Requisitos de ATP para el crecimiento y el mantenimiento debacterias oxidantes de hierro

Resumen: Se propone un modelo metabólico simple de bacterias oxidantes ferrosas basadas en equilibrios
bioquímicamente estructurados de ATP y NAD (P) H para calcular el rendimiento máximo y el mantenimiento del
ATP. Se obtuvieron valores similares de rendimiento de crecimiento y mantenimiento usando datos de consumo
de hierro ferroso y / u oxígeno en cultivos de Acidithiobacillus ferrooxidans sobre hierro en diferentes
condiciones. Cuando la pirita era la única fuente de energía, el rendimiento de crecimiento era mayor, lo que
sugiere que las células podrían obtener energía a través de la oxidación de los compuestos de azufre. Los valores
de los rendimientos de crecimiento para los cultivos de Leptospirillum ferrooxidans en el hierro fueron un poco
menores que los obtenidos para A. ferrooxidans, aunque dentro de los errores experimentales. Los coeficientes
de mantenimiento del ATP para ambas bacterias fueron similares y comparables a los observados en
microorganismos heterotróficos. Este hecho es realmente sorprendente teniendo en cuenta el alto gradiente de
protones que deben mantener este tipo de microorganismos.

Palabras clave: Chemoutotrophes; Crecimiento microbiano; Fisiología; Modelado; Bacterias oxidantes de hierro;
Bioenergética

Introducción Acidithiobacillus ferrooxidans (anteriormente, Thiobacillus ferrooxidans) parece ser uno de los
microorganismos mesófilos dominantes en la oxidación de sulfuros minerales. Esta bacteria cataliza la oxidación
de hierro ferroso y compuestos reducidos de azufre, incluido el azufre elemental. A diferencia de A. ferrooxidans,
las células vibrioides de Leptospirillum ferrooxidans no son capaces de oxidar el azufre, pero poseen una alta
afinidad por el hierro ferroso y, en consecuencia, mayor tasa de oxidación del hierro ferroso con altos potenciales
redox que la de A. ferrooxidans. Además, las células de L. ferrooxidans son menos sensibles a la inhibición del
hierro férrico [1,2]. Aunque algunos aspectos del proceso aún no se han dilucidado, se ha establecido la vía para
la oxidación del hierro en A. ferrooxidans. Esta bacteria fija el CO2 y oxida el ion ferroso para obtener energía
para el crecimiento y mantenimiento, usando O2 como aceptor de electrones. El azufre, el sulfuro, el tiosulfato
y el ácido fórmico pueden actuar como donantes de electrones en lugar de iones ferrosos. La fijación de CO2 se
realiza a través del ciclo de Calvin, mientras que el ATP y el NAD (P) H requeridos para este proceso se obtienen
a partir de la oxidación de Fe2 + [3,4].

En varios estudios con A. ferrooxidans [5-11] y en menor medida con L. ferrooxidans [11-13] se han publicado
datos sobre los rendimientos máximos y el mantenimiento del oxígeno o del hierro ferroso. Estas cantidades,
aunque son buenos indicadores de la eficacia del crecimiento, tienen en común que se basan en una descripción
macroscópica del crecimiento, es decir, no se hace referencia a los procesos que realmente ocurren dentro de la
célula. Un enfoque más fundamental considera que el metabolismo microbiano se compone de vías catabólicas,
donde la energía de los sustratos se convierte en ATP que, a su vez, se emplea para las vías anabólicas
responsables de la síntesis de biomasa. Los parámetros clave en este enfoque son el rendimiento máximo de
crecimiento y el mantenimiento de ATP. El conocimiento de estos parámetros permitiría una mejor comprensión
de la fisiología de las bacterias oxidantes de hierro. En este trabajo, proponemos un modelo metabólico simple
de bacterias oxidantes ferrosas basadas en balanzas bioquímicamente estructuradas de ATP y NAD (P) H. Se
presentan los valores de rendimiento máximo y mantenimiento de ATP, basados en datos experimentales de
varios autores.

2. Reacciones metabólicas y balances de masa El crecimiento bacteriano se puede describir mediante una serie
de ecuaciones simples que representan la asimilación del carbono fuente en la biomasa, y la generación de
energía a través de catabólico reacciones [14,15]. Dentro de este formalismo, tasas específicas de consumo
tienen valores negativos, mientras que la tasa específica de producción tiene valores positivos.
 El CO2 y el amonio son fuentes de carbono y
nitrógeno respectivamente para las bacterias
oxidantes de hierro (IOB). Por lo tanto, la ecuació
para la síntesis de biomasa es

CO2 + 0.2NH3 + h1 NAD (P) H + C1 ATP →

CH1.8O0.5N0.2 (1)

donde CH1.8O0.5N0.2 representa la fórmula para

IOB biomasa, C1 la cantidad (mol) de ATP
necesaria para síntesis de un C-mol de biomasa y
h1 la cantidad de NAD (P) H necesario para la
asimilación reductora de CO2.

UN El equilibrio del grado de reducción muestra

que h1 = γx / 2, donde γx es el grado de reducción
de la biomasa [16,17]. Está bien documentado que
IOB obtiene energía del oxidación de iones
ferrosos, o compuestos reducidos de azufre,
usando O2 como aceptor de electrones final. La
energía libre proporcionada por la reacción redox
se utiliza para impulsar la síntesis de ATP [3]. La
ecuación que describe este proceso es:

2Fe2 + + 1 2O2 + 2H + → 2Fe3 + + H2O + (P / O)

ATP (2)

donde (P / O) representa el número de moles de ATP sintetizados por átomo gramo de oxígeno. Según White
[18], la síntesis de un ATP se combina con la extrusión de 3H + en IOB. Por lo tanto, el valor máximo de P / O es
2/3. Por otro lado, el NAD (P) H requerido para la síntesis de biomasa se obtiene a través de la oxidación

Fe2 + 2Fe2 + + NAD (P) + + C3ATP → 2Fe3 + + NAD (P) H (3)

Debido al potencial redox de Fe3 + / Fe2 + (ácida pH) y NAD (P) + / NAD (P) H pareja (a pH citosólico), la reducción
de NAD (P) + debe tener lugar mediante transporte de electrones reverso. La energía necesaria para este proceso
es proporcionada por hidrólisis de ATP [19]; por lo tanto, C3 representa el ATP requerido por mol de NAD (P) H
producido. Finalmente, se considera una reacción que describe el ATP consumido para el mantenimiento:

ATP → ADP (4)

Sea v1, v2, v3 y v4 las velocidades de reacción específicas de las reacciones (1) - (4), respectivamente. Los
balances de masa para CO2, biomasa, NAD (P) H, ATP, O2 y Fe2 + producen:
 donde μ representa la tasa de crecimiento
específica, mATP el coeficiente de
mantenimiento en ATP y Qi la tasa de
consumo específico del compuesto i.
Asumiendo la hipótesis del pseudo estado
[17], no se produce acumulación neta de ATP
y NAD (P) H en la biomasa, por lo tanto, los
lados izquierdos de las Ecs. (7) y (8) son cero.

Del conjunto de Ecs. (5) - (11) se pueden obtener las siguientes relaciones:

Eqs. (12) y (14) representa los saldos de carbono y grado de reducción de todo el sistema, respectivamente. En
Eq. (13), C1 + C3 (γx / 2) representa la cantidad total de ATP necesaria para sintetizar un C-mol de biomasa,
incluida la cantidad
necesario para la transferencia ascendente de electrones de Fe2 + a NAD (P) +, por lo tanto:

donde ymax x / ATP es el rendimiento máximo de crecimiento en ATP, entonces Eq. (13) puede reescribirse
como:

Al combinar Eqs. (14) y (16) se puede obtener una ecuación similar que relacione QO2 y μ.

De la ecuación (12), es evidente que los valores de -QCO2 pueden emplearse en lugar de μ en las ecuaciones.
(16) y (17). Estas ecuaciones se pueden generalizar fácilmente para donantes de electrones que no sean Fe2 +.
En ese caso, el primero y el segundo término del lado derecho de la ecuación. (16) debe dividirse por γS, y γS es
la cantidad de electrones transferidos a O2 por mol (o C-mol) del donador de electrones. Eq. (17) tiene lo
mismo independientemente de
el valor de γS. Eqs. (16) y (17) se consideran iguales a la ecuación de velocidad lineal introducida por Pirt [20]
para la tasa de consumo de sustrato. El rendimiento máximo de crecimiento (o rendimiento de crecimiento
verdadero) y el coeficiente de mantenimiento se obtienen ahora en términos de parámetros energéticos
celulares básicos. En el caso de IOB, las ecuaciones de Pirt se pueden expresar como [13]:
donde ymax x / Fe2 +, ymax x / O, mFe2 + y mO son los rendimientos máximos de crecimiento y coeficientes de
mantenimiento en Fe2 + y O2, respectivamente. Al comparar estas ecuaciones con Ecs. (16) y (17), Ecs. (20) -
(23) se derivan:

3. Cálculos
En esta sección, los datos de crecimiento de IOB, tomados de varios documentos anteriores, se analizan y
discuten a través del modelo presentado anteriormente.
No es posible estimar los tres parámetros energéticos yx / ATP, mATP y la relación operacional (P / O) para la
fosforilación oxidativa usando la ecuación (Eq. (16) (o Ec. (17)) porque solo hay dos coeficientes
independientes, la pendiente y la intersección en y. Uno de esos parámetros debe conocerse para calcular los
demás. El máximo (P / O) para IOB es 2/3, aunque este valor se puede alcanzar solo cuando el grado de
acoplamiento es uno que es incompatible con la eficacia óptima para la fosforilación oxidativa [21]. Según
Roels [17], la máxima eficacia termodinámica en bacterias se alcanza cuando el grado de acoplamiento es de
0,91, lo que conduce a un funcionamiento (P / O) que oscila entre 63 y 72% del valor máximo. Suponiendo el
último valor, el resultado operativo (P / O) resulta ser 0,48 moles de ATP (g átomo de oxígeno) -1. No existen
razones estrictas para elegir el límite superior, solo la vida de estilo de IOB, que representa uno de los límites
termodinámicos más estrechos para el crecimiento bacteriano. De todos modos, la elección del límite más alto
o más bajo no modifica sustancialmente las conclusiones que se muestran más adelante. Nagpal y Dahlstrom
[6] estudiaron el efecto de la tasa de dilución en la lixiviación bacteriana del concentrado de mineral de pirita /
arsenopirita en un proceso continuo. Evaluaron la tasa volumétrica de consumo de CO2 y O2 y la concentración
de proteína de biomasa en g l-1. Durante el nuevo cálculo en base C-mol, se asumieron 25,8 g por C-mol y un
contenido de proteína de biomasa del 50%. Este último valor se incluye dentro del rango de 48 a 66%
reportado para T. ferrooxidans [5]. De todos modos, como señalaron Babel y Muller [22], las variaciones en el
contenido de proteínas (y otros polímeros) en la biomasa tienen un efecto menor sobre las "fórmulas de
biomasa".

La correlación entre -QCO2 y la tasa de dilución (D), que es igual a μ en el proceso continuo en estado estable,
se muestra en la figura 1. La figura muestra claramente que la línea recta tiene una pendiente muy cercana a
uno, lo que está de acuerdo con Eq . (12) La correlación entre -QO2 y -QCO2 se representa gráficamente en la
figura 2. Los datos están bien ajustados por una línea recta, de acuerdo con la ecuación. (17) Con el valor
supuesto (P / O) de 0.48, es posible calcular el rendimiento máximo de crecimiento y el mantenimiento de ATP.
Los valores se muestran en la Tabla 1. Las tablas 1 y 2 muestran otros valores de rendimiento máximo de
crecimiento y mantenimiento de Fe2 + y O2 para A. ferrooxidans y L. ferrooxidans informados en la literatura y
los valores de ymax x / ATP y mATP calculados a través de ellos . Los valores de ymax x / ATP de 0.053 a 0.064
C-mol de biomasa (mol ATP) -1 se obtuvieron para A. ferrooxidans que crecen en hierro. La concordancia es
altamente satisfactoria teniendo en cuenta que los datos utilizados a través de los cálculos se obtuvieron en
cultivos en diferentes condiciones (pH, concentración de hierro y modo de operación). El valor más alto en la
tabla (0.072 C-mol de biomasa (mol ATP) -1) se obtuvo usando pirita como única fuente de energía y difiere de
los otros donde el único dador de electrones es hierro ferroso. Aunque es necesario obtener resultados más
experimentales, de acuerdo con ese valor, A. ferrooxidans que crece en pirita parece ser capaz de obtener más
energía que la que es posible a través de la oxidación del hierro ferroso.
Esto sugiere que el exceso de energía podría generarse a través de la oxidación
de compuestos intermedios de azufre formados durante la oxidación de pirita. Esto estaría de acuerdo con el
mecanismo de tiosulfato propuesto para explicar la biolixiviación de pirita [23].
Los valores de ymax x / ATP para L. ferrooxidans se muestran en la Tabla 2. En este caso, los valores de ymax x /
Fe y ymax x / O se informan para los mismos experimentos. Por lo tanto, es posible calcular ymax x / ATP ya sea
de la ecuación (20) o Eq. (22) Los valores obtenidos a través de cada ecuación deberían ser los mismos debido a
las ecuaciones. (20) y (22) no son realmente independientes porque están vinculados a través del equilibrio del
grado de reducción. Precisamente, la Tabla 2 muestra que ambos valores de ymax x / ATP, usando ymax x / Fe
o ymax x / O, son muy similares, lo que indica una alta calidad de las mediciones experimentales y la validez de
nuestro modelo.
Los valores de ymax x / ATP obtenidos para L. ferrooxidans parecen ser un poco más bajos que los de A.
ferrooxidans. Sin embargo, teniendo en cuenta las discrepancias entre los valores obtenidos para diferentes
experimentos, se necesitan más datos para concluir que esas diferencias son realmente significativas y no se
producen por errores experimentales. El rendimiento máximo de crecimiento sobre ATP de IOB es muy bajo
cuando se compara con bacterias heterótrofas que crecen, por ejemplo, en medio mínimo de glucosa. En este
caso, normalmente se encuentran valores alrededor de 0,50 C-mol de biomasa (mol ATP) -1, es decir, 10 veces
los valores promedio informados aquí para ambas bacterias. Sin embargo, esta imagen cambia cuando estos
valores se comparan con el rendimiento teórico máximo de ATP, ymt x / ATP. Los valores de 1.17 y 0.102 C-mol
de biomasa (mol ATP) -1 se han reportado para el crecimiento en glucosa y en CO2 (con transporte de
electrones reverso), respectivamente [24]. Por lo tanto, en este contexto, IOB son tan eficientes como las
bacterias heterotróficas para la síntesis de biomasa. Teniendo en cuenta que los errores estándar son en
general muy altos, los coeficientes de mantenimiento en ATP de A. ferrooxidans y L. ferrooxidans pueden
considerarse similares y, además, comparables a los encontrados en microorganismos heterotróficos como S.
cereviciae (0.051 mol ATP (C-mol biomasa h) -1) o E. coli (0.178 mol ATP (C-mol biomasa h) -1) [25]. Este hecho
es bastante sorprendente porque el pH interno de las bacterias oxidantes de hierro es 6.5, mientras que el
crecimiento generalmente tiene un pH de alrededor de 2. Por esta razón, la bacteria tiene que mantener un
gran gradiente de protones, lo que implicaría un mayor costo en ATP. Por lo tanto, parece que estos
organismos poseerían algunos mecanismos desconocidos para hacer frente a dicho gradiente de pH. Se ha
sugerido [18] que IOB regula su pH interno mediante el consumo de protones citoplasmáticos durante la
respiración, más bien mediante el bombeo de protones a través de la membrana, como sucede con otros
microorganismos aeróbicos.