Después de esto se realizó la tinción de Gram para la cual se primeramente se esterilizo el aza de
siembra sometiendo esta al calor de un mechero bunsen hasta que el aza estuvo al rojo vivo,
después con el aza aún caliente se tomó una gota de agua destilada y se la puso en el centro de un
portaobjetos.

Con la gota en el portaobjetos se procedió a tomar una colonia bacteriana de la caja Petri con la que
previamente hicimos el conteo de unidades formadoras de colonia, y se colocó está en la gota de
agua destilada que estaba en el portaobjetos.

Una vez colocada la colonia bacteriana en el portaobjetos se secó el portaobjetos sometiéndolo al

calor de la llama del mechero bunsen hasta que la muestra se opaque. Finalmente se dejó enfriar
esta por un momento.

Con todos los portaobjetos fríos y con las muestras en ellos se procedió a añadir los distintos
colorantes en un orden especifico.

Primeramente, se agregaron aproximadamente de 2 a 3 gotas de violeta de genciana a todos los

portaobjetos luego se dejó actuar por 3 minutos para después enjuagar los portaobjetos con agua
destilada para eliminar cualquier exceso de violeta.

Después se agregaron algunas gotas de lugol a todos los portaobjetos ya que este actúa como
fijador, se dejó actuar por un lapso de 4 minutos y después se enjuagaron los portaobjetos
nuevamente con agua destilada.

Posteriormente se añadió una gota de la solución decolorante a cada portaobjetos y se dejó actuar
por un lapso de 3 minutos para después enjuagar nuevamente los portaobjetos con ayuda de una
piseta.

Finalmente se añadieron algunas gotas de la safranina a cada portaobjetos y se dejó actuar por un
lapso de 1.5 minutos para después enjuagar por última vez con agua destilada.

Después de realizado todo este procedimiento se llevó las muestras al microscopio en el cual se
procedió a observar estas con ayuda de un lente 100x y aceite de inmersión.

4. DATOS EXPERIMTALES. -
Después de haber realizado toda limpieza y desinfección de nuestra área de trabajo, procedimos a
hacer los cálculos para la preparación del agar, en los que vimos que aproximadamente se requieren
7 gramos del agar nutritivo para preparar 250 ml de solución.

Después de haber hecho la inoculación de las muestras y haberlas dejado incubar por un lapso
aproximado de 48 horas pudimos ver que no se había producido un crecimiento de las colonias de
bacterias en nuestras cajas Petri, esto pudo deberse a que las muestras de agua contaminada que
usamos para hacer el cultivo fueron almacenadas durante mucho tiempo a temperaturas bajas y los
microorganismos presentes murieron.

Dado que no pudimos usar las muestras que inoculamos, se nos proporciono una caja Petri en la
cual, si existían varias colonias de bacterias, con la cual procedimos a realizar el conteo de unidades
formadoras de colonia por el método del cuadrante, en la cual pudimos contar aproximadamente 32
unidades formadoras de colonia en el cuadrante representativo, dado esto existían aproximadamente
128 unidades formadoras de colonia en la caja Petri.

Después de esto realizamos la tinción de Gram, para la cual se siguió todo el procedimiento descrito
anteriormente, al realizar esto se pudieron apreciar distintos cambios mientras se añadían los
distintos colorantes. Primeramente, al añadir la violeta de genciana la muestra tomo ese color
violeta, después cuando se añadió el lugol se pudo apreciar que la muestra se tornó más oscura casi
llegando a ser negra, con la solución decolorante la muestra retorno a ser violeta y finalmente con la
safranina la muestra tomo un color algo rojizo.

Finalmente, al observar las muestras con ayuda del microscopio se pudieron observar distintas
formas características como ser las pseudomonas que al ser bacterias Gram (-) adquirieron un color
rojo por la safranina como se puede ver en la figura 1.

Figura 1.- Pseudomonas vistas desde el microscopio

En esta imagen también se puede ver una mancha violeta que probablemente sea tan solo un exceso
de colorante que quedó en la muestra.

También se pudieron observar lo que parecían ser enterocoos fecalis y enterococos faecium ya que
estos presentaban una forma ovalada además de tener un color violeta por la violeta de genciana lo
cual muestra que son bacterias Gram (+) como se pude ver en la figura 2, en este caso las bacterias
se hallaban aisladas, pero también pueden presentarse en parejas o en cadenas cortas.
 Figura 2.- Posibles enterococos vistos desde el microscopio

Estos son algunas de las formas más representativas que pudimos observar en las muestras.

5. CONCLUSIONES. -
Después de realizada la práctica se pude concluir que algunas bacterias como las bacterias aerobias
mesófilas, mueren al ser almacenadas en temperaturas bajas durante periodos largos de tiempo,
como en nuestras muestras de agua contaminada.

También se pudo ver por qué se usan los distintos colorantes, así como el lugol y el decolorante en
la tinción de Gram.

Se pudo llegar a la conclusión que las diferencia que existe en las paredes celulares de las bacterias
hace que estas reaccionen de distinta forma a los distintos colorantes

Se pudo apreciar que aun haciendo la dilución de las muestras de agua 1:10 y 1:100 la presencia de
bacterias aún es muy alta.

6. CUESTIONARIO. -
1.- ¿Qué son las Unidades Formadoras de Colonias?
R.-. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo después de un cierto
tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un grupo de
ellos. Estos reciben el nombre de unidades formadoras de colonia o UFC.
2.- ¿Por qué se diluyó la muestra en relaciones 1:10 y 1:100?
R.-Se realizó esta dilución por que la cantidad de microorganismos presentes en 1ml de agua es
muy grande y al hacer el cultivo con una muestra sin diluir, crecerían demasiadas colonias de
microrganismos en la caja Petri lo cual dificultaría el conteo de las unidades formadoras de colonia.
3.-Detalle la función específica que realiza cada reactivo utilizado en la tinción de Gram
R.-Primeramente la violeta de genciana se usa ya que actúa sobre todas las bacterias que son Gram
(+) , ya que esta se adhiere a las capas de peptidoglicanos presentes en estas.
El lugol es utilizado como fijador para que al añadir la solución decolorante esta no limpie toda la
violeta de genciana.
Y finalmente la safranina se utiliza ya que en las bacterias Gram (-) al existir tan solo una capa de
peptidoglicanos la violeta de genciana no se queda en estas cosas que si hace la safranina dándoles
un color rojizo.
4.-Explique por qué tanto bacterias Gram + como Gram – presentan coloraciones características. ¿A
qué se debe este fenómeno?
R.-Este fenómeno se debe a que en las paredes celulares en las bacterias Gram (-) están
conformadas de distinta forma a comparación de las bacterias Gram (+).
En las bacterias Gram (+) la pared celular está compuesta por hasta 40 capas de peptidoglicanos lo
que hace que la violeta de genciana pueda quedarse en estas capas.
Mietras que en las bacterias Gram (-) al existir tan solo una capa de peptidoglicanos la violeta de
genciana no puede fijarse tan bien, por eso es que se usa la safranina.

8.- Bibliografía. –

Camacho, G., Giles, M., Palao, M., Serrano, B. and Velazquez, O. (2009). Cuenta en placa de
bacterias. [online] Available at: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-
Cuenta-en-placa_6527.pdf [Accessed 1 May 2017].

Anon, (2010). [online] Available at:

https://biologialiga.files.wordpress.com/2008/08/bacteria2010.pdf [Accessed 1 May 2017].

Anon, (2005). MICROBIOLOGÍA CLÍNICA. [online] Available at:

http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema%2002.pdf [Accessed 1 May 2017].

Nombre: Sergio Achacollo

Ítem Puntaje
Objetivos (5 puntos) 2
Fundamento teórico (2 puntos) 2
Materiales y reactivos (10 puntos) 10
Procedimiento experimental (6 puntos) 6
Cálculos y resultados (10 puntos) 10
Conclusiones (5 puntos) 5
Cuestionario (10 puntos) 10
Bibliografía (2 puntos) 2
TOTAL (50 puntos) 47