Diagnosticul molecular - aplicatii ale geneticii in medicina legala

“Fiecare dintre noi suntem unici”. Este o realitate care are la baza o serie de
factori intre care factorul genetic detine un rol primordial. Dealtfel, pe baza
caracteristicilor morfologice, oricine stie ca nu este un lucru prea greu sa distingi intre doi
indivizi (cu exceptia , poate, a gemenilor monozigoti). Nu este insa acelasi lucru atunci
cand discutam despre posibilitatea de a diferentia indivizii sau a-i identifica pe baza unor
diferente “invizibile”, biochimice sau genetice.
Landstainer a descoperit grupele sanguine apartinand sistemului antigenic ABO
acum aproximativ 100 de ani iar mai apoi in decursul a 60 de ani mai bine de 30 de grupe
antigenice eritrocitare diferite au fost identificate, facand astfel posibila o oarecare
diferentiere a indivizilor pe aceste baze.Numai ca, sa nu uitam ca abilitatea de a distinge
un individ de altul, prin analiza acestor antigene este totusi cu aplicatie limitata, atat
vreme cat, spre exemplu , in populatiile americane si europene, intre 40 si 50% dintre
indivizi pot sa aiba acelasi grup sanguin (mai exact O). Desigur analizate impreuna, toate
antigenele sanguine au fost si pot fi utilizate pentru testele de paternitate, spre exemplu,
insa doar ca diagnostic de excludere a acesteia de tipul “poate/nu poate fi tatal biologic”.
In plus nu trebuie uitat faptul ca pentru identificarea persoanei prin analiza acestor grupe
sanguine, materialul biologic trebuie sa fie recoltat in conditii optime si sa fie in cantitate
suficient de mare, ceea ce nu intotdeauna este posibil, din pacate, mai ales daca facem
referire la aplicatii din analiza criminalistica.
Viziunea si posibilitatile de investigare in acest domeniu extrem de sensibil cu
implicatii enorme in viata individului si a societatii, in termeni de acuratete si certitudine
a investigatiei s-a schimbat definitoriu in ultimii 20-25 de ani, odata cu descoperirea la
nivelul secventelor de ADN a unor regiuni “hipervariabile”, a unor secvente nucleotidice
ce se repeta de un numar variabil de ori de la un individ la altul.
De-a lungul evolutiei tehnicilor de investigatie in domeniul geneticii, odata cu
intelegerea, cel putin partiala, a mecanismelor ce guverneaza alcatuirea si functionarea
genomului uman, odata cu avantul luat de tehnicile de amplificare a secventelor de ADN,
precum si datorita automatizarii introduse in tehnicile de investigatie a structurii ADN,
identificarea unor particularitati individuale a devenit posibila si a inceput sa fie
exploatata pentru interese stiintifice sau cu aplicatii directe, practice, din ce in ce mai
diverse.
Bazandu-se pe unicitatea indivizilor, conferita si la nivel molecular de catre
variatii in structura unor secvente de ADN, genetica a intrat in randul stiintelor intens
exploatate si utilizate atunci cand vine vorba de domeniul medicinii legale, indiferent ca
ne referim la civil su penal. Dealtfel astazi, nu se mai poate concepe realizarea actului de
justitie, atunci cand vine vorba despre identificarea de persoana, pornind de la probe
biologice apartinand unui/unor indivizi, fara aportul tehnicilor ce tin de analiza
moleculelor de ADN.
 Care sunt insa domeniile de aplicatie ale geneticii in medicina legala?

Exista doua domenii majore de interes pentru medicina legala in ceea ce priveste
analizele moleculare ale secventei moleculelor de ADN: civil si penal.
In ceea ce priveste domeniul civil:
- Analiza filiatiei si ne referim aici in principal la stabilirea paternitatii, caz in care
se pleaca de la probe biologice recoltate de la copil, mama si (Atentie!) presupusul tata
biologic.
- Analiza filiatiei si stabilirea inrudirii dintre indivizi, atunci cand se doreste
identificarea unor resturi umane (a se vedea spre exemplu o serie de catastrofe naturale
sau provocate de catre om, soldate cu victime greu de identificat ulterior).
In ceea ce priveste domeniul penal (mai frecvent):
- Identificarea unor resturi umane, direct, prin obiecte personale sau indirect, prin
analiza filiatiei.
- Identificarea persoanei utilizand probe biologice diverse precum petele de sange,
lichidul spermatic, fire de par, saliva, fragmente de os, tegument, etc. in cazul incercarii
de a determina autorii unor acte criminale (crima, viol, furt).
- Analiza filiatiei atunci cand vine vorba despre acte pedepsite de legea penala
(infanticid, incest).
In materie de analiza a ADN pentru aplicatiile enumerate in medicina legala, o
serie de reguli sunt extrem de importante pentru a putea obtine intai de toate un rezultat,
iar mai apoi rezultatul obtinut sa fie acurat si valid (Atentie! Nu uita ce implicatii poate
avea un astfel de rezultat, indiferent de domeniul de aplicatie!):
- Recoltarea sa fie efectuata respectand toate regulile privind evitarea unei
posibile contaminari a probelor cu ADN strain si sa fie efectuata de personal inalt
calificat care trebuie sa cunoasca foarte bine atat modul de recoltare cat si ceea ce se
intampla mai apoi cu probele pentru a putea intelege de ce trebuie sa lucreze intr-un
anume mod atunci cand recolteaza si manipuleaza probe destinate analizei ADN.
- Incercarea de a obtine la recoltare maximum de material biologic posibil, de
calitate cat mai buna, cat mai putin degradat, de aceasta depinzand mai apoi cantitatea de
ADN obtinut prin prelucrarea probei.
- Personalul care lucreaza in laborator trebuie sa respecte cu strictete maxima
regulile de sterilitate (manusi, calota, masca, halat) pentru a nu contamina probele cu care
lucreaza.
- Etichetarea si evidenta probelor trebuie sa fie de o calitate deosebita pentru a
evita “confundarea” unor probe respectand in acelasi timp dreptul indivizilor la
confidentialitate.
- Pentru toti cei care intra in contact cu probele pe durata analizei acestora pana in
momentul in care se obtine un rezultat, trebuie sa se efectueze analiza ADN si ea sa existe
in bazele de date, pentru a putea fi confruntat profilul ADN al acestora cu rezultatele
obtinute in cazul unei suspiciuni privind posibila contaminare a unor probe in timpul
recoltarii si prelucrarii lor.

Se cunosc astazi doua tipuri majore de secvente hipervariabile localizate in diferiti

loci in genomul uman, ce pot fi utilizate in analiza ADN cu scopul stabilirii “identitatii
genetice”a unei persoane (cunoscut fiind termenul de “amprenta ADN”).
 Primele utilizate in analizele ADN in medicina legala au fost asa numitele VNTR
(variable number of tandem repeats), ceea ce inseamna existenta in anumite “puncte”,
loci pe moleculele de ADN a unor secvente de ADN cu o anumita compozitie in baze
azotate, constituind un “motiv” care se repeta de un numar variabil de ori de la un individ
la altul (spre exemplu la un individ in acelasi locus, aceeasi secventa de ADN se repeta de
12 ori, in timp ce la un alt individ aceeasi secventa se repeta de 40 de ori). Lungimea
secventei (motivului) care se repeta difera de la un VNTR analizat la altul (de obicei intre
17 si 40 de nucleotide), ceea ce diferentiaza indivizii fiind numarul de repetitii de la un
anumit locus al aceleiasi secvente.

Cum anume poate fi determinat numarul de repetitii al unei secvente anume aflata
intr-un anume locus?

Pentru analiza VNTR exista doua posibilitati majore: fie se utilizeaza reactia PCR
utilizand primer-i specifici ce flancheaza zona in care se afla repetitia pentru a amplifica
secventa de interes, urmata de electroforeza pe care se vor vizualiza fragmente de lungimi
diferite functie de numarul de repetitii, fie se utilizeaza digestia ADN cu enzime de
restrictie. Conditia esentiala in acest caz este ca in relativa apropiere a locusului VNTR sa
existe o secventa recunoscuta de o enzima de restrictie specifica. Dupa digestie, are loc o
denaturare a ADN bicatenar, obtinandu-se fragmente de ADN monocatenar. Acesta va fi
hibridizat apoi cu fragmente VNTR specifice, purificate si marcate radioactiv. Se va
reface ADN-ul dublu catenar pe baza de complementaritate, iar apoi fragmentele marcate
obtinute, sunt vizualizate in gel de electroforeza si va fi analizata lungimea acestora,
obtianandu-se un anumit “pattern” de fragmente de lungimi variabile pentru fiecare
individ. Asa cum se poate deduce din cele de mai sus, analiza VNTR poate fi, tehnic
vorbind destul de costisitoare in termeni de timp si bani. Analiza fragmentelor obtinute pe
gel se face vizual, nu este o procedura automatizata ceea ce face, printre altele ca tehnica
de analiza a VNTR sa aiba o serie de dezavantaje, desi constituie inceputul tehnicilor de
analiza a amprentei de ADN, revolutionand la momentul descoperirii lor anchetele
criminale si testele de stabilire a paternitatii.

Un alt capitol in analiza ADN in medicina legala il constituie descoperirea in

genomul uman a unor secventa scurte (3-8 nucleotide) care se repeta de asemenea in
tandem, de un numar variabil de ori de la un individ la altul, raspandite in intreg genomul
in diversi loci pe diferiti cromosomi, secvente numite STRs (short tandem repeat
sequences). In esenta principiul este acelasi ca si in cazul VNTR, insa discutam in cazul
STR de secvente mult mai scurte cu un grad ridicat de heterogenitate in populatia umana,
in termeni de numar al repetitiilor.

Fiecare individ va detine pentru un locus dat doua alele: una materna cu un numar
de repetitii al secventei in cauza, alta paterna cu un alt numar de repetitii (cu exceptia
cazului in care pentru un locus dat individul este homozigot pentru o alela, adica a
mostenit de la ambii parinti alela cu acelasi numar de repetitii pentru secventa in
discutie). Alelele STR (markeri STR) au denumiri codificate conform unui sistem
acceptat pe plan international, de tipul D3S1358 sau D5S818 ca sa luam doua exemple,
D3 sau D5 semnificand numarul perechii de cromosomi pe care se gaseste alela STR.
 Cum anume se realizeaza analiza STR pentru realizarea amprentei ADN a unui
individ?

Astazi aproape intreaga analiza a STR se face automatizat utilizand ca baza

reactia PCR prin care se amplifica locusul/locusurile STR de interes. Apoi fragmentele
obtinute vor fi puse intr-un analizor automat pentru secventare in care se realizeaza o
electroforeza capilara a fragmentelor amplificate (vezi secventarea). In functie de
lungimea fragmentelor, soft-ul care asista analizorul poate sa determine numarul de
repetitii la fiecare locus, obtinandu-se un profil ADN specific fiecarui individ. Se va
obtine astfel o combinatie de alele STR pentru locii analizati, ceea ce reprezinta amprenta
(profilul) ADN al probei sau persoanei investigate. De obicei se analizeaza 9, 13, sau 15
loci STR plus un locus polimorfic la nivelul genei ce codifica amelogenina pentru
determinarea sexului individului caruia ii apartine proba (amelogenina este o proteina ce
intra in structura smaltului dentar fiind codificata de pe cromosmomul X si Y). Se
considera ca evaluarea alelelor STR de pe minimum 9 loci este suficienta in termeni de
putere a discriminarii intre doi indivizi pentru a se realiza identificarea unei persoane.
Bineinteles ca puterea de discriminare va creste cu cat numarul locilor analizati este mai
mare, asa incat in unele cazuri se indica analiza cu un set pentru 15 loci STR. La ora
actuala exista kit-uri comerciale care contin amorsele (primer-ii) pentru amplificarea
simultana a 9, 13 sau 15 alele STR. Alelele (locii) analizate cu ajutorul acestor kit-uri
indeplinesc criteriile pentru ceea ce se denumeste ca fiind un marker STR ideal si anume:

- Secventele care flancheaza regiunea sa fie inalt conservate si specifice pentru a

permite legarea specifica a acelorasi amorse necesare in reactia PCR in cazul tuturor
indivizilor din populatie
- Secventa care se repeta este constituita din 3 - 5 pb
- Produsul de amplificare sa fie mai mic de <350 pb
- % de heterozigoti pentru un locus dat sa fie crescut la nivelul populatiei
- Sa existe alele cat mai numeroase in populatie
- Sa existe o stabilitate a alelelor (numarului de repetitii) in decursul generatiilor
(Conditie esentiala!!!)
- Transmitere independenta fata de alti markeri in decursul generatiilor
- Alelele STR sa fie coamplificabile in aceeasi reactie PCR pentru a asigura
rapiditatea analizei si costuri reduse, precum si reducerea manoperelor efectuate ceea
ce reduce inclusiv riscul contaminarii pe durata efectuarii analizelor.

Analiza profilului obtinut trebuie sa tina cont ca pentru fiecare locus STR
analizat, fiecare individ detine doua alele. Astfel pentru un locus dat putem obtine un
profil heterozigot (spre exemplu 12/15 ceea ce presupune existenta pe un cromosom a
alelei cu 12 repetitii, iar pe celalalt cromosom a alelei cu 15 repetitii) sau homozigot
(spre exemplu 15/15 ceea ce inseamna ca pe ambii cromosomi exista alela cu 15
repetitii). Luati impreuna, 9 loci, spre exemplu, vor duce la o combinatie unica de
alele STR caracteristica fiecarui individ - amprenta ADN a acestuia.
In ceea ce priveste interpretarea rezultatelor, daca discutam despre identificarea
unei persoane careia ii apartine o proba biologica prelevata, intre profilul ADN
obtinut la nivelul probei si profilul ADN al persoanei respective, trebuie sa existe o
concordanta totala. Eventuale neconcordante (prezenta unei/unor alte alele STR), fie
si la nivelul unui singur locus, ridica suspiciunea fie a contaminarii probei, fie a unei
erori de genotipare (amplificare, analiza, etc.), fie proba analizata nu apartine
persoanei in cauza.
In cazul in care discutam despre analiza filiatiei (diagnostic de paternitate spre
exemplu), se tine cont ca pentru fiecare locus in cazul copilului o alela provine de la
mama (mama fiind cunoscuta) iar una provine de la tatal biologic. Astfel, eliminand
pentru fiecare locus alela materna, cealalta alela trebuie sa se regaseasca in profilul
analizat al presupusului tata. Orice neconcordanta, determina excluderea paternitatii.
Daca exista concordanta intre profilul analizat (indiferent ca ne referim la
identificarea unei persoane sau la diagnosticul de paternitate) urmatorul pas il
constituie calculele de probabilitate. Acestea trebuia sa demonstreze ca pentru profilul
ADN rezultat in urma analizei, probabilitatea sa existe un alt individ cu acelasi profil
ADN este mai mica de 1 la 1 miliard de indivizi (ceeea ce se traduce printr-o
probabilitate de peste 99,99%), moment in care rezultatul poate fi declarat valid.
Acest calcul al probabilitatii tine cont de frecventa fiecarei alele STR regasita in
proba/probele analizate, frecventa care este cunoscuta astazi si se regaseste in baze de
date specializate. De aici rezulta necesitatea imperioasa a existentei unor baze de date
nationale cu profilul ADN al unui numar cat mai mare de indivizi, care sa permita
concluzii pertinente cu privire la frecventa unor alele STR in populatia data. Dealtfel
se stie ca exista diferente intre frecventa unor alele in populatia asiatica, caucaziana si
cea de origine africana. Aceste tabele cu frecventele alelice in diferite populatii
constituie baza calculelor de probabilitate utilizate in analiza profilului ADN in
medicina legala.
Uneori, analiza alelelor STR nu se face la nivelul autosomilor, ci se poate practica
analiza microsatelitilor (alelelor STR) de la nivelul cromosomului Y, asa numitele
alele STR-Y. Spre exemplu, in unele cazuri de viol, exista posibilitatea ca analiza
STR-Y sa fie mai facila, marker-ii analizati la nivelul cromosomului Y neputand sa
apartina, bineinteles decat agresorului. Se elimina astfel dificultatile de interpretare
ale profilului ADN obtinut (amestec de ADN apartinand agresorului si victimei) sau
necesitatea unei extractii diferentiale a ADN-ului din celulele epiteliale apartinand
victimei si respectiv din spermatozoizii apartinand agresorului. De asemenea, analiza
poate fi utilizata atunci cand nu se reuseste amplificarea tuturor alelelor STR de la
nivelul autosomilor dintr-un set de STR utilizati in analiza. Trebuie insa stiut faptul ca
analiza STR-Y are si unele dezavantaje, cum ar fi faptul ca, pe linie paterna, in
aceeasi familie, indivizii de sex masculin detin acelasi cromosom Y, deci si aceleasi
alele STR-Y ceea ce poate constitui uneori un inconvenient si reduce puterea de
discriminare (spre exemplu imposibilitatea de a discrimina intre frati sau tata si fiu).
Calitatea ADN obtinut dupa extractie si tipul probei recoltate, constituie una din
marile probleme cu care se pot confrunta cei care lucreaza in laborator. Uneori nu se
poate obtine ADN nuclear (spre exemplu daca se recolteaza fir de par fara bulb sau
daca se preleveaza fragmente de os, mai ales daca acesta este vechi). Alteori
materialul biologic este degradat sau in cantitate extrem de mica. In astfel de situatii,
o alternativa la identificarea prin intermediul analizei ADN nuclear, o constituie
analiza ADN mitocondrial (ADNmt). In fiecare celula exista un numar suficient de
mare de copii de ADN mitocondrial pentru ca in situatiile enumerate mai sus sa se
poata extrage si izola o cantitate suficienta de ADNmt ce va fi supus analizei. La
nivelul ADNmt exista doua regiuni hipervariabile notate HV1 si HV2 unde pot exista
o serie de mutatii punctiforme care pot discrimina intre doi indivizi diferiti. Analiza
acestor regiuni poate permite punerea in evidenta a unei/unor mutatii la un individ, in
timp ce in cazul altuia acestea nu exista sua exista altele. Analiza regiunilor HV1 si
HV2 se face prin “citirea” secventei de nucleotide la nivelul acestor fragmente de
ADN, adica prin secventarea ADN la acest nivel. Trebuie insa tinut cont de faptul ca
frecventa unor mutatii este mult mai mare in populatia umana decat o anumita
combinatie de alele STR in cazul ADN nuclear, ceea ce implicit, scade rata de
discriminare intre doi indivizi. Astfel secventarea regiunilor hipervariabile de la
nivelul ADNmt constituie o analiza “de rezerva” pentru acele situatii in care analiza
ADN nuclear nu poate fi efectuata sau atunci cand nu se poate obtine ADN nuclear.