UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS,

BIOQUIMICAS Y BIOTECNOLOGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERIA
BIOTECNOLOGICA

Asignatura:

Biotecnología Animal

Tema:

Informe de Practica N°12

Alumno:

Torres Díaz Gustavo Adolfo

Arequipa – Perú
2016
DIAGNOSTICO INMUNOLOGICO PARA LA ENFERMEDAD NEOSPORA BOVINA MEDIANTE
LA PRUEBA DE ELISA
P.P. Ingeniería Biotecnológica F.C.F.B.Q Y B, Campus UCSM, Arequipa, Perú
Torres Díaz Gustavo Adolfo
RESUMEN: En esta práctica se evaluó la
presencia o no del protozoario de la neospora bovina en
muestras de suero bovino con la prueba inmunológica de
ELISA con bloqueo.
PALABRAS CLAVE: ELISA bloqueo, neospora
bovina.
ABSTRACT: In this practice has been
evaluated the presence or not of protozoan Neospora in
bovine samples bovine serum ELISA immunoassay with
Lock
Keywords ELISA immunoassay with Lock, Neospora in
bovine
INTRODUCCIÓN
La neosporosis bovina, conocida como
neosporosis fetal bovina o neosporosis
abortiva bovina, es una enfermedad
ocasionada por Neospora
caninum, protozoario perteneciente a la
familia Sarcocystidae, subfamiliaToxoplasmati
nae. Esta enfermedad ha sido reportada en
países desarrollados, así como en países
latinoamericanos, tales como: México,
Colombia, Brasil, Perú, Chile, Paraguay y
Argentina. En las últimas décadas ha sido
descrita como una de las principales causas de
abortos y de pérdidas económicas de la
ganadería bovina (Bos taurus-indicus). Los
abortos pueden presentarse desde los tres
meses de gestación hasta el final de la misma,
aunque la incidencia más alta ocurre entre los
cinco y seis meses de gestación. En rebaños
lecheros, el impacto económico radica
principalmente en la pérdida de los fetos,
reemplazo de vacas con registros de abortos,
incremento en el intervalo entre partos y
disminución en la producción de leche
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MARCO TEÓRICO
ETIOLOGÍA:
Neospora caninum es un parásito protozoo del
grupo de las coccidias y muy próximo a
Toxoplasma.
- Ciclo evolutivo Perros y bóvidos son
hospedadores intermediarios, en los que se
produce una reproducción asexual bajo la
forma de taquizoítos, que se encuentran dentro
de múltiples células, y de bradizoítos, que se
encuentran en los quistes intracelulares en
tejido nervioso.
- Otra fase se produce en el perro, que es
además el hospedador definitivo, en el cual
después de la ingestión de carne bovina cruda
(quistes tisulares) se produce una reproducción
sexual en su tracto digestivo, excretando gran
cantidad de ooquistes no esporulados al medio
con las heces.
- Una tercera fase se produce en el medio
exterior, donde, una vez excretados los
quistes, van a esporular dentro de las 24 horas
siguientes. La resistencia al medio de dichos
ooquistes aún no se conoce en la actualidad.
TRANSMISIÓN:
- Vertical: por vía transplacentaria, por lo que el
parásito pasa de la madre al feto durante la
gestación. Esta es la vía más importante (95%
de los casos).
- Horizontal: por vía oral, puede producirse la
infección tanto por la ingestión de leche que
contiene taquizoitos, como por la ingestión de
ooquistes esporulados presentes en el medio,
en el alimento o en el agua de bebida. El perro
elimina ooquistes durante poco tiempo y en
baja cantidad. Es la vía menos importante (5%
de los casos).
SIGNOS CLÍNICOS:
2
Reabsorciones embrionarias, momificaciones
y abortos. Mortinatalidad y afecciones
neonatales con encefalopatías y miositis. Si la
Neospora queda en estado de latencia puede
no haber signos clínicos, pero sí una evidencia
serológica, y en ocasiones histopatológica. Se
calcula que la Neosporosis es responsable de
un 10 a un 15% de abortos bovinos, que suelen
ocurrir en mitad de la gestación.
LESIONES:
A nivel de SN: encefalomielitis no purulenta de
distribución multifocal. Miositis, lesión en
hígado (70% de abortos).
DIAGNÓSTICO:
- Diagnóstico fetal:
- Histología: la lesión de cerebro es
patognomónica Inmunohistoquímica (cerebro,
corazón, hígado, pulmón), en desuso.
Serología fetal de fluido corporal. PCR.
- Serología: suero, leche.
TRATAMIENTO, PREVENCIÓN y CONTROL:
No existe tratamiento efectivo, aunque se ha
valorado la utilización de decoquinato, pero con
resultados poco consistentes.
- Medidas: Reducción de la transmisión
horizontal (contaminación ambiental). Evitar el
acceso de perros a restos de placenta, y evitar
la contaminación del alimento con heces de
perro.
- Serología de todos los efectivos y manejo en
dos rebaños, las positivas y las negativas. Del
grupo de positivas, si hay un nivel de abortos
elevado, se eliminarán cuanto antes. Si el nivel
de abortos es bajo, se dedicarán las positivas
a cruces cárnicos y nunca ellas ni su
descendencia a reposición.
TECNICA DE ELISA
El ELISA es una técnica que se basa en el uso
de un antígeno o un anticuerpo marcado con
una enzima; al estar uno estos componentes
marcado y fijado a un soporte, se interrumpe la
reacción antígeno-anticuerpo, posteriormente
se le agrega un sustrato específico sobre la
enzima que producirá un color determinado
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observable a simple vista o cuantificable por un
espectrofotómetro o analizar la reacción
antígeno anticuerpo. Existen diversos tipos de
ELISA los que se marca el anticuerpo: directo,
indirecto, sándwich: Doble, Heterólogo.
En cuanto a los pasos generales de un ELISA
primero se tapizada el antígeno o anticuerpo,
luego se agrega la muestra problema con la
mezcla de antígenos o anticuerpos, se une el
antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo
o antígeno ya tapizado, lavado para eliminar el
exceso no unido. Adición del anticuerpo
secundario marcado con la enzima, unión del
anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
,lavado del pocillo para eliminar el exceso de
enzima no adherida , adición del substrato,
unión del substrato a la enzima, para luego
obtener la coloración color
ELISA directo: En este se fija el antígeno al
soporte, se lava para eliminar los no fijados,
luego se adicionan los anticuerpos marcados
con la enzima para que reacción con el
antígeno y que solubilizado el complejo, se lava
para eliminar anticuerpos que no reaccionaron
y se agrega un sustrato específico para la
enzima, al final se observa la coloración.
ELISA indirecto: En este la diferencia viene
dad que a nivel que el elemento marcado por
la enzima es un anti-anticuerpo que va a
reaccionar con el anticuerpo, que reacciono
junto al antígeno previamente fijado;
finalmente agrega un sustrato específico para
la enzima, se lava y se observa la coloración.
ELISA sándwich doble: Se fija al soporte el
anticuerpo específicos del antígeno en el suero
problema, posteriormente se añade el suero
problema y los antígenos de fijan a los
anticuerpo, luego se lava para eliminar
elementos no fijados, posteriormente se
añaden anticuerpos conjugados con una
enzima(de diferente epítopo a los previamente
fijados) estos reaccionan con los antígenos de
la muestra problema que se encuentran fijados
a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se
añade un sustrato a la enzima marcadora y se
observa el color visual o por colorimetría, en
cuanto al ELISA sándwich triple la diferencia
viene dada por que los segundos anticuerpos
que se colocan no son marcados con la
3
enzima, si no que luego se coloca anti-
anticuerpos conjugados con la enzima que
reaccionaran con los anticuerpo que se
colocaron luego, posteriormente se lava y se
coloca el sustrato especifico para la enzima.
ELISA Competitivo: Fijación de anticuerpos
específicos al soporte anticuerpos, adición en
concentración conocida de una mezcla de
antígenos del anticuerpo utilizado en el paso
anterior, marcados con una enzima y antígenos
desconocidos (objeto de estudio).Al mismo
tiempo, añadir únicamente antígenos del
anticuerpo usado en el paso anterior,
marcados con una enzima, lavar. Agregar un
substrato sobre el que sea capaz de actuar la
enzima marcadora. Se puede parar la reacción
si se desea. Lectura visual o colorimétrica del
producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de
ambas pruebas son iguales, el antígeno a
estudio no tiene nada que ver con los
anticuerpos empleados en el soporte. Si hay
diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el
antígeno objeto de estudio, está relacionado
con el anticuerpo empleado para tapizar el
soporte y la diferencia de absorbancia o
densidad óptica, es proporcional a la
concentración del antígeno problema.
Métodos específicos
Para lograr el tapizado de antígenos y
anticuerpos de diluye el antígeno o anticuerpo
en tampón carbonato (pH 9,6) y se incuba
luego durante 3h a 37°C o 16h a 4°C, también
de puede incubar a 40-50°C en tampón fosfato
(PBS) o en agua fisiológica tamponada pH 7,2-
7,4. En cuanto a la solución de lavado se
elaborara una solución salina con Tween 20
como agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma
se debe conjugar la enzima, esta debe de
poder unirse fácilmente a antígenos y
anticuerpos, un substrato cromogénico o
fluorogénico conveniente. Las enzimas más
utilizadas son las fosfatas alcalina, peroxidasa
de rábano y ß-galactosidasa.
Métodos de lectura de resultados
Colorimetría: En estos ensayos se obtiene un
producto de reacción coloreado que absorbe
luz, siendo la densidad óptica (DO) del mismo
proporcional a la cantidad de producto medido.
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Para todos los ensayos enzimáticos, la etapa
final es la adición del substrato enzimático, este
es escogido por su rendimiento en la reacción
enzimática. Para ensayos colorimétricos, la
tasa de desarrollo de color es proporcional,
dentro de un cierto rango, a la cantidad de
conjugado enzimático presente.
Fluorescencia: La fluorescencia es una
variación de la colorimetría en este un producto
de reacción emite fluorescencia cuando es
excitado a una determinada longitud de onda,
siendo las unidades relativas de fluorescencia
(fotones de luz emitidos) proporcionales a la
cantidad de producto analizado. En
comparación con los métodos colorimétricos,
los ensayos de fluorescencia son ligeramente
más sensibles y, sufren a cambios de pH,
temperatura, restos de detergente en el lavado
y concentración iónica. Lo que lo hace mas
funcional es que amplia el rango de medida en
cuanto al obtenido en los ensayos
colorimétricos.
Luminiscencia: En este proceso la enzima
actúa sobre un sustrato generando un producto
capaz de emitir fotones en lugar de generar un
color visible, este proceso se define como la
capacidad de emitir luz por parte una sustancia
esta puede ser mediante una reacción química
(quimioluminiscencia), mediante una longitud
de onda (fotoluminiscencia= florescencia) o
mediante un producto al ser degradado
(bioluminiscencia).
Para poder interpretar los resultados, se puede
observar el color a simple vista, pero el ojo
humano no es capaz de notar la variación de
0,1 de densidad óptica, por eso se usa el
espectrofotómetro para poder así cuantificar
los resultados. Es importante resaltar que las
soluciones ELISA es un método de
inmunodetección que se utiliza para detectar
diversas patologías animales y vegetales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales contenidos en el kit
 Placas de Elisa cubiertas con antígeno
para Neospora
 Control positivo
 Control negativo
 Conjugado anticuerpo unido a enzima
HRP (Horseadish peroxidasa)
4
  Buffer para la dilución del conjugado
 Solución concentrada de lavado
 Solución sustrato
 Solución de parada (stop)
Materiales no incluidos en el kit
 Pipetas simples
 Pipetas multicanal
 Tubos de prueba o placas de
transferencia vacías
 Papel toalla
 Botella de lavado automático
 Reloj
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO DEL MATERIAL
 Dejar el kit con todos los reactivos y sueros
a temperatura ambiente antes de empezar
la prueba
Figura N°1: Sueros de diferentes bovinos
puestos a temperatura ambiente
Figura N°2: Reactivos propios del kit de
ELISA puestos a temperatura ambiente
 Preparar las placas con la respectiva
identificación
 Preparar el conjugado: Se diluye una parte
de conjugado por 99 partes de buffer para
dilución de conjugado
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 Preparar la solución de lavado: Diluir una
parte de la dilución de lavado con 9 partes
de agua destilada o agua desionizada
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:
 En la placa preparada depositar 50 ul de los
controles positivo y negativo en cada pocillo
 Depositar los 50 ul de los sueros problema
en los siguientes pocillos de la placa de
ELISA
Figura N°3: Pocillos ya llenados con los
controles y sueros
 Incubar la placa a T° ambiente (21 a 25°C)
sin cubrir la placa durante una hora
 Descartar el contenido y lavar la placa con
la solución de lavado preparado (3 veces)
 Adicionar 50 ul de conjugado a cada pocillo
 Incubar por 20 minutos a temperatura
ambiente
 Descartar el contenido y lavar nuevamente
(3 veces)
 Adicionar el sustrato e incubar a
temperatura ambiente por 20 minutos
 Sin descartar el contenido adicionar
inmediatamente la solución frenado
(solución stop)
 Leer la densidad óptica (D.O) en un
espectrofotómetro o lector de placas con un
filtro de 620, 630 o 650 nm
RESULTADOS
Se distribuyó de la siguiente manera los controles
y las muestras de suero en los pocillos:
1 2
A (-) (-)
B (+) (+)
C Furia
D Domica
E Coquis
F Gratis
5
 G Celima
H Norma
De una de las muestras se pudo realizar el análisis
en el espectrofotómetro obteniéndose las
siguientes absorbancias:
 ELISA indirecto. Las placas ELISA se
Control (-) = 0.195
Muestra = 0.342
De lo que se pudo calcular el porcentaje de
inhibición de la siguiente manera
% I = 100 – [((D.O. Muestra x 100)/ D.O. Control (-)]
% I = 100 – [((0.142 x 100)/ 0.195)]
% I = 27.18
Al obtenerse un valor menor al 30 % la inhibición es
negativa
CONCLUSIONES
 La técnica de ELISA por bloqueo es
muy eficiente ya que actua de manera
competitiva
 Se obtuvo que la muestra de suero dio
negativa por el método de ELISA por
bloqueo
ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Explique sobre la diferencia entre la
prueba Elisa directa e indirecta
indique las ventajas y desventajas de
cada una de ellas.
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos
capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en
las que se sospecha se encuentra el
antígeno. Se incuban con anticuerpos
marcados. Indican la presencia de antígeno
en la solución analizada. Es necesario incluir
controles negativos que serán muestras del
mismo tipo que las analizadas (sangre,
orina...), pero en las que se tenga la certeza
de la ausencia del antígeno buscado.
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Asimismo se incluyen controles positivos
(soluciones donde se encuentra el antígeno
buscado)
preparan de la misma forma a la anterior.
Los controles positivos y negativos son los
mismos. El sistema de detección emplea
dos anticuerpos: uno primario contra el
antígeno y uno secundario marcado contra
el primario. La detección tiene mayor
sensibilidad por presentar una amplificación
de señal debida a la unión de dos o más
anticuerpos secundarios por cada primario.
Es el ensayo más popular, como lo es la
inmunofluorescencia indirecta, pues un
mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimático permiten cuantificar una
gran variedad de antígenos; por eso es un
método más polivalente y barato, aunque se
pierda algo de precisión por tener un
eslabón más con respecto al método directo.
La dilución de la solución que contiene el
anticuerpo primario —por ejemplo, suero
sanguíneo— es un factor muy importante a
tener en cuenta para evitar la aparición de
falsos negativos, ya que, si la muestra está
muy diluida, no saldrá positiva si la titulación
de anticuerpos es muy baja. (Es decir,
aunque los anticuerpos están presentes, la
prueba no da positivo porque la
concentración de anticuerpos específicos
contra el antígeno que está pegado en el
fondo del pocillo no es suficiente como para
dar una señal detectable.).
El ELISA indirecto es el método de
elección para detectar la presencia de
anticuerpos séricos contra el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), agente
6
 causante del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Según esta técnica, proteínas
recombinantes de la envoltura y el
núcleo del VIH se absorben como
antígenos en fase sólida a los pocillos.
Las personas afectadas de VIH
producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. En
general, el ELISA indirecto permite
detectar anticuepos séricos contra VIH
desde las primeras seis semanas de una
infección.
VENTAJAS
 La prueba de ELISA directa es
rápida en comparación con la
prueba indirecta, ya que sólo
utiliza un único anticuerpo. El
ELISA indirecto requiere una
etapa adicional de incubación
con un segundo anticuerpo
durante el procedimiento de
ensayo, lo que provoca un
retraso en la obtención de
resultados.
 Una amplia gama de
anticuerpos secundarios
marcados está disponible
comercialmente. Además, es
posible crear varios anticuerpos
primarios en una especie dada
y utilizar el mismo anticuerpo
secundario para la detección.
Esto hace que el ELISA
indirecto sea fácil de realizar
DESVENTAJAS
 En el ELISA directo, los
anticuerpos primarios tienen
que ser específicamente
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preparados para reaccionar con
el antígeno específico que
están presentes en la muestra.
Esto hace que el ELISA directo
sea desventajosa en
comparación con la prueba
indirecta.
 La prueba directa de ELISA es
menos sensible que la forma
indirecta de la prueba porque
no es la amplificación de
la señal mucho menos.
2. A que se llama Elisa de competencia.
Ventajas y desventajas.
En este método, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el conjugado
por un número limitado de sitios de unión
del antígeno. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrará a la enzima porque
el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra.
Ventajas:
 Menos interferencias, más específicos
y sensibles
 Instrumentación menos costosa
 Admiten mayor tamaño de muestra,
así disminuye el límite de detección.
 Más versátiles en cuanto a tipo de
analito
Desventajas:
 Más difíciles de automatizar
 Mayor tiempo de análisis
3. En que consiste la prueba de Elisa
de captura y en que la prueba de
Elisa sándwich. Cuáles son sus
ventajas y desventajas.
Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos). Se trata de un
7
 ensayo muy empleado en el que se recubre
el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de
anticuerpo se aplica la muestra problema
en la que se encuentra el antígeno, que
será retenido en el pocillo al ser reconocido
por el primer anticuerpo. Después de un
segundo lavado que elimina el material no
retenido se aplica una solución con un
segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.
Así pues cada molécula de antígeno estará
unida a un anticuerpo en la base que lo
retiene y un segundo anticuerpo, al menos,
que lo marca. Este ensayo tiene una gran
especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo.
4. Definir que es el sustrato.
específico sobre la enzima que producirá
un color determinado observable a simple
vista o cuantificable por un
espectrofotómetro o analizar la reacción
antígeno anticuerpo.
ajustarlos a una dosis de 1mg/mL. •
Marcado de los anticuerpos con la enzima
mediante el uso de un agente puente que
normalmente suele ser el glutaraldehído o
el del mperiodato sódico (apenas existen
diferencias entre ellos en cuanto a los
resultados finales).
BIBLIOGRAFIA
 Review of Neospora caninum and
neosporosis in animals. Dubey, J.P., The
Korean Journal of Parasitology, Vol. 41,
nº 1, p. 1-16. March 2003.
 ELISA. Springer. Consultado el 30
de marzo de 2016.
 «Direct ELISA.». Methods in
molecular biology (Clifton, N.J.)
 «ELISpot and DC-ELISpot Assay to
Measure Frequency of Antigen-
Specific IFNγ-Secreting
Cells.». Methods in molecular
biology (Clifton, N.J.)

5. Definir que es el conjugado.

La enzima escogida como marcador debe

unirse fácilmente a antígenos y
anticuerpos, encontrarse en estado puro a
un precio razonable y tener un substrato
cromogénico o fluorogénico conveniente y
de fácil preparación. Las enzimas más
utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa
de rábano y ß-galactosidasa; a
continuación, se muestra una tabla con las
ventajas y desventajas de cada una así
como los substratos que se emplean con
cada una de ellas. Las operaciones de
marcado o conjugación, llevan implícitas
dos etapas: • Purificación de los
anticuerpos a partir de un antisuero bruto
mediante una precipitación generalmente
salina de las proteínas del antisuero,
seguida de una diálisis y purificación de la
fracción de anticuerpos mediante filtración
molecular, cromatografía o separación en
gradiente de densidad mediante
ultracentrifugación. Finalmente, se suele
concentrar los anticuerpos purificados y

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