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5.

CAMBIOS CONFORMACIONALES DEL SUSTRATO DURANTE LA CATALIZACIÓN: EL


ITINERARIO CATALÍTICO

el grupo saliente protonado. Por lo tanto, la forma final de la reacción FEL en la región de productos refleja la
naturaleza del grupo saliente. Esto facilita la interpretación de las parcelas de Hammet / Brønsted de la hidrólisis
catalizada por GH para distintos sustratos de glucósidos.79 Los estudios de QM / MM anteriores, que tuvieron
en cuenta la dinámica de la enzima durante la reacción química, permitieron trazar el itinerario conformacional
detallado que el sustrato sigue durante la catálisis. En el caso particular de la β-endoglucanasa GH16, así como
de otros GH, se encontró que los estados principales a lo largo de la ruta de reacción no corresponden a
"conformaciones canónicas" en el diagrama de Stoddart. Además, el itinerario catalítico preciso (1,4B / 1S3 →
[4E / 4H3] ⧧ → 4C1, Figura 11a) no es una línea recta radial en el diagrama de Stoddart, como se suele suponer,
sino uno deformado. Otras enzimas β-glucanasas retenedoras podrían presentar itinerarios similares alrededor
de la característica 1S3 → 4H3⧧ → 4C1. Es interesante que el criterio catalítico calculado para la β-
endoglucanasa GH16 (1,4B / 1S3 → [4E / 4H3] → 4C1) sea similar a la ruta mínima de energía libre que
conecta los dos mínimos principales del FEL del complejo de Michaelis (1,4B / 1S3 → [E5] / 4H5] ⧧ → 4C1),
cuya intensidad puede predecirse a partir del FEL del sustrato aislado (figura 10a). Esto vuelve a evaluar la
valiosa información "oculta" contenida en el FEL del sustrato aislado, que informa no solo sobre la
conformación del complejo de Michaelis, sino también sobre laconformación de TS, y la
funciónconformacional utilizada para la catálisis. Esta correspondencia se ha utilizado para evaluar / excluir
itinerarios conformacionales en α-L-fucosidasas, 65 β-xilosidasas, 28b y α-manosidasas.47 El análisis de
conformacionales FELs también se ha ampliado para evaluar las propiedades similares a TS de los inhibidores
de GH. 80

6. MECANISMOS CATALÍTICOS DE GLICOSILTRANSFERASAS


Los GT catalizan la formación de enlaces glicosídicos mediante la transferencia de un sacárido,
típicamente un monosacárido, desde un donador de nucleótidos de azúcar a un sustrato aceptor.
Comparado con los GH, los GT exhiben una diversidad mucho menor de pliegues estructurales. La
mayoría de los GT caen en uno de los dos pliegues estructurales distintos (GT-A y GT-B, Figura 12),
81 aunque se han encontrado aproximadamente 73 familias sobre la base de similitudes de
secuencia. Aproximadamente el 65% de todos los GT conocen azúcares activados por nucleótidos
(Leloir GT) y aceptores que varían desde azúcares hasta lípidos y residuos proteicos (O- y N-
glicosilación). Los GT siguen un mecanismo catalítico bi-bi ordenado secuencialmente, mediante el
cual la unión no covalente del sustrato donante al sitio activo es seguida por la unión del sustrato
aceptor, produciendo el complejo ternario enzima-sustrato.82 Para evitar la hidrólisis del
monosacárido activado, la enzima se activa en un estado inactivado hasta el sustrato aceptor está
unido.82b Cuando se forma el complejo ternario, la enzima experimenta un cambio conformacional
que lo activa para la catálisis. En el caso de GT A de tipo plegado, las estructuras cristalinas de la
forma apo 83, así como los complejos con los sustratos dadores o aceptores, 82b, 84 muestran un
plegamiento dependiente de sustrato de un bucle N-terminal muy flexible (Figura 12a).
Típicamente, la unión del sustrato aceptor plega la estructura secundaria
Nterminalloopinapartialαhelixse, mientras que en la ausencia del sustrato, el asa N - terminal está
desordenada y no se ha resuelto por la cristalografía de rayos X. En el caso de los BGB, hay una
transición desde un estado "abierto" a un estado "cerrado" que implica un acercamiento de dos
grandes dominios de plegado de Rossmann (Figura 12b) .85
Figura 12. (a) Superposición de las estructuras cristalinas de tipo AA-3galactosiltransferasa en complejo con
DUP-2F-Gal (PDB2VFZ) 111 y UDP / lactosa (PDB 1GWV) .84 El extremo N-terminal se pliega cuando el
sustrato aceptor está unido en el sitio activo. El bucle N-terminal y la molécula de lactosa se observan en azul.
(B) Superposición de las estructuras "abierta" (gris) y "cerrada" (azul) de la glucógeno sintasa de tipo B,
tomada de PDB 3FRO.

Los GT catalizan la síntesis del enlace glicosídico con dos posibles resultados estereoquímicos:
retención o inversión de la configuración anomérica. La inversión de GTs opera a través de una
reacción de SN2 en etapas de desplazamiento con un catalizador de base general que aumenta la
nucleofilidad del grupo atacante (Figura 13a). Esto es análogo al mecanismo de inversión de GH
(Figura 3a), excepto que el nucleófilo es uno de los grupos hidroxilo aceptor de azúcar y el grupo
saliente es el grupo fosfato del nucleótido. La mayor inversión de un residuo de ácido fosfórico de
TGT o ácido glutámico conserva una desprotonación parcial del grupo hidroxilo aceptor entrante,
convirtiéndolo en un mejor nucleófilo Las mediciones del efecto del isótopo cinético para β-1,4-
GalT86 y α-1,3-FucT, 87 así como los experimentos de inhibición, 88 son consistentes con la
presencia de un TS tipo oxocarbenio, confirmando así una SN2 disociativa. tipo de reacción. Los
estudios teóricos de QM / MM sobre la inversión de β4Gal-T189 y α-GT1390 han dado soporte a un
mecanismo de tipo SN2. Sin embargo, existe controversia con respecto a la identidad de la base
catalítica en el mecanismo de reacción de Olinked N-acetylglucosamine transferase.91 En contraste
con la inversión de GT, el mecanismo de retención de GT no se conoce bien, con dos mecanismos
principales que se discuten actualmente. Por analogía con la retención de GH, se propuso desde el
principio un mecanismo de doble desplazamiento que implica un intermedio de enzima glucosilo
covalente (Figura 13b). En la etapa de glicosilación, una cadena lateral de aspartato o glutamato en
el sitio activo desempeña el papel de un nucleófilo, que reacciona con el carbono anomérico del
azúcar donante y forma un intermediario covalente glucosilado-enzimático. En un segundo paso, la
molécula aceptora ataca al carbono anomérico, rompiendo el enlace covalente glicosilazima y
formando un nuevo enlace glicosídico con retención general de la estereoquímica. Se informó la
existencia de glucosilación enzimática covalente en mutantes de GT tipo A (familia 6 mamífero α3-
galactosiltransferasa, α3GalT y sangre grupo GT) por medio de rescate químico, 92 espectrometría
de masas, 93 y cálculos teóricos en la enzima T de W. 20,94. Sin embargo, la mayoría de las familias
G no donaron una adecuada posición nuclear contra el residuos del sitio activo.