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Práctica. “Determinación de proteínas por el método de Lowry. Determinación de
proteínas por el método de Bradford”.
Introducción.
Existen diferentes métodos para determinar la cantidad o concentración de proteínas en una
muestra. La mayoría de ellos se basan en: la propiedad de las proteínas para absorber luz en la
región UV, la formación de complejos coloridos y la formación de derivados químicos. Algunos de
los métodos que se analizaran en la siguiente práctica son el método de Lowry y el método de
Bradford.
Método de Lowry.
1. En medio alcalino, los iones de Cu2+, se unen a los enlaces peptídicos de la proteína (al
menos cuatro). Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul.
2. Los grupos fenólicos de los residuos de tirosina de la proteína reducen al reactivo de Folin-
Ciocalteau (mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato), actuando el cobre como catalizador.
El reactivo es de color amarillo y al ser reducido da lugar a un complejo colorido azul intenso.
Método de Bradford.
El método se basa en la unión específica del colorante azul de Comassie brillante G250 (CBBG) a
los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las
proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una
absorbancia máxima a 470 nm.
Figura 1. Estructura molecular del colorante Azul brillante de Comassie G-250. Tomada de Wikipedia.
Resultados.
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Absorbancia (590 nm)
0
0 25 50 75 100 125
Cantidad de proteína (µg)
r=0.9974
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 – 0.0126
Cantidad de proteína=
0.001348
La ordenada al origen tiene un valor de 0.0126, teóricamente tendría que ser de 0.000 debido a que
es la absorbancia del blanco.
La pendiente o sensibilidad tiene un valor de 0.001348, esto nos indica que la variabilidad de la
absorbancia se da con respecto a la cantidad de proteína.
El coeficiente de correlación es 0.9974 el cual nos muestra que nuestros datos tienen una tendencia
muy aproximada a la linealidad por estar cercano a la unidad.
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Tabla 1.1 Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford.
0.7
Absorbancia (595 nm)
0
0 25 50 75 100 125
Cantidad de proteína (µg)
r=0.9591
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 – 0.3097
Cantidad de proteína=
0.002354
La ordenada al origen tiene un valor de 0.3097, teóricamente tendría que ser de 0.000 debido a que
es la absorbancia del blanco.
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La pendiente o sensibilidad tiene un valor de 0.002354, esto nos indica que la variabilidad de la
absorbancia se da con respecto a la cantidad de proteína. Este método presenta mayor sensibilidad
reflejando un valor de pendiente más elevado en comparación del método de Lowry.
ẋ S S2 %C.V. µ
72.991 2.1512 5.1422 2.9473 72.991 ± 1.538
ẋ S S2 %C.V. µ
112.867 6.2922 43.9914 5.5749 112.867 ± 4.500
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Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry.
Tipo de
Cantidad de
Tubo No. Sustancia. A590 interferencia
proteína (µg)
generada.
1 Tris 1 M, pH 7.0 0.123 81.89 Positiva.
No es
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.111 72.99
interferencia.
Detergente comercial
3 0.131 87.83 Positiva.
al 1%
4 SDS al 1% 0.106 69.28 Negativa.
No es
5 TCA al 5% 0.111 72.99
interferencia.
6 Fenol al 1% 1.230 903.11 Positiva.
Mercaptoetanol al
7 0.122 81.15 Positiva.
0.1%
8 Tris 1 M, pH 10.0 0.096 61.86 Negativa.
9 Urea al 5% 0.124 82.64 Positiva.
10 (NH4)2SO4 0.141 95.25 Positiva.
Tipo de
Cantidad de
Tubo No. Sustancia. A595 interferencia
proteína (µg)
generada.
1 Tris 1 M, pH 7.0 0.508 84.23 Negativa.
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.488 75.74 Negativa.
Detergente comercial
3 0.442 56.20 Negativa.
al 1%
4 SDS al 1% 0.446 57.90 Negativa.
5 TCA al 5% 0.535 95.70 Negativa.
No es
6 Fenol al 1% 0.567 109.30
interferencia.
Mercaptoetanol al
7 0.495 78.71 Negativa.
0.1%
8 Tris 1 M, pH 10.0 0.527 92.31 Negativa.
9 Urea al 5% 0.530 93.58 Negativa.
10 (NH4)2SO4 0.454 61.29 Negativa.
6
ẋDiferencia. SDiferencia.
-39,876 6.9978
−39.876
|𝑡𝑐 | = = 18.0198
2.2128
43.9914
𝐹𝑐 = = 8.5549
5.1422
tt=2.262 ; Ft=4.03
Por lo tanto, existen diferencias estadísticamente significativas tanto en la exactitud (t c ≥ tt) como en
la precisión (Fc ≥ Ft).
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Muestra interferencias con
El complejo colorante-
detergentes.
proteína tiene un alto
El colorante Azul brillante de
coeficiente de extinción lo
Comassie G-250 se une
Bradford. cual es imprescindible para
fuertemente a las celdas de
aumentar la sensibilidad en
cuarzo. Por esto se
la medición de proteínas.
recomienda usar celdas de
vidrio o de polipropileno.
Discusión.
Los métodos colorimétricos para la cuantificación de proteínas se basan en medir la absorbancia del
complejo colorido que se forma tras la reacción de la proteína con el colorante. Para un método
colorimétrico se necesita una curva patrón, también llamada curva de calibración, la cual es un marco
de referencia que se construye con cantidades conocidas de proteína, esta se utiliza para determinar
cantidad de proteína presente en una muestra desconocida. En las determinaciones colorimétricas,
existe una relación directamente proporcional entre la intensidad de color y la cantidad de proteína
que la provoca.
Con el desarrollo de la práctica se obtuvo como primer punto la curva de calibración para cada uno
de los métodos realizados, en el método de Lowry se observa una mejor tendencia lineal de los
datos, siendo observable en el coeficiente de correlación 0.9974, en comparación de la curva de
calibración del método de Bradford, coeficiente de correlación igual a 0.9591, asi mismo la pendiente
es mayor en el método de Bradford, 0.002354, indicando una mayor sensibilidad del método, esto
∆𝐴
debido a la siguiente interpretación: la pendiente matemáticamente es , con lo que
∆𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
se deduce que en la misma cantidad de proteína la absorbancia es mayor, y que en menores
concentraciones de proteína el método las puede detectar con una absorbancia considerable.
El análisis estadístico del método de Bradford muestra precisión en cuanto a los datos pero no
exactitud, debido a que la cantidad de proteína esperada era alrededor de 75µg, lo cual nos exhorta
a ser más cuidadosos en el manejo de las preparaciones para tener mejores resultados.
Existen sustancias que pueden interferir en el resultado esperado, esto debido a que el colorante
puede reaccionar de una u otra manera dando un falso resultado. Se evaluaron distintas sustancias
que determinaron si eran interferencias al método o no, usando el intervalo de confianza que nos
proporcionó el análisis estadístico. Para el método de Lowry se observa que se tienen inferencias
positivas al usar Tris 1M pH7, detergente comercial al 1%, fenol al 1%, Mercaptoetanol al 0.1%, urea
al 5% y sulfato de amonio 3%, esto debido a que estos agentes producen la reducción del reactivo,
por ejemplo el fenol es un análogo estructural de la tirosina la cual es un aminoácido que reduce al
reactivo de Folin-Ciocalteau.
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El método de Bradford de acuerdo a nuestros límites de confianza no muestra interferencias, esto
es incorrecto pues se puede atribuir este error al proceso de manipulación de las sustancias al medir
sus volúmenes, ya que estos eran muy pequeños, la agitación no fue la adecuada lo que no permitió
la completa reacción entre la proteína y el reactivo azul brillante de Comassie G-250 y el uso de
distintas celdas que presentaron una desviación en la absorbancia.
Conclusiones.
Gracias al análisis estadístico de los métodos de Bradford y Lowry podemos deducir que si existe
diferencia estadísticamente significativa tanto en la precisión como en la exactitud, siendo
constatables en los resultados expuestos.
Al momento de la elección del método para la cuantificación de proteínas es necesario tener presente
los objetivos, costos, insumos disponibles, tiempo así como analizar los errores que pueden influir
en el método a utilizar, pues de ello dependerá la eficiencia y eficacia de los resultados.
Bibliografía.
Material de apoyo para los estudiantes del curso Bioquímica experimental (0141), Sánchez,
S., consultado el día 30 de Septiembre de 2015, del sitio:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22427.p
df
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.