1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MEDELLÍN

Obtención de extendidos cromosómicos a partir de sangre periférica de mamíferos

Patricia López Gómez2
Ingeniería biológica1,2, Facultad de ciencias1,2, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín
– plopezg@unal.edu.co2

Abril 30, 2018

tripsinización [4]. Otra ventaja que tiene el cultivo de sangre

1. Introducción
. [1], [2], [3]. Una placa con extendidos cromosómicos se puede
obtener a partir de diferentes tipos de células y tejidos, tales
como, médula ósea, biopsia de piel, de pulmón, renal, etc, o de
cultivo in vitro de diferentes células o tejidos como médula
ósea, linfocitos de sangre periférica, células embrionarias,
tejido gonadal, entre otros. En el caso de los mamíferos, se
utilizan principalmente los linfocitos de sangre periférica por la
facilidad en la obtención de la muestra, la disponibilidad del
protocolo de cultivo y la facilidad en el procesamiento de la
muestra. El interés del cultivo de células sanguíneas (linfocitos)
ha facilitado la caracterización de los cultivos en suspensión. El
cultivo de células en suspensión tiene ventajas como la mayor
facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente
(replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante
periférica es que los linfocitos T contenidos en ella, pueden ser
estimulados en cultivo in vitro a entrar a la fase proliferativa
utilizando una lectina de origen vegetal inductora de la división
celular además son los encargados de reconocer material
extraño que haya entrado a las células propias de un organismo,
gracias a receptores de antígenos, por tanto los análisis o
extendidos cromosómicos tienen una amplia importancia
médica, pues permiten hacer un diagnóstico con respecto a
irregularidades numéricas o estructurales. Una vez estimulados,
los linfocitos T pueden dividirse durante varias generaciones las
cuales son requeridas en los protocolos de incorporación de
BrdU para la obtención de bandas R- replicativas. [5]
El intercambio de cromátidas hermanas (ICH) es un proceso por
el cual se intercambia el material genético entre dos cromátidas
de un mismo cromosoma durante el proceso de división celular,
este proceso se lleva a cabo para corregir errores durante la
replicación de DNA, por lo que puede considerarse como un
indicador de daños genómicos. El síndrome de Bloom es una
condición medica en donde el individuo tiene fallas en los
mecanismos de reparación celular, por lo que todos los daños
que puedan surgir mediante la replicación será reparado por
medio de ICH, estos individuos presentan un numero de ICH´s
significativamente mayor a un individuo normal. En los anexos
se puede encontrar el cariotipo de un individuo con síndrome de
Bloom (Figura 1).

Este trabajo tiene como objetivo replicar un protocolo para
obtener un extendido cromosómico, con el fin de conocer y
evaluar la eficiencia de los métodos de tinción ya
estandarizados, para lo cual se realiza un explante sanguíneo y
se determina la cantidad de cromosomas, su forma y tamaño.
2. Metodología
2.1 Toma de la muestra de sangre.
Se realizó la extracción de sangre periférica en vacutainer
heparinizado, de un donante femenino de 27 años de edad,
sana, no reporta uso de medicamentos, con tipo de sangre O
(+) y otra muestra de donante masculino, de 22 años de edad,
sano, con tipo de sangre O (+). La extracción de la sangre se
realizó en altas medidas de asepsia, limpiando varias veces la
zona a punzar con algodones empapados con alcohol, hasta que
el algodón no mostrara rastros de polvo o suciedad.
Adicionalmente, cuando se tiene la muestra de sangre en la
jeringa, se descarta una pequeña cantidad de sangre para
disminuir el riego de contaminación. La muestra de la donante
femenina se destinó para la obtención de bandas R, mientras
que la muestra del donante masculino se utilizó para observar
ICH.
2.2 Siembra de las muestras de sangre.
La sangre se inoculó en el medio de cultivo compuesto por
7800 μl de RPMI 1640 suplementado con 1 ml de suero fetal
bovino, 100 μl de antibiótico y 100 μl de PHA y 1 ml de sangre
para completar 10 ml de volumen final. Para el cultivo del
donante masculino el procedimiento fue el mismo, pero se
adicionó 100 μl de BrdU al inicio de la siembra, teniendo en
cuenta que este no se debe exponer a la luz para evitar su
degradación. Este procedimiento se realizó en cámara de flujo
laminar. Posteriormente el cultivo se incubó a 37,5°C durante
72 horas.
2.3 Cosecha de linfocitos.
Pasado las 72 horas, se realizó la cosecha de linfocitos. A los
cultivos seleccionados para realizar bandas R se les adicionó 6
horas antes 2 mg/ml de BrdU. Una hora antes de la cosecha se
adicionaron 100 µL de colcemid a los cultivos para detener el
ciclo celular en metafase. Pasado el tiempo, se re-envasó el
cultivo en un tubo Falcon de 15 mL y se centrifugó durante 7
minutos a 1000 rpm para separar los glóbulos blancos de los
glóbulos rojos, se retiró el sobrenadante con una pipeta
teniendo cuidado de no perder la nube de linfocitos encontrada
en la superficie del pellet y se re-suspendió el precipitado con
solución hipotónica KCl 0.075 M hasta aforar 9 ml, esto con el
objetivo de explotar todas las células presentes en la muestra,
excepto los linfocitos. y se incubó durante 7 minutos más a 37
ºC, nuevamente se centrifugó la muestra bajo las mismas
condiciones, se descartó el sobrenadante y se re-suspendió el
pellet.
2.4 Fijación de las muestras.
Para realizar la fijación de las células se preparó 100 ml de
solución fijadora, metanol y ácido acético en proporción 3:1,
de esta solución se agregó 7 ml con agitación fuerte y constante
previniendo la formación de grumos, se dejó reposar 7 minutos
y se centrifugó durante otros 7 minutos a 1000 rpm, se descartó
2
el sobrenadante y se re-suspendió en solución fijadora también
con agitación fuerte y se repitió este proceso cuatro veces (las
necesarias hasta obtener un sobrenadante translúcido). La
muestra se almacenó a -20ºC durante 48 horas, pero se aclara
que no es necesario y se podría continuar el proceso de
inmediato.
2.4 Goteo de las muestras.
Se descartó el sobrenadante y se re-suspendieron las células en
4 gotas de fijador y al mismo tiempo se limpiaron los
portaobjetos rigurosamente con etanol con el fin de identificar
el lado liso del portaobjeto luego se introdujeron en agua con
hielo. Se elaboraron placas tomando una pequeña cantidad de
muestra. Se dejo caer dos o tres gotas de la muestra celular
sobre la superficie del portaobjetos fría. Se bateo por uno de los
extremos del portaobjetos se dejaron secar a temperatura
ambiente y con la flama de un mechero las pequeñas gotas
acumuladas. El choque térmico y mecánico género el estrés
debía ocasionar la separación de los cromosomas en las placas.
2.5 Tinción de las muestras.
Posteriormente, las muestras del donante femenino se le agregó
una solución de solución 2xSSC, un colchón de sales para
amortiguar el pH y proteger de la desecación y temperatura
generada por la lampara. Luego, cada placa fue sometida a
iluminación con una lámpara durante 45 minutos, a una
distancia de alrededor de 30 cm. Pasado este tiempo, las placas
fueron lavadas con agua destilada y secadas mediante agitación
suave luego se tiñeron con Giemsa al 5% (v/v). Una placa
durante 2 minutos y otra durante 30 segundos, se removió el
exceso de colorante con agua destilada y las placas fueron
flameadas para fijar. Finalizado el procedimiento, se observó
cada placa en microscopio óptico.
En cuanto a las muestras del donante masculino, se siguió el
procedimiento descrito en el Protocolo de bandeos
cromosómicos del Laboratorio de Genética y Biotecnología
Animal de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín
para el intercambio de cromátidas hermanas [8]. Las placas se
sumergieron durante 5 minutos en un gel que contiene
fluorocromos que desestabilizan el enlace entre el Br y el
núcleo pirimídico, haciendo más fácil su conversión a uracilo.
Posteriormente las placas fueron lavadas con agua destilada. A
cada lámina se le agregó una solución de solución 2xSSC,.
Luego, cada placa fue sometida a iluminación con una lámpara
durante 25 minutos, a una distancia de alrededor de 30 cm.
Pasado este tiempo, las placas fueron lavadas con agua destilada
y secadas con mediante agitación suave. Posteriormente se
agregó una solución de Giemsa diluida al
5% (v/v), durante 2 minutos para luego lavarlas con agua
destilada, secarlas con el mechero y observar las placas en
microscopio.
3. Resultados
Algunos errores durante el procedimiento impidieron obtener
los resultados esperados. Para hallar el índice mitótico y que sea
estadísticamente representativo se debe realizar el conteo de al
menos 1000 células en total [9]. En el caso de la tinción para
detectar ICH's no fue posible determinar el índice mitótico en
ninguna de las muestras, la mayor parte de los núcleos
observados se encontraban inactivos, estos núcleos inactivos se
diferencian de los núcleos activos en que tienen un tamaño
 3

menor y la coloración es más oscura. El número de núcleos

activos observados en una de las placas fue inferior a las 20
células y 0 en la segunda placa. En la placa donde se encontró
núcleos activos se detectó una célula con la cromatina muy
condensada, este fue el único intento de mitosis que se encontró
y no permite determinar el número cromosómico del individuo
que donó la sangre.

Figura 4. Fotografía de núcleos activos, tinción para bandas R.

4. Discusión

Las muestras se recolectaron en heparina que actúa como

anticoagulante, saber la concentración de esta en mamíferos es
Figura 1. Núcleos inactivos de linfocitos en tinción importante ya que a altas concentraciones puede resultar
para ICH. 4x. citotóxica y bajas concentraciones causa coagulación, ambos
casos dan extendidos cromosómicos de mala calidad [6]. El
primer factor fundamental que se controlo fue la asepsia ya que
con esta se garantiza la no contaminación del cultivo y este se
logró ya que el color rojo se mantuvo (cuando se contamina se
observa muy oscura). El RPMI 1640 es el medio de cultivo
frecuentemente utilizado para células de mamíferos y al
suplementarse con suero fetal bovino este le aporta factores de
crecimiento y hormonas que estimulan el crecimiento y
funciones celulares [7].
La selección del mitógeno que se usa depende de lo que se
desee estimular los más usados son las lectinas vegetales
concanavalina A y Fitohemaglutinina; la actividad biológica de
distintas preparaciones de lectinas comerciales es variable por
lo que se debe estandarizar una concentración óptima para la
estimulación miogénica. Esta concentración óptima se define
con una curva de dosis-respuesta en la que encontraron un pico
máximo de ~100 μg/mL, concentración elegida para el
Figura 2. Núcleos inactivos de linfocitos en tinción protocolo [8]. Y en nuestro caso la fitohemaglutinina es el
para ICH, 10x.
mejor estimulador de diferentes subpoblaciones de linfocitos
contenidos en la sangre. En el laboratorio se prepara un
extracto crudo a partir de frijol cargamento seco La ventaja que
tiene el extracto crudo de fitohemaglutinina con respecto a la
que se adquiere comercialmente, es que esta última es una sola
lectina purificada, mientras que en el extracto se encuentra un
grupo de lectinas que aumentan la probabilidad de estimular
linfocitos T en especies no estudiadas.
Para evitar que la célula continúe con la división y obtener
cromosomas metafásicos se usan antimitóticos, en este caso se
usó colcemid, que inhibe la polimerización de los microtúbulos,
esenciales la mitosis. Esta función inhibidora de la mitosis ha
sido muy importante para el estudio del ciclo celular y la
citogenética. Existen otros antimitóticos como la colchicina, la
selección del antimitótico dependerá de los objetivos de la
práctica; López y Márquez (2002) Afirman:
Figura 3. Cromatina condensada en tinción para ICH.
40x

“De un lado, el colcemid produce una estructura
menos compacta y la colchicina produce efectos de
compactación más rápida, por lo tanto, dependiendo
de los objetivos del experimento, se puede
seleccionar uno u otro compuesto. En algunos casos
se pueden combinar el bromuro de etidio a
concentraciones de 5ug/ml más el colcemid durante
1 h para lograr extendidos por metafásicos de alta
resolución combinado con alto número de mitosis.”
[5]
Un problema generalizado que se presentó en los resultados fue
que no se lograron observar mitosis en ninguna de las muestras.
Una de las causas de error es en el tiempo de exposición a la
solución con KCl pues al ser una solución hipotónica hace que
la célula se hinche con el agua y puede causar daño estructural
en los cromosomas. Otros protocolos publicados con el mismo
fin proponen un tiempo de exposición a esta solución de 20
minutos [9]. Esto no quiere decir que los donantes presenten un
índice mitótico bajo ya que los donantes tienen un buen estado
físico, hábitos saludables etc. Así que la no presencia de mitosis
se puede deber al tiempo de exposición de las sustancias
mencionadas. Por lo que se propone probar diferentes tiempos
de exposición de la solución hipotónica para obtener
cromosomas metafásicos.
El proceso de fijación no presentó inconvenientes. El goteo en
ambos casos fue el paso más complejo de realzar y es con el
golpe mecánico que se logra que los cromosomas no queden
superpuestos en campo visual, sino que se separen para un
correcto conteo anexo 1 y 2. Posteriormente la tinción
deferencial no presento inconvenientes y se logra la
observación de núcleos activos en tinción para bandas R e ICH,
pero no mitosis. La incorporación del Brdu en diferentes
tiempos hace la diferencia entre ambas técnicas de tinción. Para
bandas R estos tiempos de exposición a BrdU también son
importantes cuando se desea evaluar la cinética proliferativa de
los linfocitos con el fin de determinar la duración de las fases
del ciclo o el tiempo promedio de ciclo. Mediante esta técnica,
en la fase S del ciclo, se pueden determinar 6 estadios
replicativos: cuatro estadios corresponden a la fase S, uno a la
fase G1 y otro a la fase G2.
Teniendo en cuenta que durante la fase S la eucromatina se
replica primero que la heterocromatina, el BrdU se agrega 6
horas antes de la cosecha, de esta forma se logra diferenciar las
partes del cromosoma constituidas por cada uno de los tipos de
cromatina. La exposición a la luz de la lampara logra
descomponer el BrdU a nucleótidos de uracilo y como la
tinción de Giemsa es efectiva para coloreas los ácidos
nucleicos, concretamente uniones Adenina-Timina, las partes
que no tenían BrdU aparecen con una coloración más oscuras,
mientras que las partes de la cromatina que se sintetizaron en
presencia del BrdU presentan una coloración menos intensa
[10]. Este mismo principio es el que permite diferenciar las
cromátidas en el ICH, pero en este caso, las cromátidas
originales están constituidas con Timina, por lo que presentaran
una coloración más intensa respecto a la cromatina que re
sintetizo luego de la siembra en presencia de BrdU. En el caso
de bandas ICH, se agrega BrdU al inicio de la siembra, el BrdU
en un análogo de la timina, que, por competencia y
concentración, será el constituyente que remplazará a la timina
4
en las nuevas hebras de DNA que se repliquen. De esta forma
será posible distinguirlas mediante un proceso de tinción
especial. Un ejemplo de ICH se presenta en los anexos como
Anexo 1.
Conclusiones
 La fijación, el goteo y la coloración, son los pasos
más importantes si se quiere hacer un correcto
extendido cromosómico, en la experimentación
no se realizaron bien estos pasos, así la
observación de cromosomas no fue preciso.
 El protocolo, tal y como está estandarizado, es
aún susceptible de ajustes que mejoren los
resultados finales.
Referencias
[1]Y. Wang, C. Li, C. Yao, L. Ding, Z. Lei and M. Wu, "Techniques
for Investigating Molecular Toxicology of Nanomaterials", Journal of
Biomedical Nanotechnology, vol. 12, no. 6, pp. 1115-1135, 2016. [2]M.
Ronne, "SYMPOSIUM: CYTOGENETICS AND CELL
BIOLOGY Chromosome Preparation and High Resolution Banding
Techniques. A Review", Journal of Dairy Science, vol. 72, no. 5, pp.
1363-1377, 1989.
[3]"Detection of chromosome aberrations in the human interphase
nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and
non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy
18 with probe L1.84.", Human genetics, vol. 74, no. 4, pp. 346-352,
1986.
[4] Soluciones Cultivos Celulares Protocolos y técnicas, 1st ed. cultek,
2016.
[5] Bautista and M. Márquez, "Modelo experimental para el estudio
cromosómico en células de mamíferos", bdigital, 2018. [Online].
Available:
http://www.bdigital.unal.edu.co/12239/1/juanbautistalopezortiz.2014.
pd f. [Accessed: 28- Abr- 2018].
[6]. S.A., B. (2018). ¿QUÉ ES LA HEPARINA? | Bioibérica S.A.U.
[online] Bioiberica.com. Available at:
https://www.bioiberica.com/salud-humana/heparina/heparin-
science/la-heparina-y-bioiberica/que-es-la-heparina/ [Accessed 29
Apr. 2018].
[7] A. Carbajal, "Medios de cultivo celular: una revisión", Labome.es,
2017. [Online]. Available: http://www.labome.es/method/Cell-
CultureMedia-A-Review.html. [Accessed: 29- Abr- 2018].
[8] V. Ruiz Álvarez, M. Boffill Cárdenas, O. González González, M.
del Pino and F. Blanco Machado, "Efecto inmunomodulador de la
fitohemaglutinina de Phaseolus vulgaris”, Revista Cubana de
Investigación biomédica, vol. 24, no. 1, pp. 5-13, 2005.
[9] Google Books. (2018). Manual de prácticas de genética y cuaderno
de trabajo. [online] Available at:
https://books.google.com.mx/books?id=N23ND-
S2E7gC&dq=manual+de+practicas+de+genetica&printsec=frontcove
r&source=bl&ots=Id2N7VqTfX&sig=PDQ0DjYEKzDlkvHHV3Hn
QvpnmKM&hl=es&ei=9k0qS_OIDseVtgf7lYWLCQ&sa=X&oi=bo
ok_result&ct=result#v=onepage&q=manual%20de%20practicas%20
de%20genetica&f=false [Accessed 29 Apr. 2018].
[10] Uco.es. (2003). Departamento de Biología Celular, Fisiología e
Inmunología. (secc. Biología Celular) Prácticas de "Bases Celulares de
la Respuesta al Medio". 3º Ciencias Ambientales. Curso 2003/2004.
[online] Available at: http://www.uco.es/~bc1gorej/rinconpractico.htm
[Accessed 26 April.
2018].
 5

Anexos

Anexo 1. Tinción diferencial de cromátidas hermanas y

detección de ICH. A la derecha, imagen de un cariotipo a un
individuo con síndrome de Bloom, donde el individuo no tiene
mas mecanismos de reparación que el ICH.

Anexo 2. Tinción diferencial Bandas Replicativas