TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA

Y ESTUDIO DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos

métodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible
cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo
demicroorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir unamuestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivosmicrobianos. A l
efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo,
existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren ycontaminen los cultivos en
estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también
lascondiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo
se debe ajustar el pH yconcentración de sales y durante la incubación condiciones
tales como la temperatura, aireación, la luminosidad. La aplicación de estos
procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos,
así comosu aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo,
el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de
sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósitoespecífico
del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de

éste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio controladas. La población de
microorganismos desarrollada en un medio se denominacultivo. Cuando éste
contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o
axénico, cuandocontiene más de una especie de microorganismos se denomina
cultivo mixto.

.Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es

conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo
axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
Los cultivos axénicosson muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.

Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener

un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los
microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los
instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no
deseados ocontaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda
ser axénico. El segundo paso paraobtener un cultivo axénico es inocular o
introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del
resto y se podrámultiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por
una población de células descendientes de unsolo microorganismo. Una colonia
es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficiede
un medio sólido.Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo
en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un medio de cultivo nuevo, de
otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En
estatransferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y concentración o carga
microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:

Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o

boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle
o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o
gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación,

hisopos, pipetas o pipetaspasteur que deberán esterilizarse previamente. La
utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo
tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo:

Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con

tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido
mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se
deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los
microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la
superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo
de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de
microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las
poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite
estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en
ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.

Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra

(asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y
cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente
42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se
emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la
separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.

Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la

cantidad o de las necesidades, despuésde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten
en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando lasuperficie del
agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse
forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les
denominan colonias, las que presentancaracterísticas que varían con el tipo de
microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de
cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría
de losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH
alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el
crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este
mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones
adecuadas para el microorganismoen estudio. El crecimiento óptimo de los
microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están
relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por
debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos
hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una
incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto
que para lo microorganismos que presentan su crecimientoóptimo a temperaturas
entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a
temperaturaambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las
necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los
microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con
aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo
tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en
incubadora no debe prolongare por más de nueve días.

Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en

presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se
llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno
sedenominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las
dos condiciones y se le conocecomo facultativos. Existe una cuarta categoría que
comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando éste
existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos.

El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de los

cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias
reductoras o equipos especiales.Las bacterias son organismos procarióticos, se
encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo,
en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre.
Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como
parásitos, comensales o mutualistas.Fisiológicamente este grupo presenta
características muy variables, hay bacterias móviles e inmóvilesfotosintéticas y
quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de
temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos
algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño,
morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación
de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características
culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de
desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.

Técnicas de siembra
Método de siembra por estría en placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello,
con un asa de siembra se tomauna muestra de la población mixta y a continuación
se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólidopreparado en una placa
Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme
se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la
superficie del medio menosmicroorganismos. A continuación, se flamea el asa, se
toca en la región donde se han realizado las últimasestrías y se continúa la
siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún.
Repitiendo esteproceso varias veces se logra separar células individuales. A
continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las
células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado
de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron
depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para
asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el
procedimiento a partir deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias
que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con todaseguridad, cultivos
axénicos.

Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de

su siembra en placa. Se siguenestas técnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por
ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida
10

veces paraobtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por
tanto, se realizan diluciones seriadas (envarias etapas), normalmente de diez en
diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez endiez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana

a 9 ml (de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita
vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea
necesario. A continuación, sepuede proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar

fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y
otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán
más grandes.

En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se

siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con
avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el
agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las
placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de
siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las
placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método
del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las
dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener
un mayor número decolonias aisladas que el método de siembra por estría, por
tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con
varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axénico mediante este
método:

(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una

muestra con sólo unos pocoscientos de bacterias-

(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el

contenido en una placa Petri.

(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y

en su superficie (más grandes).

Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo
axénico:

(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.

(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa
Petri, y

(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un

segundo grupo de estrías enuna región nueva de la placa. Repetir el proceso una
tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y
se separen células aisladas.

(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro

de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia
aislada y sembrar por estrías una segunda placa.