TRABAJO DE BIOQUIMICA

TEMA: CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECULAR.

PRESENTADO POR: ERICKNEY RIOS ESCAMILLA.

IVONNE HERNANDEZ VERGARA.
MARIA ISABEL CANO MARTINEZ.
FRANCISCO REVUELTAS MARTINEZ.

PRESENTADO A: FERNANDO MENDOZA.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA.
FACULTAD DE INGENIERIAS.
INGENIERIA DE ALIMENTOS.
IV SEMESTRE
2018
 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR.

La purificación de una sustancia de interés se hace siguiendo los criterios de separación

basados en alguna propiedad física o química que diferencia al compuesto en cuestión de
otros que en principio estarían ligados a él.
La cromatografía de filtración en gel, más corrientemente llamada de exclusión molecular,
es una técnica de purificación muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia
en la resolución de mezclas complejas de macromoléculas. Esta técnica puede utilizarse
con buenos resultados con fines analíticos (por ejemplo, para la determinación de pesos
moleculares).
.
Principio. Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus
diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un
gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas
cadenas de polímeros unidas entre sí por enlaces químicos para formar una red
tridimensional.
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio
quedando listo para su uso.

En el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirse varios volúmenes

- El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado.
- El volumen de matriz (Vg)
- El volumen de vacío (Vo), o el volumen de agua existente entre las esferas del gel (fuera
de ellas).
- El volumen ocupado por el agua en las esferas del gel (Vi), que se expresa como la
diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo-Vg.

Cuando una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se hace pasar a través de la

columna de gel, se produce la separación en virtud del siguiente principio:
- Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que
componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha
pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt).
Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las
esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla
de la columna.
Teniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tamaño está, en general,
relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en
función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesadas.
Grados de los Geles
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles
utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas
poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Las sustancias de peso
molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas sino que se extraen conjuntamente con
el volumen vacío (Vo), las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total
(Vt), las más pequeñas que dicho rango.
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 Factores que influyen en la separación

Además de la diferencia intrínseca de tamaño existente entre las moléculas que van a ser
cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una correcta separación de las
mismas:
- Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño
aumenta con la longitud de la columna.
- Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que
son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2
y 10 cm h-1.
- El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeño comparado con el volumen
total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de
muestra iguales o menores al 5% del volumen total.
- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran
profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado
homogéneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Caracterización del comportamiento cromatográfico de un soluto

Los resultados de la cromatografía de filtración en gel se expresan habitualmente en forma
de gráficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en función del
volumen de líquido extraído de la columna (Fig. 3).

Se pueden utilizar varios parámetros para caracterizar el comportamiento cromatográfico

de una sustancia:
- Volumen de elución (Ve). Se define como el volumen de líquido necesario para extraer
una determinada sustancia. Presenta el inconveniente de depender fuertemente del
volumen total de la columna. El Ve de una sustancia varía entre Vt y Vo.
- Coeficiente de distribución (Kd). Es el parámetro más correcto y también el más
ampliamente utilizado. Indica la fracción del volumen interior accesible a un compuesto
específico. El Kd de una sustancia se define como:
Kd = Ve-Vo/Vt-Vo
El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fracción
de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su
tamaño.
 Además, el coeficiente de distribución está relacionado con el logaritmo del peso molecular
de un soluto, a partir de su Kd, cromatografiando por filtración varios patrones de peso
molecular conocido.

Ventajas de la CEM:

1. Permiten el intercambio de búfer y la desalación.

2. Permite la separación de especies similares (por ej. especies truncadas y oligómeros) que
pueden no ser separables mediante otras técnicas de purificación.
3. Es compatible con muchos solventes.
4. No depende de ninguna propiedad específica de la proteína para su retención y elución.

Desventajas de la CEM:

1. Su rendimiento es muy sensible al empaque de la columna.

2. Puede haber interacciones no específicas entre la proteína y la resina, lo que disminuye
la resolución.
3. Baja resolución para mezclas complejas de proteínas.
4. La muestra debe ser sembrada en un volumen pequeño para obtener una resolución
adecuada. Esto puede ser problemático para proteínas que precipitan en altas
concentraciones.
Optimizar las condiciones de la CEM para alcanzar una máxima resolución a menudo puede
ser laborioso, pero algunos factores pueden tener un impacto enorme sobre la resolución

Aplicación de cromatografía por exclusión molecular en proteínas

La cromatografía de exclusión molecular separa las proteínas en función de su radio
hidrodinámico, una propiedad determinada tanto por el tamaño como por la forma de la
molécula. A diferencia del resto de los procedimientos cromatográficos descriptos
previamente, las proteínas no se unen a la fase estacionaria en la CEM. En cambio, las
proteínas se separan por la velocidad a la cual navegan a través de la fase estacionaria
inerte.

La CEM es un método valioso utilizado, generalmente, en el paso final del esquema de

purificación, gracias a su habilidad de separar las diferentes especies de una proteína.
Especies oligoméricas, moléculas de proteínas desplegadas, y especies truncadas pueden
ser separadas de la proteína nativa al mismo tiempo que se cambian los componentes del
búfer. A menudo, la CEM se utiliza como un método más veloz y más confiable que la
diálisis, ya que es compatible con una gama de solventes más amplia y además requiere
de menos búfer. Un único solvente es utilizado a lo largo de todo el proceso de CEM y las
fases estacionarias comerciales disponibles son compatibles con la mayoría de los
componentes de los búferes más utilizados.

Elución y análisis de la proteína

Métodos de elución de proteínas
Las proteínas que se unen a la fase estacionaria son eluidas con condiciones de solvente
que rompen esas interacciones. Estas condiciones de elución varían tanto con el tipo de
cromatografía como con las propiedades de la proteína de interés. Existen tres métodos
generales para la elución de proteínas: elución en grupo, elución por partes y elución en
gradiente lineal. El mejor método a elegir depende del tipo de cromatografía que se está
haciendo y de la resolución requerida.

 En grupo - una sola condición de elución desplaza a todas las proteínas unidas en
un solo paso. Este mecanismo funciona mejor para procedimientos cromatográficos
basados en una interacción específica (por ej. la cromatografía de afinidad). La
elución en grupo no ofrece ninguna resolución, pero es ideal para eliminar los
contaminantes de manera rápida. Requiere de un conocimiento previo de las
condiciones de búfer necesarias para desplazar la proteína de interés.
 En pasos - se realizan múltiples eluciones en grupo de manera secuencial, con
condiciones menos permisivas en cada caso. En la elución en pasos, el número de
fracciones colectadas depende del número de condiciones de eluciones
secuenciales. La elución en pasos provee mejor resolución que la elución en grupo,
pero peor resolución que la elución en gradiente lineal.
 Gradiente lineal - múltiples fracciones consecutivas son recolectadas mientras se
ajustan las condiciones de elución de manera lineal. Un gradiente lineal ofrece la
mayor resolución para las cromatografías de intercambio iónico y de fase reversa.
Típicamente se recolectan un gran número de fracciones consecutivas.
La cromatografía de exclusión molecular no requiere de ninguno de estos métodos de
elución, ya que las proteínas no interaccionan con la fase estacionaria. La proteína se
siembra en la columna y un gran número de fracciones se recolecta hasta que todas las
proteínas hayan eluido, sin alterar las condiciones del búfer a lo largo del procedimiento.
Idealmente, el búfer de elución de una columna es compatible con la columna que le sigue,
eliminando la necesidad de intercambiar búferes o de dializar entre los diferentes pasos de
purificación.

INTRODUCCION
 La cromatografía es una de las operaciones fundamentales de la química gracias a su
versatilidad y simplicidad para separar mezclas que no se pueden resolver por métodos
tradicionales como la destilación o la filtración, es gracias a las diferencias en propiedades
diferentes a la solubilidad o el punto de ebullición que esta técnica logra segregar
componentes con propiedades físicas y químicas muy similares, o, que se presentan en
cantidades mínimas. Entonces, los métodos cromatográficos se basan en características
tales como la capacidad de adsorción, el peso molecular y la disposición para
intercambiar iones, además, también tiene como principio el colocar en contacto dos fases
mutuamente inmiscibles denominadas la fase estacionaria y la fase móvil en este trabajo
nos enfocaremos especialmente en una de las ramas de la cromatografía que es por
exclusión molecular

CONCLUSIÓN
En este trabajo nos ayuda a comprender el papel que tiene la cromatografía de
exclusión molecular en los procesos de separación de partículas que tienen sus
pesos muy pequeños ya que este nos da un grado mas de seguridad a la hora de
hacer los cálculos analíticos sabiendo que es una técnica muy adecuada es una
técnica muy adecuada para conocer la distribución de los pesos moleculares

Objetivos
 Aprender a diferenciar los distintos tipos cromatográficos
 Conocer las ventajas y desventajas de la exclusión molecular en los procesos de
separación de partículas
 Reconocer el procedimiento que hay que tener para realizar este tipo de
cromatografía de forma in vitro