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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia de Alimentos

Allan Richard Gomes Munford

“Modelagem e otimização da lavagem da levedura cervejeira para inativação de


micro-organismos deteriorantes do processo fermentativo da cerveja”

Campinas-SP

2017
Allan Richard Gomes Munford

“Modelagem e otimização da lavagem da levedura cervejeira para inativação de


micro-organismos deteriorantes do processo fermentativo da cerveja”

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de


Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de
Mestre em CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Orientador: Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana.

Coorientador: Dr. Rafael Djalma Chaves.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO


FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO
ALLAN RICHARD GOMES MUNFORD E ORIENTADO
PELO PROF. DR. ANDERSON DE SOUZA SANT’ANA

Campinas-SP

2017
Comissão Examinadora

Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana


Universidade Estadual de Campinas
Orientador

Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte


Universidade Estadual de Campinas
Membro titular

Prof. Dr. Pedro Esteves Duarte Augusto


Universidade de São Paulo – ESALQ
Membro titular

Dra. Alessandra Regina da Silva Marques


Fundação André Tosello
Membro suplente

Profa. Dra. Maristela da Silva do Nascimento


Universidade Estadual de Campinas
Membro suplente

A ATA da defesa, com as respectivas assinaturas dos membros,


encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu eterno herói, orientador, referência e pai, Arnaldo
Carlos Munford. Sem seus ensinamentos, dedicação e exemplo, este e outros
projetos da minha vida jamais seriam concluídos. Tenho a certeza que hoje você
perpetua sua sabedoria, evolução e bondade em outros planos.

Minha gratidão será sempre eterna.


AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que dedicaram, nem que somente um momento de motivação e


incentivo, para que este projeto se tornasse algo concreto.

A Deus pela oportunidade de estar aqui hoje trilhando meu caminho para a evolução
espiritual.

Ao meu pai por tudo que representou e ainda representa em minha vida. Sem ele não
me tornaria a pessoa que sou hoje.

À minha querida família que sempre me incentivou e me deu todo o suporte para
conquistar meus sonhos. Mãe, Audrey (Djow), Renan, tio Armando, vovô (in
memoriam) e vovó, vocês são o meu maior tesouro.

Ao amor da minha vida, Géssica Tassi, por me apoiar nas minhas escolhas, por toda
a paciência, companheirismo e amor. Você foi o motivo deste projeto ter começado,
sem você e tudo que você representa na minha vida, ele jamais teria sido concluído.

Ao meu orientador, Professor Doutor Anderson de Souza Sant’Ana, por prontamente


confiar em mim a sua orientação. Por nunca ter me dado o peixe, mas sim me
ensinado a pescar. Pela oportunidade de realizar um grande projeto em uma das
maiores instituições do nosso país.

Ao meu coorientador, Rafael Djalma Chaves, pela orientação, parceria e


companheirismo.

Aos membros da banca, Dra. Alessandra Regina da Silva Marques, Prof. Dr. Marcus
Bruno Soares Forte, Profa. Dra. Maristela da Silva do Nascimento e Prof. Dr. Pedro
Esteves Duarte Augusto, pela cooperação, disponibilidade, correções e sugestões.

Aos funcionários da Universidade Estadual de Campinas e Faculdade de Engenharia


de Alimentos, pois sem a cooperação e dedicação de todos este e muitos outros
projetos não seriam concluídos. Em especial ao Cosme e Juliana Carusi, profissionais
como vocês fazem a diferença no mundo.

À Fundação de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX) pela bolsa de


mestrado concedida.

À cervejaria Germânia e seu mestre cervejeiro, Arnaldo Ribeiro, por me ceder o mosto
para o projeto e por toda a abertura e receptividade.

Aos meus colegas de trabalho do Laboratório de Microbiologia Quantitativa de


Alimentos (LMQA), Ligia, Chacon, Monyca, Ramon, Letícia Pozza, Alexandra, Ana
Paula, Larissa, Beatriz, Bruna, Marianna, Aline (She-ra), Aline Morgan, Amin, Claudia,
Libia, Tarcísio, Rodrigo, Yanet, Fernanda, Arthur, Lucas, Isadora, Carine e Carol, por
partilhar tantos momentos difíceis, alegres e de conquistas. Aprendi muito nesses
anos de convívio com todos vocês.

À minha grande amiga, Mariana Batista, pela amizade incondicional, por partilhar
muitos dos momentos difíceis e de alegria da minha vida dentro e fora do laboratório.

À minha parceira de tomadas de decisões, Juliana Lane, que sempre buscou meus
conselhos e também me ajudou muito nas minhas decisões.

Ao meu irmão, Olavo Conte, pela amizade e parceria, pelas conversas acadêmicas,
profissionais e sobre a vida, pelo conhecimento técnico e profissional compartilhado.

Ao meu grande amigo, Leonardo Prado, por todo o auxílio nos projetos paralelos ao
mestrado, pelas conversas, pelo companheirismo no Rio de Janeiro, por sempre estar
disposto a fazer o melhor e o correto por todos.

Ao meu parceiro, Humberto Hungaro, pela amizade, orientação e ajuda no desenho


dos meus experimentos em anaerobiose.

À Verônica Alvarenga (Vê) pelos ensinamentos, disposição em ajudar, paciência e


conversas que sempre me trouxeram conhecimento e reflexão.
Aos colegas do laboratório LEMeB, Wesley, Felipe Beato, José Madeira (Zé), VJ,
Bruno Labate, Felipe Ferrari (tropeço), Pamela, Alberto, Dani, Suéllen e Priscila, que
fizeram desse local um refúgio, um ambiente de muita paz e alegria. Sempre que
puder estarei visitando vocês, assim podemos tomar aquele café com cookies na
pracinha.

Aos professores, Dr. Andreas Karoly Gombert e Dra. Maria Isabel Rodrigues pelo
profissionalismo, pelas qualidades técnica e didática nas disciplinas ministradas. Os
conhecimentos transmitidos por vocês fizeram a diferença na minha formação
acadêmica.

Aos meus companheiros de república, Alexandre (Alê), Leonardo (Bola), Leonardo


(Bidê), Mauricio (Queijo), Diego e Felipe (Abelhinha), pelos churrascos, conversas,
jantas, discussões, jogos de futebol, parceria e ajuda. Nossa convivência me ensinou
mais ainda sobre respeito, amizade e irmandade.

À minha amiga, Clarisse Boni, que chegou ao meu laboratório como vendedora e saiu
como uma grande amiga. Apesar de nunca ter sido um comprador, você me comprou
e, ao me vender, me permitiu alçar voo profissionalmente. Você é meu exemplo de
que vender é mais do que proporcionar uma experiência comercial, mas sim permitir
a formação de uma amizade verdadeira e duradoura com as pessoas que precisam
de você e de seus produtos.

Aos meus colegas de trabalho e clientes que sempre me incentivaram e me deram


força para concluir este projeto.
RESUMO

MODELAGEM E OTIMIZAÇÃO DA LAVAGEM DA LEVEDURA CERVEJEIRA


PARA INATIVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS DETERIORANTES DO
PROCESSO FERMENTATIVO DA CERVEJA

A contaminação do fermento cervejeiro por micro-organismos deteriorantes é uma das


principais preocupações das indústrias cervejeiras. As principais alternativas
empregadas pelos cervejeiros para eliminar contaminações microbianas do fermento
e permitir sua reutilização, são as lavagens ácidas ou as lavagens com dióxido de
cloro. Apesar de serem práticas comuns dentro das indústrias cervejeiras, a sua
otimização e eficácia, sobre micro-organismos contaminantes do processo
fermentativo, e o impacto sobre a levedura utilizada para fabricação da cerveja, ainda
não são bem elucidados. Assim, o presente estudo deve como objetivos a modelagem
da inativação dos principais contaminantes do processo cervejeiro através da lavagem
ácida e otimizar os processos de lavagem ácida e lavagem com dióxido de cloro, afim
de se obter fermento de reinoculação livre de contaminantes e viável para novas
bateladas fermentativas. Primeiramente, foram avaliados os perfis de inativação das
cepas Lactobacillus brevis DMS 6235, Lactobacillus casei ATCC334, Pediococcus
damnosus ATCC 29358 e Pediococcus damnosus DSM 20289; expostas ao processo
de lavagem ácida com ácido fosfórico a 85%/4°C a diferentes regimes de pH (pH 1,5,
pH 2 e pH 3). Com o uso do software GinaFit, diversos modelos foram ajustados aos
dados obtidos, sendo os de Weibull e Weibull com cauda, os que melhor se ajustaram
aos dados experimentais (R2 > 0,9). Através dos parâmetros obtidos pelos modelos
foi possível observar que a resposta de inativação das cepas contaminantes é
dependente o pH e que uma variação de 0,5 no pH do ácido utilizado pode ser
suficiente para se obter inativações mais eficientes sem reduzir a viabilidade da
levedura cervejeira. Para otimizar os processos de lavagem ácida e lavagem com
dióxido de cloro foram utilizados 2 delineamentos compostos centrais rotacionais
(DCCR), totalizando 2 experimentos com 11 ensaios independentes, sendo 3, no
ponto central. Para a lavagem ácida as variáveis independentes foram pH (1-3) e
temperatura (1-9 °C). Enquanto para a lavagem com dióxido de cloro as variáveis
foram: concentração do sanitizante (10-90 mg/L) e a temperatura (5-25°C).O micro-
organismo alvo dos foi o Lactobacillus brevis DSM 6235. Os modelos obtidos para as
4 variáveis resposta γLA, γCl (redução decimal do contaminante),Vf/V0LA e Vf/V0Cl
(razãoda viabilidade da levedura cervejeira), apresentaram R2> 0,80 e valores de
Fcalculado> Ftabelado, portanto considerados preditivos e estatisticamente significantes (p
< 0,1). A validação dos modelos foi realizada dentro do intervalo dos parâmetros
estabelecidos no ensaio, apresentando valores, dos fatores bias (γLA: 0,93 /
Vf/V0LA:0,99 – γCl: 1,0 / Vf/V0Cl: 0,99) e exatidão (γLA: 1,12 / Vf/V0LA: 1,01 – γCl: 1,08 /
Vf/V0Cl: 1,03), próximos a 1. Os resultados obtidos nestes estudos deixam evidente
que a microbiologia preditiva e a modelagem através do delineamento experimental
são, ambas ferramentas, importantes para se avaliar a eficácia de tratamentos de
inativação de micro-organismos, assim como para se obter tratamentos em condições
otimizadas.

Palavras-chave: Cerveja, descontaminação, fermentação, microbiologia preditiva,


delineamento experimental, otimização de processos, Lactobacillus,
Pediococcusdamnosus.
ABSTRACT

MODELING AND OPTIMIZATION OF BREWING YEAST WASHING FOR THE


INACTIVATION OF SPOILAGE MICROORGANISMS FROM THE BEER
FERMENTATIVE PROCESS

The contamination of brewer's yeast by deteriorating microorganisms is a major


concern of the brewing industry. The main alternatives used by brewers to eliminate
microbial contaminations of the yeast and allow its reuse are acidic washes or washes
with chlorine dioxide. Although, they are common practices within the brewing industry,
their optimization and efficacy, on microorganisms that contaminate the fermentation
process, and the impact on yeast used for brewing, are still not well understood. Thus,
the present study should aim to model the inactivation of the main contaminants of the
brewing process through the acid washing and to optimize the processes of acid
washing and chlorine dioxide washing, in order to obtain repitching yeast free of
contaminants and viable for new batch. First, the inactivation profiles of Lactobacillus
brevis DMS 6235, Lactobacillus casei ATCC334, Pediococcus damnosus ATCC
29358 and Pediococcus damnosus DSM 20289 were evaluated; exposed to the acid
washing process with phosphoric acid 85% / 4 ° C at different pH regimes (pH 1.5, pH
2 and pH 3). With the use of the GinaFit software, several models were fitted to the
data obtained, Weibull and Weibull with tail, where the ones that best fited the
experimental data (R2> 0.9). Through the parameters obtained by the models it was
possible to observe that the inactivation response of the contaminating strains is pH
dependent and that a variation of 0.5 in the pH of the acid used, may be sufficient to
cause inactivation of contaminating microorganisms without reducing the viability of
the brewer's yeast. To optimize the acid washing and chlorine dioxide washing
processes, two central composite rotatable design (CCRD) were used, totaling 2
experiments with 11 independent tests, 3 of which were in the central point. For acid
washing the independent variables were pH (1-3) and temperature (1-9 ° C). While, for
chlorine dioxide washing, the variables were: concentration of the sanitizer (10-90 mg
/ L) and temperature (5-25 ° C). Lactobacillus brevis DSM 6235 was the target
microorganism. The models obtained for the 4 response variables γLA, γCl (decimal
reduction of the contaminant), Vf / V0LA and Vf / V0Cl (viability ratio of brewer's yeast)
showed R2> 0, 80 and values of Fcalculated > Ftabulated, therefore considered as predictive
and statistically significant (p <0.1). The validation of the models was performed within
the range of the parameters established in the test, presenting bias factors (γLA: 0.93 /
Vf / V0LA: 0.99 - γCl: 1.0 / Vf / V0Cl: 0.99) and accuracy (γLA: 1.12 / Vf / V0LA: 1.01 - γCl:
1.08 / Vf / V0Cl: 1.03), close to 1. The results obtained in these studies make it clear
that predictive microbiology and modeling through the experimental design are both
important tools to evaluate the effectiveness of inactivation treatments of
microorganisms, as well as to obtain treatments under optimized conditions.

Key words: Beer, decontamination, fermentation, predictive microbiology,


experimental design, process optimization, Lactobacillus brevis,
Pediococcusdamnosus.
SUMÁRIO
Introdução geral ........................................................................................................ 15
Capítulo 1: Revisão bibliográfica ............................................................................... 17
Parte 1: indústria cervejeira ................................................................................... 18
1.1 Definição e contexto econômico ................................................................... 18
1.2 Matérias-primas para a produção de cerveja ................................................ 19
1.3 Processamento ............................................................................................. 21
Parte 2: Contaminações microbiológicas na indústria cervejeira ........................... 24
2.1 Contaminações por micro-organismos deteriorantes ................................... 24
2.1.1 Contaminações por bactérias gram-positivas ......................................... 25
2.1.2 Contaminações por bactérias gram-negativas ....................................... 26
2.1.3 Leveduras selvagens .............................................................................. 28
2.2 Principais fontes de contaminação microbiológica durante o processo de
fabricação da cerveja .......................................................................................... 30
2.2.1 Contaminações primárias ....................................................................... 30
2.2.1.1 Cevada e malte ................................................................................ 31
2.2.1.2 Mosturação e mosto ......................................................................... 32
2.2.1.3 Fermentação e maturação ............................................................... 34
2.2.2 Contaminações secundárias .................................................................. 35
2.2.2.1 Envase ............................................................................................. 36
Parte 3: Tratamentos e reutiização da levedura cervejeira .................................... 37
3.1 Descontaminação do fermento – a lavagem ácida ....................................... 37
3.2 Ácidos fracos ................................................................................................ 39
3.2.1 Teoria dos ácidos fracos......................................................................... 39
3.2.2 Ácido fosfórico ........................................................................................ 41
3.3 Dióxido de cloro ............................................................................................ 41
3.4 Reutilização da levedura em sucessivas bateladas ...................................... 43
Parte 4: Ferramentas para otimização de processos ............................................. 45
4.1 Microbiologia preditiva .................................................................................. 45
4.2 Planejamento experimental e delineamento composto central rotacional .... 46
5. Referêncas bibliográficas ................................................................................... 48
Capítulo 2: Cinética de inativação de bactérias deteriorantes de cerveja através da
lavagem ácida de levedura de reinoculação ............................................................. 61
Resumo.................................................................................................................. 63
1. Introdução .......................................................................................................... 64
2. Materiais e Métodos ........................................................................................... 66
2.1. Micro-organismos e condições de cultivo .................................................... 66
2.2. Condições da fermentação .......................................................................... 67
2.3. Lavagem ácida ............................................................................................ 68
2.4. Enumeração de micro-organismos e viabilidade da levedura...................... 68
2.5. Modelagem matemática da inativação......................................................... 68
2.5.1. Modelos matemáticos ............................................................................ 69
2.5.1.1. Weibull e Weibull + cauda ............................................................... 69
2.6. Análise estatística ........................................................................................ 69
3. Resultados ......................................................................................................... 69
4. Discussão .......................................................................................................... 77
5. Referências ........................................................................................................ 81
Capítulo 3: Modelagem da lavagem ácida eda lavagem com dióxido de cloro da
levedura cervejeira de reinoculação para a inativação de bactérias contaminantes e
manutenção da viabilidade ........................................................................................ 87
Resumo.................................................................................................................. 89
1. Introdução .......................................................................................................... 90
2. Material e métodos............................................................................................. 92
2.1 Micro-organismos e condições de cultivo ..................................................... 92
2.2 Condições da fermentação ........................................................................... 93
2.3 Regimes de lavagem .................................................................................... 93
2.4 Enumeração de micro-organismos ............................................................... 94
2.5 Delineamento experimental, análises estatísticas e validação dos modelos
desenvolvidos ..................................................................................................... 94
3. Resultados ......................................................................................................... 95
3.1 Otimização da lavagem ácida ....................................................................... 95
3.2 Otimização da lavagem com dióxido de cloro ............................................... 99
3.3 Validação dos modelos preditivos............................................................... 104
4.Discussão ......................................................................................................... 105
4.1 Otimização da lavagem ácida ..................................................................... 105
4.2 Otimização da lavagem com dióxido de cloro ............................................. 106
5.Conclusão ......................................................................................................... 108
6. Referências ...................................................................................................... 108
Discussão Geral ...................................................................................................... 116
Conclusão Geral...................................................................................................... 118
Referências Geral ................................................................................................... 119
15

INTRODUÇÃO GERAL

A produção mundial de cerveja está acima de 80 bilhões de litros por ano.


Dentro desse mercado, o Brasil, ocupa uma posição estratégica com uma produção
de mais de 8 bilhões de litros/ano, com faturamento bruto atingindo mais de R$ 17
bilhões. Esse seguimento emprega mais de 150 mil pessoas, entre postos diretos e
indiretos, e durante os anos de 2000 a 2004 o setor investiu mais de R$ 3 bilhões com
a instalação de novas plantas industriais e na ampliação e modernização das
indústrias já em operação (Sindicerve, 2004)

Ao longo dos anos a qualidade representa um papel cada vez mais fundamental
na sobrevivência e sucesso competitivo das organizações. A indústria cervejeira não
é exceção, tendo como objetivo principal fornecer um produto de elevada qualidade
para fazer face à competitividade e para satisfazer as necessidades dos seus clientes
e consumidores.

Dentre os principais requisitos percebidos pelo consumidor para uma cerveja


de qualidade encontram-se, sobretudo aqueles relacionados com as suas
propriedades sensoriais (cor, limpidez, brilho, ausência de flavours desagradáveis,
etc.) (Back,2006). No entanto, tais requisitos podem ser afetados negativamente por
contaminações microbiológicas, o que pode comprometer seriamente a imagem da
cerveja ou da empresa que a produz junto ao mercado (Fernandes,2012).

A contaminação microbiológica ocorrida durante o processamento da cerveja


pode modificar as propriedades sensoriais do produto final, assim como pode causar
o “arraste” da fermentação (Back, 2006). O arraste da fermentação ocorre devido à
competição pelos nutrientes do mosto, entre a levedura cervejeira e os contaminantes
(Vaughan, 2005). Em virtude do crescimento dos contaminantes do processo de
fermentação, ocorre uma maior liberação de metabólitos no meio, o que acaba por
inibir a multiplicação da levedura cervejeira (Priest, 2003)

Nos processos industriais de produção de cerveja existentes no Brasil, e no


mundo, o fermento é reutilizado em diversos ciclos fermentativos, o que aumenta a
probabilidade de contaminação microbiológica. A levedura recuperada no final do
processo de fermentação, também chamada de levedura de reinoculação, é
reconhecida como sendo o principal reservatório de bactérias deteriorantes dentro das
16

indústrias (Ogden, 1987). Dos tratamentos mais utilizados na indústria, para reduzir
a população microbiana contaminante, é a lavagem do fermento cervejeiro com ácido
fosfórico ou dióxido de cloro (Cunningham e Stewart, 2000; Meneghin et al., 2008).
Apesar de ser amplamente empregada na indústria cervejeira, não há estudos atuais
de modelos que definem a sua eficiência na inativação de micro-organismos
deteriorantes da cerveja e estratégias de otimização desses processos.

A modelagem do efeito de sanitizantes em micro-organismos é considerada


uma importante ferramenta na otimização de protocolos de sanitização existentes ou
para a geração de novos (Virto et al., 2005). Na microbiologia preditiva, o estudo do
crescimento ou morte microbiana em relação a fatores ambientais é traduzido em
equações matemáticas que permitem a predição do crescimento ou inativação de
micro-organismos em alimentos (Janssen et al., 2007).

Esse estudo teve como objetivo geral a obtenção de ferramentas, como os


modelos matemáticos preditivos, para se conhecer as condições ótimas de inativação
das bactérias contaminantes do processo cervejeiro e manutenção da levedura
cervejeira, pelos processos de lavagem ácida e com dióxido de cloro.

Para alcance do objetivo geral, foram considerados nessa pesquisa, os


seguintes objetivos específicos:

- Avaliação da inativação de bactérias contaminantes do processo cervejeiro por


diferentes regimes de lavagem ácida,

- Identificação dos parâmetros cinéticos e perfis de curva de sobrevivência através de


ferramentas da microbiologia preditiva de alimentos.

- Otimizaçãodos processos de lavagem ácida e da lavagem com dióxido de cloro


visando-se a inativação de contaminantes comuns do processo cervejeiro
(Lactobacillus brevis DSM 6235) e manutenção da viabilidade da levedura cervejeira.
17

Capítulo 1: Revisão bibliográfica


18

PARTE 1: INDÚSTRIA CERVEJEIRA

1.1 DEFINIÇÃO E CONTEXTO ECONÔMICO

Um dos processos biotecnológicos mais antigos conhecido pelo homem é o


processo fermentativo de cereais. Há pesquisas que informam que a prática da
cervejaria tenha se originado na Mesopotâmia em 6.000 A.C, e que a cerveja nesta
época não era utilizada somente na dieta, mas também como artigo medicinal e
cosmético (Kunze, 1997, Aquarone et al., 1983).

De forma genérica, define-se cerveja como uma bebida carbonada de teor


alcoólico entre 3 e 8% (v/v), produzida a partir de malte de cevada, lúpulo, fermento e
água de boa qualidade, permitindo ainda o uso de outras matérias primas como arroz,
trigo ou milho (Almeida e Silva, 2005). A legislação brasileira define através do Decreto
nº 2314, de 04 de setembro de 1997, art.64 a art.71: “Cerveja é a bebida obtida pela
fermentação alcoólica do mosto cervejeiro oriundo do malte de cevada e água potável,
por ação da levedura, com adição de lúpulo” (Brasil, 1997).

As cervejas podem ser divididas em dois grandes grupos: as do tipo Lager, como
a Pilsen, Bock e Munique, e as do tipo. Ale, dentre as quais temos a Porter e a Stout.
As cervejas do tipo Ale são produzidas através de uma fermentação superficial ou
“alta”. Esse tipo de cerveja apresenta uma coloração variada, sabor pronunciado de
lúpulo, sutil acidez e teor alcoólico variando de 4 a 8%. O processo de fermentação
ocorre entre a temperatura de 20 e 25ºC, com duração de 2 a 5 dias e a maturação
entre 4,5 e 8ºC. As cervejas do tipo Lager são as mais consumidas e comuns, sendo
a Pilsen uma das cervejas mais tradicionais em todo o mundo. A fabricação das
cervejas desse grupo ocorre por fermentação profunda ou “baixa”, através de
processo lento, geralmente em torno de 5 dias. Essa cerveja é caracterizada por
possuir sabor suave, cor clara e teor alcoólico entre 4 e 5% (Delos,1994).

A produção de cerveja no Brasil atinge o volume de 8,5 bilhões de litros anuais,


ficando atrás somente da China (27 bilhões de litros/ano), Estados Unidos (23,6
bilhões de litros/ano), Alemanha (10,5 bilhões de litros/ano) e Rússia (9 bilhões de
litros/ano), sendo o consumo per capita no país, o nono maior do mundo, com uma
média de 47,6 litros/ano por habitante (Sindicerve, 2004). Portanto, a agroindústria do
álcool representa um considerável gerador de divisas, e levando em conta que toda a
19

produção de álcool se dá por via fermentativa, é de fundamental importância o


conhecimento do processo fermentativo, que tem sido constantemente aprimorado.

1.2 MATÉRIAS-PRIMAS PARA A PRODUÇÃO DE CERVEJA

Na formulação da cerveja as principais matérias-primas são a água, cereais,


lúpulo e fermento. A água é a principal matéria-prima da cerveja, pois representa 95%
de massa final do produto e pelas suas características determinantes para a qualidade
do produto final. Para se definir uma água de qualidade para o processo cervejeiro ela
deve seguir padrões de qualidade como: ser translucida, inodora e isenta de qualquer
indicio de matéria orgânica e sabor. A presença dos sais dissolvidos na água pode
influenciar o processo fermentativo, e consequentemente, a qualidade da cerveja
(Pombeiro, 2008).
Os cereais são a fonte dos açúcares simples que serão assimilados pela
levedura no processo fermentativo. Podem-se usar diferentes cereais, em conjunto ou
separadamente. Mais comumente, utiliza-se a cevada (transformada em malte),
devido ao seu alto teor de amido e capacidade enzimática. A utilização de outros
cereais de forma adjunta, como o milho, arroz, trigo ou outros grãos tem por objetivos
constituir uma fonte extra de amido de valor reduzido, refinar o gosto da cerveja,
propiciar cores mais brilhantes e gerar maior estabilidade física (Fernandes, 2012).

O lúpulo é uma planta que apresenta no pólen, das flores femininas, grânulos de
lupulina que detêm as substâncias de interesse para o processo cervejeiro. Destas
substâncias, as mais importantes são os óleos essenciais, as resinas amargas e os
polifenóis, no qual a quantidade interfere no amargor, aroma e estabilidade
microbiológica da cerveja (Fernandes, 2012).

As leveduras cervejeiras são responsáveis pelo processo fermentativo. A


espécie mais utilizada no processo é a Saccaromyces cerevisiae, no entanto dois tipos
diferentes de estirpes são responsáveis por dois tipos de fermentações que produzem
características distintas à cerveja, sendo elas estirpes do tipo Ale e Lager. As
leveduras do tipo Ale, também conhecidas como “de alta fermentação”, pois se elevam
até a superfície do mosto formando uma película flutuante de biomassa no final da
fermentação. Entretanto, as leveduras Lager são “de baixa fermentação”, pois
apresentam floculação e sedimentação no final do processo (tabela 1) (Carvalho et
al., 2006).
20

Tabela 1. Tipos de cerveja produzidas por alta e baixa fermentação, principais


características sensoriais e matérias-primas.

Caractrísticas Características
Cervejas Matéria-prima Referências
físico-químicas sensoriais

Alta
fermentação
1
(Priest e Stewart,
1 Água, malte, levedura e 2006) 2(Bamforth,
12,5-16°plato ; 5-11% de Médio a alto amargor e teor
Indian Pale alto teor de lúpulos 2009) 3(Kunze, 1997)
álcool1 2 3; 35-55 IBU1 4; 12- alcóolico com coloração 4
Ale aromáticos e de (Silva e Faria, 2008)
28 EBC1 cobre1 3
amargor1 2 3 5
(Baiano e Terracone,
2013)

1
(Priest e Stewart,
Aromas frutados e fenólicos Água, malte de trigo e
11,8-14°plato1; 4,9-6 % de 2006) 2(Bamforth,
123 1 com baixo teor de amargor cevada, levedura e
Weissbier álcool ; 10-15 IBU ; 6-18 2009) 3(Kunze, 1997)
1 e com coloração palha turva lúpulos aromáticos e de 5
EBC 13 (Baiano e Terracone,
amargor1 2 3 5
2013)

1
(Priest e Stewart,
Água, cevada e maltes
9,5-12°plato1; 3,8-5 % de 2006) 2(Bamforth,
Aroma de torra e alto teor torrados, levedura e
Stout álcool 1 2 3; 30-40 IBU1; 40+ 2009) 3(Kunze, 1997)
de amargor 1 3 elevado teor de lúpulos1
EBC1 235
5
(Baiano e Terracone,
2013)

1
(Priest e Stewart,
Água, cevada e maltes
12-115°plato1; 4,5-6,5 % Aroma leve de torra e teor 2006) 2(Bamforth,
torrados, levedura e
Porter de álcool1 2 3; 20-40 IBU1; frutado com alto teor de 2009) 3(Kunze, 1997)
elevado teor de lúpulos
20-35 EBC1 amargor e coloração rubi1 3 123
5
(Baiano e Terracone,
2013)

Baixa
fermentação
1
(Priest e Stewart,
Água, malte, adjuntos,
10-12°plato1; 3,8-5 % de Aromas do malte, adjuntos 2006) 2(Bamforth,
levedura e lúpulos
Pilsner álcool1 2 3 ; 5-14 IBU1; 4-8 e lúpulos leves com muita 2009) 3(Kunze, 1997)
aromáticos e de
EBC1 carbonatação e cor âmbar1 3 5
(Baiano e Terracone,
amargor1 2 3 5
2013)

Aromas de torra e Água, malte de cevada


15-17°plato1; 6-8 % de 1
(Priest e Stewart,
adocidaco com médio teor torrado, levedura e
Bock álcool1 2 3 ; 25-35 IBU1; 20- 2006) 2(Bamforth,
de amargor e coloração lúpulos aromáticos e de
30 EBC1 2009) 3(Kunze, 1997)
marrom escuro1 3 amargor1 2 3

11,9-13,8°plato1; 4-6,1 % Aroma moderado adocicado Água, malte, levedura e 1


(Priest e Stewart,
Export de álcool1 2 3; 23-29 IBU1; e lúpulado com coloração lúpulos aromáticos e de 2006) 2(Bamforth,
3-12 EBC1 palha dourada1 3 amargor1 2 3 2009) 3(Kunze, 1997)

°Plato: porcentagem em massa de sacarose presente em uma solução - IBU: Escala internacional de amargor - EBC:
Convenção cervejeira europeia para cor e turbidez.
21

1.3 PROCESSAMENTO

A cerveja é obtida pela conversão em álcool, dos açúcares presentes nos grãos
da cevada. A fermentação é a principal etapa do processo cervejeiro e sua efetividade
depende de várias operações anteriores, incluindo o preparo das matérias-primas.
Após a fermentação, são realizadas etapas de tratamento, para conferir à cerveja as
características sensoriais (sabor, odor, textura) desejadas no produto final. A
produção de cerveja apresenta basicamente quatro etapas: maltagem, preparação do
mosto (mosturação), fermentação e processamento da cerveja (figura 1) (Santos et
al., 2005, Willaert et al., 2006).

O processo de fabricação do malte é conhecido como maltagem, e consiste no


controle do umedecimento com água e posterior germinação, sob condições
controladas de temperatura, com o intuito de formação de enzimas necessárias à
hidrólise dos polissacarídeos e do amido presente nos grãos de cevada (Briggs,
1998). Esse processo é formado por três etapas: molha, germinação e secagem dos
grãos. Primeiramente os grãos são limpos e selecionados e em seguida depositados
em tanques imersos em água, assim adquirindo certa quantidade de umidade
necessária para se iniciar a germinação (cerca de 40-42%). Após a molha, os grãos
são encaminhados para caixas de germinação onde permanecem em condições
controladas de umidade, arejamento e temperatura, durante cerca de 4-6 dias. Dentro
do processo de maltagem, a germinação tem como principal objetivo disponibilizar as
enzimas necessárias à formação do mosto e de degradação dos tecidos de reserva
da cevada, permitindo que o amido presente nos grãos se desprenda. Logo que os
grãos apresentem indícios da germinação o processo é interrompido através de um
processo de secagem em estufa ou torrefação. Por último, após a secagem, o malte
é desradiculado e armazenado em silos por 3-4 semanas (Fernandes,2012).

O processo de preparação do mosto, também conhecido como brassagem,


pode ser dividido nas seguintes fases: moagem, mistura, filtração, fervura e
decantação. Após a operação de moagem do malte e adjuntos, a farinha moída
resultante é misturada com água aquecida e submetida a condições operacionais
(tempo, temperatura, agitação e pH) pré-estabelecidas para que as enzimas amilases
presentes no malte sejam ativadas e hidrolisem o amido em açúcares fermentescíveis
(glicose, maltotrioses e maltose). Após a mistura, o líquido formado é filtrado para a
separação da parte insolúvel (cascas do malte e proteínas coaguladas) do filtrado
22

(mosto) (Kunze, 1997, Pombeiro, 2008). O mosto resultante é fervido, sendo nesta
etapa que ocorre a adição do lúpulo. A operação de fervura é uma etapa crítica para
a qualidade do produto final, pois promove: esterilização microbiológica do mosto,
eliminação de substâncias voláteis que geram sabores não desejáveis, inativação de
enzimas e coagulação de complexos proteicos que podem causar turvação no produto
final, formação de compostos responsáveis pela cor e sabor do produto, através de
reação de Maillard e caramelização, e a extração de compostos amargos e aromáticos
do lúpulo (Denk et al, 2000). Após a fervura, o mosto é enviado a um tanque de
clarificação, nesse tanque acontece à decantação. Como o mosto servirá de fonte de
nutrientes para as leveduras, no processo fermentativo, percebe-se a importância do
seu correto preparo para que se obtenha uma cerveja de qualidade (Santos et al.,
2005, Willaert et al., 2006).

Uma vez tendo sido preparado, pode-se dar início a fermentação do mosto,
processo central da indústria cervejeira (Santos et al., 2005, Willaert et al., 2006). A
fermentação do mosto é dividida em duas etapas: numa primeira etapa, denominada
aeróbia, as leveduras são adicionadas no mosto areado e se reproduzem rapidamente
aumentando sua população entre 2 a 6 vezes, devido à alta quantidade de O 2
dissolvido no meio. Depois que todo o oxigênio é consumido, inicia-se a fase
anaeróbia, na qual as leveduras realizam a fermentação propriamente dita,
convertendo os açúcares presentes no mosto em CO2, etanol e compostos aromáticos
como ácidos orgânicos, ésteres e aldeídos (Siqueira et al., 2008, Santos et al., 2005).
O processo de fermentação dura de 3 a 9 dias, ao final dos quais se obtém, além do
mosto fermentado, uma grande quantidade de gás carbônico que após ser purificado
é reaproveitado em outra etapa do processo cervejeiro. Ao final de fermentação,
obtém-se também um excesso de levedo, que é tratado e estocado, sendo uma parte
reutilizada em novas bateladas de fermentação, e parte vendida para a indústria de
alimentos (Santos et al., 2005).

O mosto fermentado, chamado também de cerveja verde, que ainda possui


uma suspensão de leveduras e uma parte do material fermentescível, passa por uma
fermentação secundária chamada de maturação. Essa etapa permite que a levedura
continue atuando a uma velocidade reduzida devido às baixas contagens e
temperatura de acondicionamento. Após a fermentação, a cerveja que é encaminhada
para o processo de maturação apresenta 1-4 milhões de células por ml e uma
23

gravidade de 2-4 graus Plato. Nessa fase ocorre a precipitação de coloides que
causam turvação à cerveja e eliminação de substâncias que causam sabor
desagradável. Esta etapa do processo é realizada sob temperaturas de 0 a 3°C
durante um período de 15 a 60 dias, e contribui para a clarificação da cerveja e
melhora do seu sabor (Aquarone et al., 1983, Santos et al., 2005).

A cerveja já maturada é dirigida para o processo de filtração para que se torne


límpida e brilhante, eliminando os complexos proteicos coloides que ainda se
encontram em suspensão e possíveis contaminantes microbiológicos e a levedura
cervejeira. O processo consiste em uma aplicação de força sobre o líquido através de
uma membrana ou meio filtrante (ex. terra de diatomáceas). Nessa fase a cerveja
pode ser ainda diluída em água, para o ajuste de sua concentração, e carbonatada,
para o ajuste de dióxido de carbono a valores desejados para a cerveja final
(Fernandes, 2012).

Depois de filtrada, a cerveja segue para uma linha de enchimento de latas,


garrafas ou barris. Para se evitar a formação de espuma e eliminar o oxigênio contido
nas embalagens, que poderia deteriorar a cerveja em termos físico-químicos
(oxidação) ou microbiológicos, o enchimento é feito em contrapressão com gás
carbônico. Na fase de enchimento procede-se ainda à estabilização microbiológica da
cerveja, que pode ser feita através de filtração esterilizante ou pasteurização. São
conhecidos dois modos de pasteurização:

(a) Pasteurização flash: processo no qual a cerveja é aquecida por uma placa
de trocador de calor a uma temperatura entre 68 a 72ºC e mantidas a essa
temperatura por aproximadamente 50 segundos. Após esse tempo a cerveja é
novamente resfriada (Kunze, 1994).

(b) Pasteurização “túnel”: Nessa operação a cerveja, já no interior da


embalagem fechada, passa por um túnel fechado com esguichos de água quente que
tem por objetivo elevar a temperatura do líquido dentro da embalagem a uma
temperatura aproximada de 60 ºC por 20 min (Briggs et al., 2004).
24

Figura 1. Processo cervejeiro e principais pontos de contaminação por micro-


organismos (*) (Modificado de Vaughan et al., 2005).

PARTE 2: CONTAMINAÇÕES MICROBIOLÓGICAS NA INDÚSTRIA


CERVEJEIRA

2.1 CONTAMINAÇÕES POR MICRO-ORGANISMOS DETERIORANTES

A cerveja é reconhecida como uma bebida de singular estabilidade


microbiológica. Tal fato deve-se a diversos fatores que a tornam um meio desfavorável
à sobrevivência e/ou multiplicação de vários micro-organismos, dos quais podemos
citar: a) presença de etanol (0,5 a 10% p/p, equivalente a aproximadamente 0,6 a
12,3% v/v), b) presença de compostos antimicrobianos encontrados no lúpulo (17 a
55 ppm de iso-α-ácidos), c) elevada concentração de dióxido de carbono
(aproximadamente 0,5% p/p), d) baixo pH (3,8 a 4,7) e e) reduzida concentração de
oxigênio (<0,1 ppm). Mesmo apresentando essas características desfavoráveis à
sobrevivência e/ou multiplicação microbiana, alguns micro-organismos são capazes
de se multiplicarem nessas condições e causarem a deterioração desta bebida
(Suzuki et al., 2006a; Sakamoto e Konings, 2003). Além da deterioração do produto
25

final, a contaminação microbiológica durante o processo de fabricação da cerveja,


pode causar diversos problemas, tais como: consumo de açúcar, formação de goma,
floculação do fermento, inibição e redução da viabilidade das leveduras devido às
toxinas e ácidos orgânicos excretados no meio, e, por consequência, redução no
rendimento e na produtividade da fermentação (Alterthum et al., 1984, Amorim et al.,
1982, Yokoya, 1991).

Os micro-organismos que comumente são encontradas no processo de


produção da cerveja podem ser classificados de acordo com sua forma,
características bioquímicas, aspectos estruturais, ou ainda através de técnicas de
coloração (Briggs et al., 2004, Hough et al., 1982). Dentre as técnicas conhecidas de
identificação, uma das mais importantes e mais amplamente utilizadas em
microbiologia é o método de Gram, em que as bactérias são coradas e então
classificadas em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (tabela 2) (Boulton e
Quain, 2006, Pelczar et al., 1980).

2.1.1 CONTAMINAÇÕES POR BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS


Dentre as bactérias Gram-positivas causadoras de deterioração da cerveja,
temos as bactérias ácido láticas pertencentes aos gêneros Lactobacillus e
Pediococcus (Gil et al., 2004, Venturini e Cereda, 2001). Aproximadamente 70% dos
problemas por contaminação da cerveja são causados por bactérias láticas (Iijima et
al., 2007, Suzuki et al., 2006a, Suzuki et al., 2006b).

O gênero Lactobacillus é o mais conhecido dentre as bactérias ácido láticas,


incluindo numerosas espécies que são amplamente empregadas em vários processos
fermentativos, tais como na produção de picles, vinho e iogurte (Sakamoto e Konings,
2003). L. brevis tem sido relatada como a espécie mais frequentemente detectada
como deteriorante da cerveja, e, portanto, o micro-organismo mais estudado na
produção cervejeira (Back, 2005). Essa bactéria é uma heterofermentativa estrita que
apresenta crescimento ótimo a 30 °C e pH entre 4 e 5, e que pode causar
superatenuação (consumo acelerado de açúcares fermentescíveis pelos
contaminantes) na cerveja devido à capacidade de fermentar dextrinas e amido
(Vaughan et al., 2005, Priest, 1996).
26

O gênero Pediococcus é constituído por bactérias homofermentativas que


crescem em pares ou tétrades. Antigamente estas bactérias eram intituladas como
sarcinas, pois sua organização celular era confundida com aquela das verdadeiras
sarcinas. Por esse motivo, a deterioração da cerveja causada por estes micro-
organismos era denominada “doença da sarcina” (Sakamoto e Konings, 2003). A
deterioração causada por Pediococcus é semelhante àquela causada por outras
bactérias ácido láticas, provocando aumento de turbidez, acidez e formando sabores
e aromas desagradáveis (amanteigados, devido à formação de diacetil) (Hartnett et
al., 2002; Hough et al., 1982).

A espécie P. damnosus, também referenciada na literatura como P. cerevisiae,


é conhecida como a mais comum e perigosa bactéria deteriorante da cerveja, sendo
responsável por cerca dos 90% dos casos de contaminação de cerveja por bactérias
desse gênero (Priest, 1996). É conhecido que algumas estirpes de P. damnosus
produzem exopolissacarídeos que tornam, de forma indesejada, a cerveja viscosa e
gelatinosa (Back, 2005). Essa espécie também é reportada por se aderir as leveduras
e algumas vezes induzir a uma sedimentação prematura do fermento, resultando em
um retardamento do processo fermentativo (Priest, 2003).

2.1.2 CONTAMINAÇÕES POR BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS


Os micro-organismos Gram-negativos conhecidos como deteriorantes da
cerveja abrangem diversas espécies de bactérias pertencentes a vários gêneros.
Dentre eles, os mais importantes incluem as bactérias dos gêneros Pectinatus,
Megasphaera, Zymomonas e certos membros da família Enterobacteriaceae (Boulton
e Quain, 2006; Priest, 2003; Briggs et al., 2004; Sakamoto e Konings, 2003).

O gênero Pectinatus é constituído por bacilos anaeróbios, móveis, não


formadores de esporos que possuem flagelos laterais. Estas bactérias podem se
multiplicar em temperaturas de 15 a 40 °C (ótima de 32 °C), pH 3,5 a 6 (ótimo 4,5) e
em meios contendo até 4,5% p/p (aproximadamente 5,6% v/v) de etanol (Chelak e
Ingledew, 1987). As espécies P. cerevisiiphilus e P. frisingensis estão entre as
principais deteriorantes da cerveja, sendo responsáveis por 20 a 30% dos incidentes
por contaminação bacteriana, principalmente em cervejas não pasteurizadas
(Vaughan et al., 2005; Back, 1994b). Essas bactérias, durante a multiplicação,
27

produzem quantidades consideráveis de ácidos, tais como, o ácido propiônico,


acético, láctico, succínico e também de acetoína (Haikara et al., 1981). A espécie P.
cerevisiiphilus, em temperaturas acima de 15°C, produz uma grande quantidade dos
ácidos propiônico os quais inibem a multiplicação do levedo cervejeiro, S. cerevisiae
(Chowdhury et al.,1997). No entanto, o principal efeito de deterioração causado pelas
espécies de Pectinatus é uma evidente turvação e um forte cheiro de “ovo podre”
resultante da combinação de diferentes ácidos graxos, sulfeto de hidrogênio e metil
mercaptano (Lee et al.,1980). No seguimento cervejeiro industrial Pectinatus tem
como fontes o óleo de lubrificação, tubulações, a água de maceração do malte antes
da moagem e na água condensada no teto (Helander et al., 2004).

Ogênero Megasphaera tem sido relacionado como responsável por 7% dos


incidentes por bactérias deteriorantes na produção de cerveja (Back, 1994). Esse
gênero é constituído por 2 espécies, M. elsdeni e M. cerevisiae. Porém, somente M.
cerevisiae tem sido considerada responsável pela deterioração de cervejas
(Sakamoto e Konings, 2003; Satokari et al., 1998). As células desse micro-organismo
são cocos Gram-negativos, imóveis e anaeróbios estritos. Sua multiplicação ocorre
entre 15 e 37 °C, com temperatura ótima de 28 °C, e em valores de pH acima de 4,1,
sendo inibidas em cervejas com concentração de etanol acima de 2,8% p/v
(aproximadamente 3,5% v/v). Entretanto, já foi evidenciado crescimento em
concentrações de etanol de 5,5% p/v (Haikara e Lounatmaa, 1987). A contaminação
da cerveja causada por esse micro-organismo resulta na produção de consideráveis
quantidades de ácido butírico, aliado a baixas concentrações de ácido acético,
isovalérico, valérico, capróico e de acetoína (Vurren, 1996). M. cerevisiae é um dos
micro-organismos mais temidos pelos cervejeiros, pelo fato de, assim como ao
Pectinatus, provocar odor fecal na cerveja através da produção de sulfeto de
hidrogênio (Lee, 1994).

Outro gênero de bactéria Gram-negativa conhecido por causar problemas na


indústria cervejeira é o Zymomonas, particularmente a espécie Z. mobilis. Essa
bactéria é uma anaeróbia tolerante ao oxigênio, resistente ao lúpulo e apresenta a
capacidade de se multiplicar em cervejas com pH acima de 3,4 e concentrações de
etanol de até 10% (v/v). Apresenta crescimento rápido a 15 °C em cervejas mantidas
em tonéis, mesmo sua temperatura ótima de crescimento sendo de 30 °C (Hough et
al., 1982).
28

Sendo assim, os problemas causados pela contaminação da cerveja provocam


não somente grandes prejuízos econômicos, com a retirada dos produtos do mercado,
mas também perda da confiança do consumidor, motivos esses que podem levar à
falência da empresa. Desta forma, a contaminação da cerveja é uma das principais
preocupações das indústrias cervejeiras no mundo inteiro (Iijima et al., 2007).

2.1.3 LEVEDURAS SELVAGENS


As leveduras, conhecidas como selvagens, são quaisquer leveduras presentes
no processo que não a estirpe industrial utilizada. As leveduras selvagens podem ser
isoladas de todos os estágios do processo cervejeiro, desde a matéria-prima até o
produto armazenado. As leveduras selvagens deteriorantes do processo podem ser
divididas em Saccharomyces, como estirpes de S. cerevisiae, e não-Saccharomyces,
como os gêneros Brettanomyces, Hansenula, Debaryomyces, Torulopsis, Dekkera,
Candida e Pichia, sendo as do gênero Saccharomyces consideradas as mais
prejudiciais. Dentre os efeitos deteriorantes causados nas cervejas, sabe-se que as
leveduras selvagens podem causar turvação, formação de película na superfície da
cerveja, fermentação com desvio na atenuação e desenvolvimento de aromas
desagradáveis devido à formação de compostos sulforosos, fenólicos e diacetílicos.
(Sakamoto e Konings, 2003; Carvalho et al., 2006). Além dos problemas apresentados
acima, algumas leveduras selvagens são conhecidas como Killer yeasts (KY) devido
à capacidade desses micro-organismos de secretar polipeptídios que são tóxicos para
outras espécies ou estirpes de leveduras. Um dos principais micro-organismos
selvagens produtores de toxinas é a Saccharomyces cerevisiae, que pode ser
distinguida das leveduras cervejeiras através de suas características morfológicas.
Esses produzem células menores e alongadas e floculam inconstantemente. As KY
podem contaminar a fermentação eliminando e substituindo a levedura cervejeira do
processo, que muitas vezes são susceptíveis a concentrações de KY baixas como de
0,01% (Vaughan et al, 2005).
29
Tabela 2. Micro-organismos deteriorantes e suas características de crescimento e deterioração.
Tolerância Faixa de
Micro- Tolerância T° de Tolerância Metabólitos
Morfologia ao álcool crescimento Deterioração
organismo ao lúpulo crescimento ao O2 formados
(% v/v) (pH)

Diacetil1,2,
lactato1,2, Atenuação1,
Lactobacillus Bacilo
(+)1,2 2-30°C1 >141 <3.5 - 51,2 Microaerófilo1 acetato1, turbidez1,2 , off-
brevis G(+)1,2
glicerol6, flavours1,2
etanol6

Diacetil1 , Atenuação2,
Lactobacillus Bacilo
(+)16 2-40°C18 <16,515 5,5-7,517 Microaerófilo2 Acetoína1 turbidez2 , off-
casei G(+)3
,Lactato2 flavours2

Atenuação4,5,6,
Pediococcus Cocos Diacetil4,5 ,
(+)2 8-30°C7 <49 4- 77,8 Microaerófilo8 turbidez4,5,6 ,
damnosus G(+)3 lactato6
off-flavours4,5,6

Ác.
Pectinatus Bacilo Propiônico2,12, Turbidez13,
(+)2,6 15-40°C10 <5,610 3,5-610 Anaeróbio2,6,11
cerevisiiphilus G(-)2,6 acético2,12 , odor fecal13
H2S2,13

Ác. Butírico2,14,
Megasphaera Cocos Turbidez2 , odor
(+)2,6 15-37 °C8 >3,58 >4,18 Anaeróbio2,6,8 acetoína2,14 e
cerevisiae G(-)2,6,8 fecal13
H2S13

Fonte: 1(Teixeira,1999), 2(Priest, 2003), 3(Sakamoto e Konings, 2003), 4(Hartnett et al., 2002), 5(Hough et al., 1982), 6(Briggs et al.,2004), 7 (De Vos et al, 2009), 8(König et al., 2009), 9(Fernandes
et al., 1991), 10(Chelak e Ingledew, 1987), 11(Haikara e Lounatmaa, 1987), 12(Haikara et al.,1981), 13(Lee et al.,1980), 14(Vurren, 1996), 15(Suzuki, 2011), 16( (Haakensen et al., 2009), 17 (Axelsson
2004), 18(Roginski, 2003)
30

2.2 PRINCIPAIS FONTES DE CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA DURANTE O


PROCESSO DE FABRICAÇÃO DA CERVEJA

O processo de produção de cerveja apresenta diversas fontes de contaminação


microbiológica que podem afetar o produto final de forma significativa. A contaminação
primária é a que acontece durante as etapas de produção, já a contaminação
secundária é a que predomina nas fases de enchimento e pasteurização, e que se
observa no produto final (Vaughan et al., 2005).

Figura 2. Microbiota contaminante do processo de produção de cerveja (Modificado


de Bokulich e Bamforth, 2013).

2.2.1 CONTAMINAÇÕES PRIMÁRIAS


Diversos problemas de contaminação microbiológica observados durante o
processo produtivo da cerveja têm como fonte as matérias-primas. A matéria-prima
que apresenta uma contaminação aguda pode introduzir uma carga de contaminantes
31

microbianos que podem ser carreados até a etapa de pré-filtração da cerveja,


comprometendo o processo e podendo gerar metabólitos resistentes que
permanecem até o produto final (Fernandes, 2012).

Outra importante fonte de contaminação primária pode ser a cultura cervejeira


em si. Um inóculo de levedura contaminado microbiologicamente pode principalmente
afetar a fermentação (arrastar a fermentação). Para garantir um inóculo formado
apenas pelo micro-organismo de interesse, ou seja, a estirpe de levedura utilizada no
processo produtivo, quando se for reutilizar o fermento, deve-se realizar um
tratamento para se eliminar as bactérias presentes. Este tratamento é normalmente
feito com ácidos, como ácido fosfórico 5% por tempos e condições de temperatura
que podem variar de empresa para empresa. Além disso, outra medida visando-se
garantir a qualidade microbiológica do inóculo inicial é a renovação regular de cultivos
puros de forma a evitar contaminações cruzadas por leveduras selvagens (Fernandes,
2012).

2.2.1.1 CEVADA E MALTE


A contaminação microbiológica do processo cervejeiro começa nos campos de
cultivo da cevada, nos quais a interação planta/micro-organismos pré e pós-colheita e
a condição do grão podem implicar sérios problemas para o processo e para a
qualidade do produto final. Muitos contaminantes dos campos não persistem após as
diversas operações unitárias do processo, entretanto alguns metabólitos secundários
podem perdurar até o produto envasado (Bokulich e Bamforth, 2013).

Diversos micro-organismos já foram identificados como contaminantes da


cevada (Figura 2), contudo somente alguns fungos patógenos de plantas apresentam
uma expressiva importância para a qualidade da cerveja. Diversos fungos apresentam
a capacidade de produzir metabólitos secundários, conhecidos como micotoxinas, que
persistem por todo o processamento cervejeiro e é detectado no produto final (Wolf-
Hall, 2007, Kostelanska et al., 2009). Das diversas espécies de fungos que
contaminam a cevada do campo ao armazenamento, o gênero Fusarium merece uma
menção especial, pois esse é reconhecido como, o patógeno de plantas, produtor da
micotoxina Deoxinivalenol (DON ou Vomitotoxina) (Clear et al., 1996). Os efeitos
toxigênicos da DON para animais e humanos já estão bem elucidados, gerando uma
32

expressiva preocupação, quando se refere a padrões de qualidade na produção de


cevada e malte. Além do potencial toxigênico em relação à saúde humana, altas
concentrações de micotoxinas já demonstraram um efeito inibidor do crescimento das
leveduras no processo de fermentação (Boeira et al., 1999ab).

A contaminação fúngica da cevada e do malte também causa um problema que


afeta o consumidor diretamente no momento do consumo, o gushing. O gushing é
uma reação anormal de formação de espuma, devido à liberação espontânea de gás,
no momento e abertura da embalagem. Esse fenômeno é proporcionado devido a
peptídeos hidrofóbicos fúngicos (hidrofobinas) que atuam como sítios de adesão as
bolhas de dióxido de carbono do produto envasado que, no momento de abertura,
liberam esses gases de forma anormal causando a super espumação (Deckers et
al.,2011).

Dentro do processo de maltagem a fase de molha e germinação dos grãos torna


essa matéria-prima suscetível a contaminações microbianas que podem alterar
qualidade da cerveja por todo o processo. Entretanto a fase de secagem proporciona
uma considerável redução na contagem de micro-organismos viáveis (Bokulich e
Bamforth, 2013). Na fase de molha os micro-organismos presentes no grão se
multiplicam rapidamente no próprio grão e na água de molha, isso devido à presença
de nutrientes dissolvidos, umidade, temperatura favorável e aeração (Petters et al.,
1988, O’sullivan et al., 1999, Briggs e Mcguinness, 1993). O crescimento microbiano
nessa etapa apresenta efeitos negativos para a qualidade do malte, além disso esses
micro-organismos podem consumir o oxigênio disponível inibindo a germinação do
grão e reduzir os efeitos desejáveis da alfa-amilase (Briggs e Mcguinness, 1993,
Boran e Briggs, 1992, Kelly e Briggs, 1992).

2.2.1.2 MOSTURAÇÃO E MOSTO


Durante a fase de mosturação, bactérias termofílicas podem apresentar
crescimento em caso de queda de temperatura do mosto, não lúpulado, ou se a
temperatura for mantida abaixo de 60ºC (Vaughan et al., 2005).

Bactérias aeróbias e formadoras de esporos do gênero Bacillus, ocasionalmente,


causam problemas em cervejarias. Os esporos dos micro-organismos desse gênero
estão presentes no malte e adjuntos e sobrevivem por todo o processo de produção
33

cervejeira, entretanto não apresentam germinação durante a fermentação e no


produto final devido ao baixo pH dos meios e sensibilidade aos componentes do lúpulo
(Smith e Smith, 1993). Contudo, Bacillus coagulans já foi reportado como produtor de
ácido láctico em processo de mosturação mantidos a temperatura entre 55-70ºC por
mais de duas horas, sendo esse crescimento atribuído à produção de nitrosamina
acima do limite permitido (20 ug/L) (Calderbank e Hammond, 1989, Smith e Smith,
1992). O crescimento de Clostridium durante a mosturação, ou no mosto pré-fervura,
pode gerar a formação de ácido butirico que caracteriza um odor de queijo no produto
final (Hawthorne et al., 1993). A baixa qualidade da espuma do produto final, assim
como a consistência pouco viscosa do mosto em sua produção já foi correlacionada
com a produção de beta-glucanases e xilanases produzidas por fungos (Latilia et al.,
2007).

Após a mosturação e filtração o mosto é fervido por um longo período, formando


um meio para a fermentação com características estéreis. Entretanto, o mosto é um
meio rico em nutrientes e com alto pH (~5,5), portanto ao ser resfriado o meio se torna
vulnerável a contaminações por micro-organismos oportunistas presentes no
ambiente industrial. Dentre os potenciais contaminantes do mosto os mais comuns
são os micro-organismos Gram-negativos do grupo das enterobactérias, como as
espécies dos gêneros Klebsiella, Escherichia, Obesumbacterium, Enterobacter e
Citrobacter (Priest et al., 1974). A contaminação do mosto por enterobactérias esta
associada ao uso de suprimento de água contaminada ou devido a vazamentos de
tubulações que atingem o mosto durante o processo. O crescimento de
enterobactérias além de inibir o crescimento de leveduras (Priest et al., 1974), está
relacionado com a produção de dimetilsulfido (DMS), diacetil, ácidos orgânicos e
grande quantidade de 2,3-butanodiol dando a cerveja um aroma indesejável de fruta
e vegetais (Priest et al., 1974, Van Vuuren et al., 1980). As enterobactéria, além de
contaminar o mosto em diferentes fases de sua produção, são conhecidas como
contaminantes do processo de reutilização do inóculo, por exemplo, espécies dos
gêneros Obesumbacterium e Enterobacter (Priest et al., 1974). Entretanto, devido aos
elevados padrões de higienes aplicados ao processo e a evolução dos equipamentos,
a contaminação por enterobactérias no processo cervejeiro diminuiu
consideravelmente, podendo esse grupo ser considerado pouco relevante como
contaminante do processo (Bokulich e Bamforth, 2013).
34

2.2.1.3 FERMENTAÇÃO E MATURAÇÃO


Após a adição de lúpulo e fervura, o mosto é clarificado, resfriado e aerado para
que apresente características adequadas para o crescimento e fermentação pela
levedura cervejeira. Esse mosto também pode ser meio ideal para o crescimento de
outros micro-organismos contaminantes, que podem ser introduzidos no mosto
através do inóculo de leveduras, aeração ou como resultado de práticas inadequadas
de higiene do processo (Vaughan et al., 2005). O mosto devidamente resfriado e
aerado é bombeado para os tanques de fermentação, a onda a levedura cervejeira é
adicionada para que possa converter o mosto em cerveja através da fermentação da
maltose e de outros açúcares em etanol e dióxido de carbono. O produto final da
fermentação primária apresenta um ambiente hostil para a maioria dos micro-
organismos, pois a cerveja possui alta concentração de álcool e dióxido de carbono,
assim como, componentes antimicrobianos derivados do lúpulo e baixos níveis de
oxigênio, pH e nutrientes. Entretanto, aproximadamente, 20% dos açúcares
remanescentes no mosto são constituídos de oligossacarídeos que não são
metabolizados pela Saccharomyces e podem servir como fonte de carbono para o
crescimento de contaminantes (Bokulich e Bamforth, 2013).

Dentre os contaminantes do processo fermentativo um dos mais temidos é a


levedura selvagem. Esses micro-organismos podem ser isolados de diversos estágios
da produção e podem causar diversos problemas de operação, principalmente na
fermentação (Vaughan et al., 2005). O crescimento de leveduras selvagens na
fermentação pode levar a produção de defeitos, como turbidez, off-flavours e aromas
desagradáveis (Hough et al., 1982, Lawrance, 1988). Outros efeitos indesejáveis são
relacionados ao desempenho fermentativo da levedura cervejeira, levando a
fermentações menos eficientes e lentas, além de causar uma super atenuação do
produto final. A super atenuação é um fenômeno no qual a cerveja apresenta um
atípico, baixo nível de graus Plato e uma alta concentração alcoólica (Lawrence,
1988).

Dentre as bactérias contaminantes dessa etapa do processamento Pediococcus


damnosus é um dos mais frequentes, inclusive esse pode estar presente no inóculo
de leveduras. Fermentações experimentais contaminados com Pediococcus
35

damnosus e Pediococcus inopinatus tiveram seu tempo de fermentação estendidos e


apresentaram elevadas concentrações de diacetil (Vaughan et al., 2005).

As aminas biogênicas (AB) são poliaminas que são formadas devido a


contaminações microbianas, que descarboxilizam aminoácidos e que podem causar
sérios danos de saúde a indivíduos sensíveis, resultando em reações semelhantes a
alergias, enxaqueca e a reações de intoxicação (Bokulich e Bamforth, 2013). As
aminas biogênicas são formadas por micro-organismos presentes na cevada, malte,
mosto, lúpulo, mas principalmente no processo fermentativo (Gasarasi et al., 2003,
Halasz et al., 1999). As bactérias ácido láticas são as mais reconhecidas como
produtoras de AB, mas algumas estirpes de enterobacteria e algumas estirpes de
Saccharomyces podem ser atribuídas como formadoras desse composto (Gasarasi et
al., 2003).

O processo de maturação tem seu ínicio ao fim da fermentação, ao qual a


cerveja é transferida para tanques a mantidos a baixas temperaturas por longos
períodos. Nessa etapa da produção cervejeira o mosto já fermentando pode ser
contaminado por micro-organismos como Pediococcus damnosus e Lactobacillus
lindineri. P. damnosus é conhecido por ser o mais frequente contaminante do
processo fermentativo e de maturação, isso devido a sua capacidade de se multiplicar
a baixas temperaturas (Back, 2005) Valores inesperados de diacetil durante o
processo de maturação podem ser relacionados com contaminação por P. damnosus
(Susuki, 2011).

2.2.2 CONTAMINAÇÕES SECUNDÁRIAS


As contaminações secundárias representam mais de 50% dos casos de
deteriorações em cervejas pasteurizadas via Flash pasteurização. A Flash
pasteurização se dá pela eliminação da carga microbiana antes do enchimento das
garrafas, diferente da pasteurização em “Túnel” que ocorre com a cerveja já
engarrafada (Vaughn et al., 2005).

Mesmo a cerveja sendo considerado um meio hostil para o crescimento


microbiano alguns grupos de micro-organismos como leveduras selvagens, bactérias
ácido láticas e bactérias anaeróbias estritas como Pectinatus ssp. e Megasphaera
spp. conseguem se multiplicar contaminando o produto final. Sendo esses dois últimos
36

gêneros de bactérias anaeróbias, acredita-se que a presença deles na área de


enchimento seja favorecida pela formação de interações simbióticas com micro-
organismos mais resistentes, adaptados ao ar e formadores de biofilmes (Back, 1994).
Back (1994), ainda afirma que as contaminações no ambiente da área de enchimento
acontecem de forma sequencial. Segundo o autor, bactérias acéticas (como por
exemplo, Acetobacter spp. e Glunobacter spp.) e algumas enterobactérias, veiculadas
pelo ar, são os principais micro-organismos colonizadores do biofilme. Primeiramente,
as bactérias acéticas colonizam superfícies que apresentam resíduos orgânicos e
inorgânicos do processo cervejeiro. Essas bactérias não são referenciadas como
deterioradoras, porém são capazes de formar uma matriz de polissacarídeo que gera
proteção e condições para proliferação de micro-organismos deteriorantes.

2.2.2.1 ENVASE
O processo de envase representa um dos maiores desafios para a manutenção
da estabilidade microbiológica da cerveja. Durante os processos anteriores, como da
produção do mosto até a maturação, a cerveja se mantém em toneis de aço inoxidável
com acessíveis condições de higiene. Entretanto no processo de envase o produto é
transportado por diversas superfícies dentro dos equipamentos e tubulações, nas
quais exposições breves a atmosfera ocorrem, e são armazenados em pequenos
vasilhames. Existe a possibilidade da formação de biofilmes na superfície de bicos
injetores e nas áreas de envase, aumentando o risco de contaminação microbiana e
justificando os altos índices de contaminações nessa etapa (Bokulich e Bamforth,
2013). No advento de uma filtração ou pasteurização ineficiente, a cerveja se torna
vulnerável a contaminação de diversos micro-organismos, sendo os principais
deteriorantes relacionados a incidentes de contaminação microbiana, as bactérias
ácido láticas Gram-positivas (Vaughan et al., 2005). Entretanto, a crescente demanda
por cervejas não pasteurizadas vem aumentando os incidentes de contaminação
microbiana de cerveja embalada, principalmente por espécies anaeróbias como
Pectinatus e Megasphaera, gêneros de deteriorantes Gram-negativos (Jespersen e
Jakobsen, 1996).
37

PARTE 3: TRATAMENTOS E REUTIIZAÇÃO DA LEVEDURA CERVEJEIRA

3.1 DESCONTAMINAÇÃO DO FERMENTO – A LAVAGEM ÁCIDA

A lavagem ácida do fermento tem sido empregada pelos cervejeiros a mais de


100 anos como um método eficiente de eliminar a contaminação bacteriana sem afetar
adversamente a qualidade fisiológica da levedura. A levedura apresenta uma
resistência natural a condições ácidas, entretanto, se outras condições do meio, como
concentração de álcool e temperatura, apresentarem variações, a resistência ao
tratamento ácido diminui (Simpson e Hammond, 1989). Simpson e Hammond
demonstraram que se a temperatura da lavagem ácida ocorrer abaixo dos 5 °C, a
concentração de etanol permanecer abaixo de 8% (v/v) e o tratamento não durar mais
que duas horas, não se observa redução significativa nos níveis de viabilidade e de
performance fermentativa da levedura (Figura 3).

A escolha do ácido para acidificar o fermento é determinada por diversos


fatores, dentre eles, destacam-se: i) a aceitabilidade do ácido como um aditivo ou
auxiliador no processo, ii) o custo do ácido, iii) características do ácido quanto à
segurança de sua manipulação e iv) eficiência do ácido como um agente para a
lavagem do fermento (Simpson e Hammond, 1989). Diversos ácidos satisfazem esses
critérios em diversos graus, contudo o ácido fosfórico e o cítrico merecem uma
menção especial. Como são ácidos fracos, o controle do pH do fermentado é
facilmente alcançável. Por outro lado, ácidos fortes como o ácido sulfúrico podem
causar problemas como a diminuição acentuada do pH devido à super dosagens e
perda de viabilidade das células de leveduras. Ácidos fracos, também, diminuem
ligeiramente o pH do mosto quando a levedura é reinoculada, o que restringe a
possibilidade de recontaminação. Como são ácidos fracos, a influência no pH final da
cerveja é negligenciável, pois sendo ácidos fracos a forma não dissociada predomina
sobre a forma protonada (Simpson e Hammond, 1989).
38

Figura 3. Processo de lavagem ácida e segregação dos produtos da fermentação


cervejeira (Simpson e Hammond, 1989).

Estudos mais recentes apresentam a lavagem ácida como um fator de estresse


para as leveduras que podem gerar culturas com baixa vitalidade e viabilidade, que
levam a fermentações incompletas, floculações da levedura, decantação, baixas
contagens e variações metabólicas que podem gerar off-flavours (Stewart et al.,
2013). Quando a lavagem ácida de leveduras é realizada em paralelo com
fermentações de alto °Plato os efeitos estressantes sobre a levedura são acentuados,
com isso processos de gerenciamento do inóculo devem ser otimizados para se
reutilizar o levedo em uma próxima fermentação. É de interesse da indústria, para a
reutilização do levedo em novas bateladas, garantir que a levedura apresente um bom
estado fisiológico e possa manter sua resistência em condições ácidas (Cunningham
e Stewart, 1998). É evidenciado que as resistências da levedura a condições impostas
pela lavagem ácida estão relacionadas com os fatores ambientais, como por exemplo,
a temperatura da lavagem, pH e concentrações de etanol; assim como as condições
fisiológicas da levedura antes da lavagem (Simpson e Hammond, 1989). As fases
logarítimica das culturas de levedura apresentam uma resistência ácida baixa em
comparação com a fase estacionária, portanto a fisiologia da levedura determina sua
resistência aos efeitos do tratamento ácido (Steels et al., 1994).

A performance fermentativa da levedura cervejeira exposta a sucessivas


lavagens ácidas e reutilizações em novas bateladas de fermentações podem gerar
diversos efeitos deletérios (como por exemplo, baixa performance fermentativa e
geração de off flavours) se não realizada propriamente, mas se as condições de
39

temperatura, pH, concentração de álcool e tempo da lavagem forem seguidos


conforme estudos anteriores; e o mosto utilizado nas fermentações sucessivas esteja
devidamente oxigenado e apresente uma baixa gravidade (em torno de 12 °Plato), as
fermentações não apresentam problemas em sua performance fermentativa e as
lavagens e reutilizações podem seguir desde que a levedura apresenta uma alta taxa
de viabilidade (>80%) (Cunningham e Stewart, 2000).

3.2 ÁCIDOS FRACOS

Historicamente os ácidos orgânicos desempenham um significante papel nos


alimentos e bebidas há milhares de anos. Existem registros que datam de 5000 a 5400
antes de cristo quanto à presença de resíduos de ácido tartárico em jarras de vinhos
Iranianos. Os ácidos naturais de uva melhoram e adicionam frescor aos vinhos, além
de melhorar as propriedades antioxidantes dessa bebida. Nos dias atuais, tem se
tornado prática comum à adição de ácido cítrico, málico ou tartárico, particularmente
em vinhos de climas quentes e sazonais. Não é coincidência que o os vinhos de maior
validade são os produzidos com uvas mais ácidas (Stratford, 1999).

Acidulantes agem como conservantes por retardar o crescimento de micro-


organismos e a germinação de esporos que poderiam causar a deterioração de
alimentos e bebidas. O efeito inibitório dos ácidos fracos é atribuído tanto ao pH
quanto a concentração desse ácido na sua forma não dissociada. Primeiramente, é a
forma não dissociada do ácido que possui a ação antimicrobiana e quanto menor o
pH, melhor é o equilíbrio em favor da forma não dissociada, conduzindo assim, a uma
atividade microbiana mais eficaz (Dziezak, 2003).

3.2.1 TEORIA DOS ÁCIDOS FRACOS


A clássica teoria dos ácidos fracos de inibição de micro-organismos por
conservantes é amplamente definida por parâmetros físico-químicos. Ácidos fracos,
quando em solução aquosa, dissociam-se parcialmente gerando um equilíbrio
dinâmico entre ácidos moleculares e íons carregados. Em baixo pH, o equilíbrio
favorece a formação de ácidos moleculares (não dissociados), enquanto em pH
próximo da neutralidade, observa-se o predomínio de íons carregados. Os ácidos
40

orgânicos moleculares são lipossolúveis, diferente dos íons carregados, que a baixo
pH penetram a célula de um micro-organismo através dos lipídeos da membrana
plasmática por um transporte conhecido como difusão facilitada. No citoplasma da
célula, a pH neutro, o ácido molecular se dissocia em ânion e próton, os quais não
conseguem deixar o citoplasma da célula devido a suas cargas. Com o aumento da
concentração de prótons o citoplasma sofre uma substancial acidificação que inibe
processos do metabolismo celular como a glicólise, comunicação celular e o
transporte ativo (Figura 4) (Lambert e Stratford, 1999).

Figura 4. Transporte de um ácido fraco e sua forma dissociada e não dissociada


através da membrana microbiana (modificado de Lambert e Stratford, 1999).

Segundo a teoria dos ácidos fracos, todos os ácidos lipofílicos de mesmo pKa,
ácido acético e sórbico, por exemplo, são equivalentes quanto a sua efetividade como
conservantes, causando inibição por difusão de moléculas de ácido não dissociados
para o interior da célula, seguido da dissociação e acidificação do citoplasma.
Entretanto, estudos recentes demonstram que ácidos, como os citados acima, que
possuem o mesmo valor de pKa, apresentam variações na redução do pH de células
de levedura e fungos filamentosos, quando utilizados concentrações semelhantes. O
ácido acético cumpre com a proposta da teoria dos ácidos fracos, no qual sua
utilização, a níveis inibitórios, reduz o pH celular para valores próximos a 4.7. Assim
sugerindo que o ácido acético causa a inibição através da acidificação do citoplasma
microbiano (Stratford et al.,2009, Stratford et al.,2013). Entretanto o ácido sórbico, em
concentrações inibitórias menores que a do ácido acético, apresenta o efeito
41

conservante por vias diferentes da de redução do pH, como previsto pela teoria dos
ácidos fracos. As baixas concentrações inibitórias, em comparação com o ácido
acético, o ácido sórbico apresentou efeito conservante, mesmo reduzindo o pH de
micro-organismos de 7-7,4 para 6.3. Assim, pode se concluir que o ácido sórbico não
inibe os micro-organismos através da via de acidificação citoplasmática como previsto
pela clássica teoria dos ácidos fracos (Stratford et al.,2013). Devido às características
hidrofóbicas do ácido sórbico, acredita-se que o sítio de ação desse conservante são
as proteínas e lipídeos de membrana. Avariações da membrana podem ser
evidenciadas de várias formas, como a lise celular, alteração das proteínas de
membrana e pequenos vazamentos devido à mudança da fluidez de membrana
(Stratford et al.,2009). Em princípio, o resultado obtido para esses ácidos pode ser
equiparado a efeitos, inibidores de crescimento, de outros ácidos fracos, como por
exemplo, o ácido cítrico, fosfórico láctico e outros.

3.2.2 ÁCIDO FOSFÓRICO


O ácido fosfórico é o único ácido inorgânico utilizado na indústria de alimentos,
sendo o segundo ácido mais utilizado nesse ramo. Dos acidulantes alimentares o
ácido fosfórico é o que produz o menor pH quando se considera a mesma quantidade
de ácido adicionado no alimento, isso devido aos seus baixos valores de Ka e pKa
(7,52 x 10-3 e 2,12, respectivamente), em comparação com outros ácidos fracos. Esse
ácido é mais utilizado na produção de bebidas carbonatadas como refrigerantes e
cervejas (Dziezak, 2003).

3.3 DIÓXIDO DE CLORO

O dióxido de cloro aquoso (ClO2) é um forte oxidante e agente sanitizante de


ampla e alta ação biocida contra algas, deteriorantes de alimentos e patógenos (Junli
et al., 1997; Kim et al., 2009; Vandekinderen et al., 2009; Tomás-Callejas et al., 2012).
O ClO2 aquosopode ser utilizado para sanitizar superfícies que entram em contato
com alimentos e diretamente aplicado nos mesmos. A aplicação desse agente
sanitizante tem recebido grande atenção devido as suas vantagens potenciais em
comparação com outros sanitizantes a base de cloro, sendo que o mesmo fora
aprovado para a lavagem de frutas e vegetais pela Food and Drug Administration.
42

(FDA et al., 1998). Trabalhos reconhecem que o dióxido de cloro possui 3.5 vezes
mais ação oxidante do que o cloro isoladamente; e também que a solução aquosa
desse sanitizante apresentou uma ação bactericida mais eficiente do que a aplicação
de uma solução de cloro 7 vezes mais concentrada (Benarde et al, 1965; Lillard, 1979).
Em relação ao uso de cloro, típico sanitizante industrial, surgiram algumas
preocupações no âmbito da saúde devido à produção de trihalometanos e clorofenois
gerados durante a cloração. Entretanto, diversos estudos vêm apresentando o dióxido
de cloro como uma alternativa mais eficaz na sanitização e livre da produção desses
compostos carcinogênicos (Kim et al., 1999; Owusu-Yaw et al., 1999).

O dióxido de cloro aquoso é utilizado amplamente na Europa (Katz, 1980) e


esta sendo aplicado em mais de 400 plantas de tratamento de água potável nos
Estados Unidos (Richardsen et al., 1996). A utilização de ClO 2 aquoso tem sido
considerada como potencial sanitizante para o processamento de vegetais, peixes,
carne vermelha, aves e embalagem de cítricos (Costilow et al., 1984; Reina et al.,
1995; Key et al., 1996; Lin et al., 1996; Cutter e Dorsa, 1995; Villarreal et al., 1990;
Tsai et al., 1995). Além das pesquisas na área de alimentos e de água potável, o
dióxido de cloro tem sido considerado para a sanitização de suspensões de leveduras
para processos fermentativos (Meneghin et al., 2008). Ao final do processo
fermentativo do caldo de cana de açúcar, para a produção de etanol, a levedura
recuperada dos tanques de fermentação é lavada com ácido sulfúrico. Muitas vezes
se faz necessário à adição de biocidas como, por exemplo, quaternário de amônia,
fenóis halogenados e antibióticos; para o controle de contaminantes do processo.
Devido aos altos custos desses biocidas e também a possibilidade de seleções de
micro-organismos resistentes a antibióticos, novas alternativas vêm sendo
pesquisadas para a redução/eliminação da carga de contaminantes desse processo
(Alcarde et al., 2003). Em 2003 um grupo de pesquisa do interior do Brasil publicou
um trabalho no qual o efeito do dióxido de cloro (MIC – concentração mínima inibitória)
sobre os contaminantes dos gêneros Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc e sobre a
levedura fermentativa foram averiguados. Os valores de menor MIC variaram de 10
ppm (Bacillus subtilis) a 125 ppm (Lactobacillus plantarum), sendo que valores abaixo
de 50 ppm não apresentaram reduções significativas na viabilidade da levedura
(Meneghin et al., 2008).
43

A ação do dióxido de cloro na inativação de micro-organismos tem sido amplamente


estudada. Inicialmente acreditava-se que, o mecanismo primário de inativação de
micro-organismos pela ação do sanitizante era a inibição da síntese proteica por
oxidação direta da tirosina, metionina ou cisteína; o que gera uma interferência em
regiões chaves de enzimas metabólicas (Bernarde et al, 1967). Entretanto, estudos
posteriores revelaram que o mecanismo principal de inativação microbiana é, na
realidade, a alteração da permeabilidade da membrana celular (Aieta e Berg, 1986;
USEPA, 1999). Inclusive, Olivieri (1985) e Ghandbari et al (1983) verificaram que a
alteração de proteínas e lipídeos da membrana celular, pela ação do dióxido de cloro,
que acarretam o aumento da permeabilidade.

3.4 REUTILIZAÇÃO DA LEVEDURA EM SUCESSIVAS BATELADAS

Quando o processo fermentativo chega ao seu fim, variando dependentemente


dos fatores de produção de cada tipo de cerveja, as leveduras são recolhidas do
tanque de fermentação e depois de certo tempo são reinoculadas em uma nova
batelada fermentativa (Kordialik-Bogacka e Diowksz, 2013).Na indústria cervejeira o
inóculo precisa apresentar boas condições fisiológicas; e por razões econômicas e de
redução de custos, existe uma demanda para o reuso das células de levedura em
sucessivas fermentações (Bühligen et al, 2013). Uma das características de grande
importância econômica, na prática da reutilização da levedura, esta relacionada aos
elevados custos de implementação de plantas de propagação de leveduras que
consomem espaço, energia e efetivo somente para a multiplicação dessas células,
sendo que esse investimento poderia estar direcionado para a planta de fabricação
do produto final (Verbelen et al., 2009).

Apesar de a reinoculação ser uma prática comum e empregada entre 8-15


fermentações, a reutilização, em teoria pode acontecer por um número ilimitado de
vezes. O que define o número preciso de vezes que a cultura pode ser reutilizada é
dependente da estirpe utilizada, a qualidade em que a levedura colhida se encontra,
estabilidade microbiológica, demanda e em algumas instâncias, as políticas da
indústria cervejeira (Powell e Diacetis, 2007).

Entretanto, a teoria de reuso ilimitado é refutada pelos fatores que levam a


degeneração da célula, direcionando a levedura para baixas performances
44

fermentativas (Powell e Diacetis, 2007). São vários, os fatores de estresse no qual a


levedura pode ser exposta durante a fabricação cervejeira que podem resultar em uma
progressiva deterioração do seu estado fisiológico. Sabe-se que, durante a
reutilização da levedura, as células são transferidas do ciclo celular para a fase
estacionária até condições estressantes, voltando para o ciclo celular. As constantes
exposições, das células a essas condições, podem levar a uma progressiva
deterioração celular, potencialmente culminando a morte. Reutilizar leveduras de
baixa qualidade fisiológica podem gerar fermentações aberrantes, observadas como:
uma baixa taxa de crescimento ou uma extensa fase lag, gerando baixas taxas de
atenuação; baixa performance da floculação e problemas com a claridade da cerveja
e fermentações arrastadas. Quando os problemas são a baixa floculação e problemas
de claridade do produto, isso implica na necessidade de processos de centrifugação
ou clareamento do produto no seu processamento (Jenkins et al 2003).

A performance fermentativa é afetada por diversos fatores externos, como a


gravidade do mosto, oxigenação, claridade, taxa do inóculo e temperatura. A alteração
da performance fermentativa esta, estritamente relacionada, as influencias desses
fatores na performance da levedura cervejeira, como por exemplo, em altas
gravidades o mosto aplica uma alta pressão osmótica na levedura, além de que,
fermentações nessas condições geram cervejas com altos teores alcoólicos. Esses
acabam sendo fatores de estresse para o micro-organismo, diminuindo sua eficiência
em fermentações sucessivas. Já está elucidada que em fermentações no qual a
gravidade do mosto se apresenta elevada, os ciclos das leveduras são reduzidos em
comparação com fermentações de baixa gravidade. (Kordialik-Bogacka e Diowksz,
2013).

Enquanto as características físicas e fermentativas da cultura de levedura são


abordadas com especial ênfase, é de grande importância o conhecimento de que
mutações genéticas podem ocorrer durante a reutilização. As mudanças genéticas do
genoma da população podem não ser imediatamente percebidas e não influenciar a
qualidade do produto, por outro lado, durante extensivos reuso do inóculo a
possibilidade de acumulação de células apresentando variações que podem competir
com as culturas originais aumentam substancialmente. Os acúmulos de células
apresentando variações, juntamente com a possibilidade de seleção das células
durante a colheita, ao final da batelada fermentativa, podem levar com que certas
45

características indesejáveis sejam passadas para gerações subsequentes. Tal evento


levaria a uma deriva genética dentro da cultura, mudando as características
desejáveis da cultura da estirpe inicial (Powell e Diacetis, 2007).

PARTE 4: FERRAMENTAS PARA OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS

4.1 MICROBIOLOGIA PREDITIVA

A microbiologia preditiva é uma área de estudo que combina conhecimentos de


microbiologia, estatística e matemática para a geração de modelos que prevêm o
comportamento microbiano sob condições ambientais pré-definidas, mas, também,
considerando variações (McMeekein, 2002). Os modelos, após serem validados,
podem ser aplicados para prever com segurança e rapidez a resposta microbiana sob
variadas condições, respeitando a faixa de valores pré-estabelecidos para cada
variável estudada.

O comportamento dos micro-organismos em alimentos (crescimento,


sobrevivência e morte) é determinado pelas características ambientais ou de
estocagem (temperatura, composição gasosa e umidade relativa), pelas propriedades
dos alimentos (pH, atividade de água, potencial de óxido-redução e uso de
conservantes) e por fatores inerentes ao micro-organismo na presença da
combinação de fatores intrínsecos e extrínsecos (Blackburn, 2006). O conhecimento
do impacto dos fatores combinados na inativação microbiana é de crucial importância
para a otimização das condições de processo. Diversos modelos preditivos, de
inativação microbiana, foram desenvolvidos para a otimização de processos
(Nakashima, et al., 2000; Kajak e Krajewska, 2006; Koseki e Yamamoto, 2007).

É relevante ressaltar que os modelos baseados em probabilidade (estocásticos)


e os baseados na cinética (determinísticos) são as duas aproximações mais
empregadas na modelagem das condições do substrato e ambientais na multiplicação
microbiana em alimentos. A escolha e aplicação específica de um deles são
determinadas pelo tipo de micro-organismo e pelo número de variáveis. Neste
contexto, três níveis de modelos podem ser considerados (Whiting e Buchanan,1993;
Ross e McMeekin, 1994).
46

Os modelos preditivos são divididos em primários, secundários e terciários. Os


primários descrevem as curvas de crescimento, ou de sobrevivência de micro-
organismos, onde a resposta pode ser expressa por contagem (UFC/mL, por
exemplo), produção de toxinas ou outros. Através desses modelos é possível se obter
informações sobre o tempo de geração, fase lag, crescimento exponencial (fase log)
e a densidade máxima da população na fase estacionária. Os modelos secundários
descrevem como os parâmetros da fase lag (λ) e log (µ) do modelo primário mudam
com parâmetros ambientais; como, por exemplo, pH, temperatura e atividade de água.
Os modelos terciários combinam o uso de modelos primários e secundários em
programas computacionais. Esses são softwares que transformam modelos primários
e secundários em modelos na forma de aplicativos, que podem determinar respostas
microbianas em diferentes condições ou ainda comparar o crescimento de diferentes
micro-organismos (Kajak e Krajewska, 2006; Mcdonald e Sun, 1999; McMeekin et al.,
2002; Schaffner e Labuza, 1997).

Após coletar certo número de dados e ajustar o modelo primário e


estabelecer o modelo secundário é importante testar a precisão do modelo com
novos dados e novas combinações dos fatores. A necessidade de desenvolver
índices interpretáveis, medidas baseadas na razão média entre o tempo predito e
o observado, originou os fatores de Bias e Exatidão (Ross,1996).O fator Bias avalia
quantitativamente onde o modelo prediz de maneira segura, determinando assim, em
média, onde os dados preditos estão, por baixo ou por cima da linha de equivalência
(Ross,1996). O fator exatidão, por se tratar de um valor absoluto, sempre terá valores
maiores que um. Este fator indica a distância entre cada ponto observado da linha de
equivalência da predição. O fator, fator exatidão, indica, portanto, a variabilidade dos
dados, ou seja, uma simples medida do nível de confiança do modelo preditivo
(Ross,1996).

4.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E DELINEAMENTO COMPOSTO


CENTRAL ROTACIONAL

A crescente necessidade de minimizar custos e tempo, potencializando o


rendimento, produtividade e qualidade de produtos, tem levado diferentes
profissionais e pesquisadores a usarem técnicas de otimização de produtos e
processos (Rodrigues, Iemma, 2014).
47

Para se desenvolver modelos preditivos, a análise dos impactos dos fatores


ambientais sob a resposta de micro-organismos é primordial. Para uma a investigação
precisa dessa influência, é essencial descrever as interações entre os fatores
ambientais, pois essa é uma importante consideração para planejar os experimentos
(Rasch, 2004). Ao realizar o planejamento, devem ser definidas algumas
características relacionadas às variáveis resposta, aos fatores que afetam tais
variáveis dependentes, ao inóculo e ao modelo matemático (Nakashima et al, 2000).

A faixa de fatores, sobre as quais o modelo tem que operar tem que ser
definida, pois os modelos empíricos não são aplicados além da faixa definida na
qual o modelo foi gerado. Nessas condições, é requerido que os fatores de
inativação possam ser alterados facilmente (Blackburn, 2000).

Nesse cenário, o delinemaneto composto central rotacional (DCCR) oferece uma


análise de regressão robusta que pode ser utilizada no planejamento de experimentos
com um pequeno número de ensaios. O DCCR permite se atingir este objetivo sem
perder seu poder discriminatório e mantendo sua sensibilidade na ocorrência de
pontos aberrantes do planejamento (Chou 2006; Ukagbu e Chigbu, 2014). A
abordagem de DCCR tem diversas aplicações, especialmente em estudos visando a
otimização de condições experimentais ou de experimentos com diversos tratamentos
ou variáveis. Por estes motivos, esta metodologia tem sido muito utilizada na
microbiologia preditiva como um modelo secundário polinominal para predizer o
comportamento microbiano em função das variações ambientais e determinar a
interação entre fatores que afetam o comportamento microbiano (McMeekin et al.,
2002).

O DCCR consiste em um desenho fatorial completo 2k, acrescido dos pontos


centrais e axiais (Rasch, 2004). O número de experimentos
é determinado através de 2k+2*k+no, onde k é o número de variáveis do processo
e n0 é o número de pontos centrais(n0≥1), por exemplo um planejamento com k=2
e 3 e n0= 3, resulta em 11 e 17 ensaios respectivamente (Rasch, 2004).

Aliado a técnica de DCCR está a metodologia de superfície de resposta


(Response Surface Methodology) que é definida por Neto et al. (2002), como sendo
uma técnica deotimização baseada em planejamentos fatoriais, introduzida nos anos
50 e que desde então tem sido utilizada com grande sucesso na modelagem de
48

processos. A metodologia é composta por duas etapas: a modelagem e o


deslocamento. Esta modelagem é feita ajustando-se modelos, lineares ou
quadráticos, a respostas obtidas com planejamentos fatoriais ou planejamentos
fatoriais ampliados. Assim, “o deslocamento na superfície será ao longo do caminho
de máxima inclinação de um determinado modelo” (Neto, et al., 2002).

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Capítulo 2: Cinética de inativação de bactérias


deteriorantes de cerveja através da lavagem
ácida de levedura de reinoculação
62

Cinética de inativação de bactérias deteriorantes de cerveja através da


lavagem ácida da levedura de reinoculação

Allan Richard Gomes Munford1, Rafael Djalma Chaves1, Anderson de Souza


Sant’Ana1#

1 Faculdade de Engenharia de alimentos, Universidade Estadual de Campinas, São


Paulo, Campinas, Brasil.

Artigo formatado de acordo com as normas de submissão da revista


“International Journal of Food Microbiology”
63

Resumo

O objetivo desse trabalho foi avaliar a inativação das principais cepas


bacterianas contaminantes do processo cervejeiro, através da lavagem ácida da
levedura de reinoculação com ácido fosfórico a 85%/4ºC e diferentes valores de pH
(pH 1,5, pH 2 e pH 3). Para se atingir esse objetivo, a modelagem matemática foi
utilizada, como ferramenta, para se obter os principais parâmetros cinéticos e ajustes
das curvas de sobrevivência. O ajuste dos modelos aos dados experimentais foi
realizado utilizando-se o GinaFit, um add-in do Microsoft® Excel. Dois diferentes
modelos matemáticos apresentaram melhores ajustes: Weibull e Weibull com cauda.
A obtenção das taxas de inativação é de fundamental importância para se conhecer a
influência de diferentes variáveis nos tratamentos. Os dados obtidos demonstram
claramente que a lavagem ácida a pH 1,5 é superior, quando se trata em eficiência da
inativação bacteriana, em comparação ao mesmo tratamento a pH 2. Além da questão
do controle de qualidade microbiológico, o tratamento a pH 1,5 não apresentou
redução na viabilidade da levedura cervejeira pelo tempo máximo de exposição aos
tratamentos.

Palavras-chave: Cerveja, fermentação, mosto, bactérias deterioradoras,


microbiologia preditiva.
64

1. Introdução

A lavagem ácida da levedura, recuperada no final do processo de fermentação,


é uma prática realizada por diversas indústrias cervejeiras há mais de um século. O
tratamento é reconhecido como eficiente para a redução de bactérias contaminantes
sem afetar a qualidade fisiológica da levedura cervejeira (Simpson et al., 1989). O
regime de lavagem ácida difere entre as cervejarias, sendo que algumas lavam a
levedura ao final de todo processo fermentativo, enquanto outras só realizam a
lavagem se detectado alguma contaminação bacteriana significativa (Cunningham e
Stewart, 2000). As condições comumente utilizadas para a lavagem são: temperatura
do processo inferior a 5 ºC e pH entre 2 - 2.2 por não mais que 120 min, sendo que o
ácido mais utilizado é o ácido fosfórico de grau alimentício (Simpson et al., 1989,
Stewart et al., 2013).

A levedura recuperada no final do processo de fermentação, também chamada


de levedura de reinoculação, é reconhecida como sendo o principal reservatório de
bactérias deteriorantes dentro das indústrias (Ogden, 1987). Pequena variedade
microbiana pode ser encontrada na levedura de inoculação: Pediococcus,
Lactobacillus, Obesumbacterium, Enterobacter, Acetobacter e Gluconobacter os
principais gêneros reportados (Simpson, 1987a). As bactérias ácido láticas (BAL) são
relatadas como responsáveis por 70% de toda contaminação presente na indústria
cervejeira (Suzuki et al., 2006a, Suzuki et al, 2006b, Iijima et al., 2007). Dentre as BAL,
duas espécies requerem especial menção: Lactobacillus brevis e Pediococcus
damnosus. L. brevis é relatada como o micro-organismo deteriorante mais
frequentemente detectado em cervejarias, e também, é reconhecido como o
contaminante mais temido pelos cervejeiros devido às alterações sensoriais no
produto final e sua capacidade de causar super atenuação (consumo acelerado de
nutrientes fermentescíveis) do mosto durante a fermentação (Priest et al., 1996, Back,
2006, Vaughan et al., 2006). L. casei, apesar de ser um deteriorante menos comum
em cervejarias, é reconhecido como produtor de diacetil. Apesar de não ser o principal
produto do metabolismo de bactérias ácido láticas, o diacetil é considerado um off-
flavour mais potente que o principal produto do metabolismo dessas bactérias, o ácido
láctico. Isso se deve principalmente pelo fato do limiar para presença de diacetil em
cerveja (0,15 ppm) ser 2000 vezes menor do que o de ácido láctico (300ppm)
(Sakamoto et al., 2003). P. damnosus, dentre as espécies do seu gênero, é o mais
65

comum deteriorante de cerveja, sendo responsável por 20% de todos os incidentes


bacterianos no período de 1980-1987 (Back, 1980, Back et al., 1988). Pediococcus
spp., em particular, são reconhecidos pela formação de diacetil e exopolissacarídeos,
além do seu potencial de crescimento em baixas temperaturas (Jaspersen e
Jakobsen, 1996).

O ácido fosfórico é o único ácido inorgânico fraco utilizado na indústria de


alimentos, sendo o segundo ácido mais utilizado nesse ramo. É o mais utilizado na
produção de bebidas carbonatadas como refrigerantes e cervejas (Dziezak, 2003).
Dentre os acidulantes alimentares, o ácido fosfórico é o que produz o menor pH
quando se considera a mesma quantidade de ácido adicionado ao alimento, devido
aos seus baixos valores de Ka e pKa (7,52 x 10 -3 e 2,12, respectivamente), em
comparação com outros ácidos fracos (Dziezak, 2003).

O efeito da lavagem ácida sobre os micro-organismos tem como fundamento a


teoria dos ácidos fracos. A clássica teoria dos ácidos fracos de inibição de micro-
organismos por conservantes é amplamente definido por parâmetros físico-químicos.
Ácidos fracos, quando em solução aquosa, dissociam-se parcialmente gerando um
equilíbrio dinâmico entre ácidos moleculares e ânions carregados (prótons). Em uma
solução com baixo pH, o equilíbrio favorece a formação de ácidos moleculares,
enquanto em pH próximo da neutralidade observa-se o predomínio de ânions
carregados. Os ácidos orgânicos moleculares, ou seja, na sua forma não dissociada,
são lipossolúveis e capazes de penetrar a membrana plasmática de um micro-
organismo por um processo conhecido como difusão facilitada. No citoplasma da
célula, a pH neutro, o ácido molecular se dissocia em ânions carregados e prótons, os
quais não conseguem deixar o citoplasma da célula devido a suas cargas. Com o
aumento da concentração de prótons, o citoplasma sofre uma substancial
acidificação, inibindo processos do metabolismo celular como a glicólise,
comunicação celular e o transporte ativo (Lambert e Stratford, 1999).

A modelagem do efeito de sanitizantes em micro-organismos é considerada


uma importante ferramenta na otimização de protocolos de sanitização existentes ou
para a geração de novos (Virto et al., 2005). Na microbiologia preditiva, o estudo do
crescimento ou morte microbiana em relação a fatores ambientais é traduzido em
equações matemáticas que permitem a predição do crescimento ou inativação de
66

micro-organismos em alimentos (Janssen et al., 2007). A abordagem mais comum


para se descrever as curvas de sobrevivência correspondentes à inativação
microbiana por agentes químicos é assumir uma cinética de primeira ordem (Pavelic
et al., 1998). Entretanto, se as curvas de inativação não seguem uma cinética de
primeira ordem, o uso dessa abordagem pode ser ilusória (Virto et al., 2005). Diversas
novas abordagens têm sido propostas para se modelar curvas de sobrevivência com
formações de ombros e caudas. Sendo que, alguns modelos já foram desenvolvidos
para descrever a influência de ácidos orgânicos em organismos alvos em culturas
puras ou em co-cultura com outros micro-organismos (Buchanan et al., 1993, Janssen
et al., 2006, Le Marc et al., 2002, Leroy et al., 2005, Presser et al., 1997, Skandamis
et al., 2003, Vereecken et al., 2003, Virto et al., 2005, Virto et al., 2006, Janssen et al.,
2007, Alvarenga, 2008).

Não existem estudos recentes que empreguem a utilização de ferramentas


matemáticas preditivas para a elucidação da eficiência do atual processo de lavagem
ácida na indústria cervejeira. Muito menos abordagens do uso dessa ferramenta para
buscar a otimização desse processo. Portanto, esse estudo teve como objetivoa
avaliação da inativação de bactérias contaminantes do processo cervejeiro por
diferentes regimes de lavagem ácida, identificação dos parâmetros cinéticos e perfis
de curva de sobrevivência através de ferramentas da microbiologia preditiva de
alimentos.

2. Materiais e Métodos

2.1. Micro-organismos e condições de cultivo

Foram selecionados para esse estudo cepas de micro-organismos


contaminantes do processo de fabricação de cerveja e comumente associados à
deterioração como Lactobacillusbrevis DSM 6235, Lactobacilluscasei ATCC 334,
Pediococcus damnosus DSM 20289 e Pediococcus damnosus ATCC 29358. Além da
cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae Saflager W-35/70 (Fermentis®),
amplamente utilizada no processo de fabricação de cerveja. As culturas foram
mantidas congeladas a -20ºC em criotubos. Para as cepas de Lactobacillusbrevis
DSM 6235 e Lactobacilluscasei ATCC 334, uma subcultura foi preparada ao inocular
a cultura a 10 mL de caldo MRS (deMan, Rogosa e Sharp - Merck 1.10661, Darmstadt,
Alemanha) e incubado a 30°C/24h. Essas subculturas foram inoculadas em frascos
67

de 250 mL contendo 90 mL de caldo MRS e incubados a 30°C sob agitação constante


a 150 rpm /24 h. Para Pediococcus damnosus DSM 20289 e Pediococcus damnosus
ATCC, uma subcultura foi preparada ao inocular a cultura a 10mL de caldo MRS
modificado (acrescido de 0,5% Cisteína) em frascos de penicilina (Serum bottles), em
condições de anaerobiose, e incubados a 30°C/24 h. Essas subculturas foram
inoculadas em frascos de penicilina, em condições de anaerobiose, contendo 90 mL
de caldo MRS modificado e incubados a 30°C/24 h. As células foram recuperadas por
centrifugação (12000 x g/10 min/4°C) (Thermo Scientific centrifuge Heraeus Multifuge
X3) e lavadas 2 vezes com solução estéril de tampão fosfato salina PBS (pH 5,6).
Após a lavagem, o pellet de células foi ressuspendido em PBS (pH 5,6) a uma
concentração final próximo de 1x1010 UFC mL-1. Para a cepa de levedura
Saccharomyces cerevisiae Saflager W-35/70, uma subcultura foi preparada ao
inocular 10 mL de mosto cervejeiro (12º Plato) e incubado a 25°C/24 h. Essa
subcultura foi inoculada em frasco contendo 290 mL de mosto (12ºPlato) e incubado
sob agitação (150 rpm) a 25ºC/24 h. A levedura de inoculação foi obtida através da
centrifugação (5000 x g/5 min/4°C). Sendo a taxa de inoculação de 0,35g de peso
úmido de levedura para cada 100 mL de mosto a 12º Plato (1,2x107 UFC mL-1).

2.2. Condições da fermentação

Para se obter cerveja do estilo standard american lager, fermentações estáticas


(1000 mL de mosto a 12° Plato) foram realizadas em frascos de 2000 mL e incubados
a 15 °C/168 h. O mosto lupulado (9 IBU), com 20% de maltose de milho, 12° Plato
(OG 1.048) e a pH 5,6, foi produzido e doado pela cervejaria Germânia (Vinhedo -
SP/Brasil). Todos os experimentos foram realizados com uma mesma batelada de
mosto. Depois de fervido (1h), no final do processo de mosturação, o mosto foi
resfriado a 4°C e reservado em frascos de 2000 mL a -20ºC. No momento do
experimento esse mosto foi fundido e pasteurizado a 60°C por 20 min antes do uso
para inativar qualquer micro-organismo contaminante do processo de estocagem.
Para garantir a eficiência da pasteurização, testes de controle negativo, através de
plaquemaneto em meio seletivo para bactérias, foram realizados. Em seguida os
frascos foram inoculados com Saccharomyces cerevisiae Saflager W-35/70, com a
taxa descrita no item anterior, e incubados a 15ºC/168 h.
68

2.3. Lavagem ácida

Após 7 dias de fermentação e estabilização do consumo de açúcares


fermentescíveis, a levedura foi recuperada por centrifugação (5000 x g/10 min) e as
células ressuspendidas no próprio sobrenadante da fermentação (cerveja não
maturada) na proporção de 1g de células (massa úmida) para 5 mL de sobrenadante.
Para simular o processo de lavagem na indústria a suspensão de leveduras foi
alocada em um biorreator encamisado, resfriada a 4ºC com o uso de um banho
ultratermostatizado com circulação (MARCONI - MA-184) e continuamente
homogeneizada através de agitador magnético. Para os regimes de lavagem ácida
realizados (pH 1,5, pH 2 e pH 3) acido fosfórico 85% foi adicionado à suspensão até
a condição almejada. O tratamento foi realizado em até 135 min, contados a partir da
regulação da temperatura e pH (medidor de pH com temperatura compensada AKSO
- AK103) de trabalho. Foram conduzidos, para cada cepa e tratamento, experimentos
distintos (n = 2).

2.4. Enumeração de micro-organismos e viabilidade da levedura

Durante os períodos de tratamento, amostras de 1mL foram coletadas, diluídas


seriadamente em PBS pH 5.6, plaqueadas em MRS ágar para contagem dos
contaminantes (30ºC/72h) e YPD ágar (1% p/v extrato de levedura, 2% p/v peptona
bacteriológica, 2% p/v D-glicose, 0,5% p/v de cloranfenicol) para contagem de células
viáveis de levedura (25°C/72h). Foi adotada a técnica de pour plate para ambos os
plaqueamentos.

2.5. Modelagem matemática da inativação

Vários modelos matemáticos de inativação foram testados, entretanto os de


Weibull e Weibull+cauda foram utilizados por terem se ajustado melhor aos dados.
Para a obtenção dos parâmetros de inativação de cada modelo, os modelos foram
ajustados aos valores experimentais através da ferramenta gratuita para o Microsoft®
Excel, conhecido como GinaFit (Gerraerd et al., 2005). Dois parâmetros foram
utilizados para se avaliar a qualidade do ajuste: o coeficiente de determinação (R2) e
a raiz do erro quadrático médio (RMSE - Root Mean of Square Error). Além dos
parâmetros obtidos, representações gráficas, apresentando os resultados obtidos
experimentalmente e os estimados pelos modelos matemáticos, possibilitaram a
69

averiguação da qualidade do ajuste. Somente os ajustes com R 2> 0,90 foram


considerados.

2.5.1. Modelos matemáticos


2.5.1.1. Weibull e Weibull + cauda

(1)

(2)

Onde Nt/N0 representa taxa de redução decimal no tempo t, N0 a população


inicial microbiana, Nt a densidade populacional no tempo t,Nres a concentração
residual do contaminante, δ é conhecido como o tempo necessário para se atingir a
primeira redução decimal de uma população e p indica o padrão de curvatura. Quando
p> 1, a curva assume um padrão convexo, e quando p<1, padrão côncavo. No caso
de p = 1, a curva descreve um padrão linear de primeira ordem (Mafart et al., 2002,
Albert e Mafart, 2005).

2.6. Análise estatística

Análises de médias por Scott-Knott foram realizadas para se observar as


diferenças significativas (p<0.05) entre os tratamentos aplicados nos diferentes micro-
organismos, através do programa Assistat (Versão 7.7 - Campina Grande, Brasil)
(Silva e Azevedo, 2009).

3. Resultados

Exemplos das curvas de sobrevivência dos micro-organismos deteriorantes de


cerveja tratados a 4ºC, com ácido fosfórico 85% a pH 1,5 e pH 2.0, e ajustados pelos
modelos presentes no add-in GinaFit®, estão representados nas Fig. 1 e 2. Como o
tratamento a pH 3 não apresentou redução decimal significativa para nenhum dos
micro-organismos avaliados, os dados não estão representados nesse estudo. Como
70

apresentado na tabela 1, os modelos que melhor se ajustaram aos dados dos estudos
foram, para todos as cepas, os modelos de Weibull ou Weibull + cauda. A formação
de ombro, cauda ou curvas com padrão côncavos/convexo foram observadas nas
curvas de sobrevivência, o que indica que a utilização do tradicional modelo linear não
se aplica para explicar os dados experimentais do presente estudo.

Para as curvas de sobrevivência de L. brevis DSM 6235 foi observado, para


pH 2, uma formação de ombro, seguido por uma inativação linear e o aparecimento
de uma cauda, ou seja, o ajuste foi realizado pelo modelo Weibull + cauda (Fig.1.).
Para o tratamento a pH 1,5, L. brevis DSM 6235 apresentou um padrão de curvatura
convexo (p < 1) com uma tendência a formação de uma população resistente, o que,
também, permitiu o ajuste da curva ao modelo de Weibull + cauda. Na tabela 2 estão
representados os tratamentos, modelos ajustados, parâmetros cinéticos de inativação
e os valores obtidos para todos os deteriorantes avaliados. Para todos os modelos
ajustados o coeficiente de determinação (R2) foi maior que 0,90 e RMSE (Erro da raiz
quadrada da média) abaixo de 0,7, o que determina um bom ajuste do modelo aos
dados obtidos. Ao avaliar os 2 tratamentos apresentados na figura 1 e tabela 2,
observa-se que quando o tratamento de L. brevis DSM 6235 a pH 1,5 atinge t3D (tempo
para se atingir 3 reduções decimais) em, aproximadamente, 41 min, o tratamento a
pH 2 não atingiu nem 2 reduções decimais. Além de que, o tempo para se atingir a
primeira redução decimal (δ) para o tratamento a pH 1,5 é, aproximadamente, 9 vezes
menor do que para o tratamento a pH 2. Inclusive, ao final do tratamento, enquanto a
população residual (Nres) de L. brevis DSM 6235 tratados a pH 2.0 é de 4,65 Log10
UFC/mL, a do tratamento a pH 1,5 é de, aproximadamente, 1 Log10 UFC/mL.
71

Figura 1. Curvas de sobrevivência de L.brevis (A) e P. damnosus DSM (B) tratados


com ácido fosfórico a pH 1,5 (■) e pH 2 (♦).
72

Figura 2. Curvas de sobrevivência de L. casei (A) e P. damnosus ATCC (B) tratados


com ácido fosfórico a pH 1,5 (■) e pH 2 (♦).

Tabela 1. Ajuste dos modelos aos tratamentos de lavagem ácida.


Modelo Micro-organismo Tratamento R2
L. brevis pH 1,5 0,93
pH 2 0,95
L. casei pH1,5 0,95
Bigelow and J.R. pH 2 0,94
Esty 1920: Log-
P. damnosus DSM pH1,5 0,89
Regressão Linear
pH 2 0,88
P. damnosus ATCC pH 1,5 0,93
pH 2 0,85
L. brevis pH 1,5 0,95
pH 2 NA
Geeraerd et al., L. casei pH1,5 0,92
2000: Log-linear + pH 2 NA
Cauda P. damnosus DSM pH1,5 0,96
pH 2 NA
P. damnosus ATCC pH 1,5 0,95
73

pH 2 0,86
L. brevis pH 1,5 0,95
pH 2 0,95
L. casei pH1,5 0,97
Mafart et al., 2002: pH 2 0,98
Weibull P. damnosus DSM pH1,5 0,97
pH 2 0,89
P. damnosus ATCC pH 1,5 0,98
pH 2 0,98
L. brevis pH 1,5 0,99
pH 2 0,99
L. casei pH1,5 0,99
Albert and Mafart, pH 2 NA
2005: Weibull +
P. damnosus DSM pH1,5 0,88
Cauda
pH 2 0,93
P. damnosus ATCC pH 1,5 NA
pH 2 NA
L. brevis pH 1,5 0,98
pH 2 0,97
L. casei pH1,5 NA
Cerf, 1977: Modelo pH 2 NA
bifasico P. damnosus DSM pH1,5 NA
pH 2 NA
P. damnosus ATCC pH 1,5 0,96
pH 2 0,93
L. brevis pH 1,5 0,98
pH 2 0,98
L. casei pH1,5 NA
Geeraerd et al., pH 2 NA
2005: Bifásico +
P. damnosus DSM pH1,5 NA
ombro
pH 2 NA
P. damnosus ATCC pH 1,5 0,90
pH 2 0,92
NA - dados não se aplicam ao modelo
74

Tabela 2. Parâmetros cinéticos de inativação de bactérias deteriorantes de cerveja.

Micro-organismo Tratamento Modelo Parâmetros Valores

L. brevis pH 1,5 Weibull + cauda δ (min) 4,725a

p 0,61

t3D (min) ±41,42x

R2 0,99

RMSE 0,26

pH 2 Weibull + cauda δ (min) 42,84A

p 1,54

t3D (min) ±98,56X

R2 0,99

RMSE 0,1

pH 1,5 Weibull + cauda δ (min) 4,675a


L. casei
p 1,13

t3D (min) ±11,47y

R2 0,99

RMSE 0,15

pH 2 Weibull δ (min) 10,34B

p 0,84

t3D (min) ±38,40Y

R2 0,98

RMSE 0,23

pH 1,5 Weibull δ (min) 0,65b


P. damnosus DSM
p 0,57

t3D (min) ±4,05y


75

R2 0,97

RMSE 0,49

pH 2 Weibull + cauda δ (min) 6,49C

p 0,6

t3D (min) ±47,00Y

R2 0,93

RMSE 0,67

pH 1,5 Weibull δ (min) 0,95b


P. damnosus ATCC
p 0,65

t3D (min) ±4,75y

R2 0,98

RMSE 0,37

pH 2 Weibull δ (min) 0,78D

p 0,43

t3D (min) ±16,34Y

R2 0,98

RMSE 0,233

A médias dos valores dentro de uma mesma coluna, seguidos de diferentes letras sobrescritas, foram atestados
pelo teste de Scott-Knott e diferem significativamente (p< 0,05).

Na figura 2 e tabela 2 são apresentadas as curvas de sobrevivência,


parâmetros cinéticos e modelos de inativação de L. casei ATCC 334. A curva de
sobrevivência do tratamento a pH 2.0 apresenta uma curvatura convexa (p < 1), porém
muito próximo de um perfil de inativação linear, sendo que o modelo que melhor se
ajustou a curva foi o de Weibull. Contudo, o tratamento a pH 1,5 apresentou uma
inativação, aproximadamente, linear seguida da formação de uma cauda, com o
melhor ajuste ao modelo Weibull + cauda. Os parâmetros do modelo para L. casei
ATCC 334 foram δ, p, t3D e R2. Sendo que, o tempo para se atingir a primeira redução
76

decimal (δ) e 3 reduções decimais (t3D) de L. casei ATCC 334 a pH 1,5 é,


aproximadamente, 2,2 vezes e 3,35 vezes menor do que para o tratamento a pH 2.0,
respectivamente.

Na figura 1 e tabela 2 encontram-se as curvas de sobrevivência, parâmetros


cinéticos e modelos de inativação de P. damnosus DSM 20289. A curva de
sobrevivência a pH 2.0 apresentou um padrão inicial de inativação próximo ao linear,
seguido de uma população mais tolerante. O modelo que melhor se ajustou a esse
tratamento foi o modelo Weibull + cauda. Entretanto, o modelo que melhor se ajustou
ao tratamento a pH 1,5 foi o modelo de Weibull. Assim como para L. casei ATCC 334,
para P. damnosus DSM 20289 os parâmetros cinéticos obtidos através do ajuste
foramδ, p, t3De R2. Nesse caso, o tempo para se atingir t3D para o tratamento a pH 2.0
é, aproximadamente, 11 vezes maior do que para se atingir a mesma eficiência de
inativação a pH 1,5. E ao se comparar a eficiência para se reduzir a primeira
população decimal de P. damnosus DSM 20289, temos que o tratamento a pH 1,5
reduziu essa população, aproximadamente, 10 vezes mais rápido do que o tratamento
a pH 2.

P. damnosus ATCC 29358 foi o único micro-organismo que apresentou, para


ambos os tratamentos, valores de δ aproximados. Para ambos os tratamentos, o
modelo ao qual os dados se ajustaram melhor, foi o de Weibull. Na figura 2 e tabela 2
podemos observar que que o tempo para se atingir t3D, para o tratamento a pH 1,5, foi,
aproximadamente, 3,4 vezes menor do que para o tratamento a pH 2.

A viabilidade celular da levedura cervejeira não apresentou redução logarítmica


significativa em nenhum dos tratamentos (pH 1,5, pH 2 e pH 3) sob o tempo máximo
de exposição (135 min) (tabela 3).

Tabela 3. Variação da viabilidade da levedura nos tratamentos de lavagens ácidas.


Tratamento V0* Vf*
pH 1,5 8,44±0,26 8,39±0,08
pH 2 8,16±0,04 8,20±0,39
pH 3 8,59±0,08 8,56±0,23
V0 - Viabilidade inicial / Vf - viabilidade final / *Log UFC/mL
77

4. Discussão

Esse trabalho de pesquisa demonstrou claramente que os micro-organismos


reconhecidos como deteriorantes de cerveja apresentam resistências diferentes aos
tratamentos empregados. Essas diferenças ficam evidentes ao se observar os
formatos das curvas de sobrevivência de cada micro-organismo tratados a 4ºC, com
ácido fosfórico 85%, a pH 1,5 e pH 2. E, através do uso da modelagem matemática,
foi possível caracterizar as diferenças nos perfis dessas resistências. Perante os
resultados descritos e ilustrados nas figuras 1-2 e tabela 1, duas diferentes formas de
curvas de sobrevivência foram perceptíveis: Côncavo ou convexo (Weibull) e côncavo
ou convexo com a formação de cauda (Weibull + cauda). Na forma de inativação Log
linear, entende-se que, cada célula é caracaterizada por uma sensibilidade/resistência
semelhante para a condição de inativação empregada. Entretanto, grande parte das
curvas de sobrevivência não seguem um padrão linear e exceções em forma de ombro
ou cauda podem ocorrer (Cerf, 1977). A formação de ombro está relacionada a uma
resistência inicial da população, que após certo tempo de exposição ao tratamento,
manifesta um acúmulo de injurias que se torna irreparável e a população reduz de
forma linear (Smelt et al., 2002). Por outro lado, quando uma curva de sobrevivência
apresenta a formação de cauda, entende-se que parte da população mais sensivel ao
tratamento é eliminada, seguido de uma população mais resistente que a anterior
(Peleg, 2000). Curvas de sobrevivência não lineares, que apresentam padrões
côncavos ou convexos, podem ser explicados pela existência de uma distribuição de
células sensíveis perante uma população total. Nas curvas convexas, células
sobreviventes encontram-se mais injuriadas com o crescente tempo de exposição ao
fator de inativação, como tal, a taxa de inativação aumenta. Para as curvas côncavas,
por outro lado, primeiramente a subpopulação mais sensível é afetada, seguido de um
enfraquecimento da segunda subpopulação mais resistente, até que a mesma é
eliminada (Peleg, 2000).

Para todos os micro-organismos avaliados, a condição de pH 2 (intervalo


comumente utilizado no processo de lavagem ácida da indústria cervejeira) se
mostrou menos eficiente em comparação a lavagem ácida realizada a pH 1,5. As
diferenças na eficácia dos tratamentos foram expressivas quando avaliamos L. brevis
DSM 6235, P. damnosus DSM 20289 e P. damnosus ATCC 29358, os principais
78

contaminantes encontrados na levedura de reinoculação e no produto final (Simpson,


1987, Bokulich e Bamforth, 2013).

Por exemplo, se a redução alvo para os deteriorantes da indústria cervejeira


fosse de 3 log10, teríamos para a inativação ácida, na condição mais próxima aplicada
na indústria (pH 2 / 120 min), uma inativação eficiente. Pois, a 120 min de tratamento,
a população de L. brevis DSM 6235 apresentou uma redução superior a 3 log10.
Todavia, o tratamento a pH 1,5 gerou 3 reduções decimais em, aproximadamente, 1/3
do tempo total de tratamento. Para P. damnosus DSM 20289 e P. damnosus ATCC
29358 o tratamento a pH 2, também, se mostrou eficiente, pois o tempo para se atingir
t3D foi de, aproximadamente, 47 min para a primeira e 16 min para a segunda cepa,
respectivamente. Entretanto, quando P. damnosus DSM 20289 e P. damnosus ATCC
29358 foram tratados a pH 1,5 o tempo para se atingir a mesma eficiência foi,
aproximadamente, 11 vezes menor (~ 4 min) para a cepa DSM e 3,4 vezes menor (~
5 min) para a cepa ATCC, quando comparado ao tratamento a pH 2. Apesar dos
valores de δ para o tramento a pH 1,5 das cepas de P. damnosus DSM e ATCC não
apresentarem diferença significativa (p >0,05), a pH 2 o valor de δ foi
significativamente diferente (p < 0,05) e, aproximadamente, 8 vezes maior para P.
damnosus DSM. Essa variabilidade de sobrevivência a tratamentos ácidos e/ou
térmicos intra-espécies, como encontrado para P. damnosus nesse estudo, já foi
demonstrado por diversas bactérias Gram-positivas e negativas em outros trabalhos
(Whitining e Golden, 2002, Lianou et al., 2006, Rodríguez-Calleja et al., 2006).

A inativação de L. brevis DSM 6235, tratado a pH 2, apresentou uma população


inicial resistente a condição imposta, sendo que o tempo para a primeira redução
decimal foi de, aproximadamente, 43 min. Sendo, L. brevis DSM 6235, a cepa que
apresentou o maior valor de δ (p<0,05) quando tratando a pH 2. Posteriormente, uma
população mais sensível aos efeitos deletérios do ácido fosfórico foi afetada,
apresentando um padrão linear de inativação. Ao final do tratamento, evidenciou-se
uma população mais resistente que as anteriores, com a formação de uma cauda. Por
outro lado, a inativação de L. brevis DSM 6235 tratados a pH 1,5, apresentou uma
subpopulação inicial mais susceptível aos efeitos do tratamento, com um valor de δ
de 4,72 min. Em seguida uma subpopulação mais resistente, ao fator de inativação
que persistiu até o final do tratamento. L.brevis DSM 6235 foi o único micro-organismo
que apresentou o valor de t3D significativamente superior (p < 0,05) as outras cepas
79

estudadas para ambos os tratamentos a pH 2 e pH 1,5. Diferenças no formato das


curvas de sobrevivência e eficiência na inativação, dependentes da alteração de pH
do tratamento, foram observadas para Listeria innocua ATTCC 33090 tratada em meio
BHI com ácido láctico em diferentes valores de pH ácido (Janssen et al., 2007).
Quando a bactéria Gram-positiva era tratada a pH entre 4 e 4.5, as curvas de
sobrevivência apresentaram ombro inicial seguido de uma inativação linear, sendo
que algumas curvas apresentavam também a formação de cauda. Entretanto, ao se
tratar o mesmo micro-organismo a pH próximo a 3.5, as curvas de sobrevivência
tendiam para uma inativação próxima da linear.

Os resultados obtidos para P. damnosus DSM e ATCC se assemelham a dados


obtidos por Panagou et al., (2007), no qual ao aplicar diferentes faixas de alta pressão
hidrostática em peixe e em solução tampão contaminado com P. damnosus, pode-se
observar um bom ajuste do modelo de Weibull as curvas de inativação. Nesse trabalho
os parâmetros δ e p foram dependentes da variação de pressão. No presente estudo,
ao se tratar o P. damnosus DSM em uma matriz de cerveja e leveduras, a cepa só
aprensentou dependência na alteração de pH para o parâmetro δ. Sendo que para pH
1,5 o valor de δ foi de 0,65 min, enquanto para o tratamento a pH 2 o valor obtido foi
dez vezes maior.

Apesar da espécie L. casei não ser uma das principais preocupações como
contaminante da indústria cervejeira, ela, assim como outros Lactobacillus, está
presente nas matérias-primas e sua entrada na planta é considerada frequente e
inquestionável (Bokulich e Bamforth, 2013). Para L. casei ATCC 334 o tratamento a
pH 2 apresentou um padrão de inativação próximo ao linear, contudo, segundo o
modelo de melhor ajuste (Weibull – R2 = 0,98 e RMSE = 0,23) o valor do padrão de
curvatura p, sendo menor que 1 (p = 0,84), indica uma concavidade. O tratamento a
pH 1,5 inativou a cepa de uma forma inicial linear, seguido da formação de uma cauda.
Nesse caso, uma subpopulação inicial menos resistente foi inativada mais
rapidamente até restar a subpopulação mais resistente ao tratamento com a formação
de uma cauda. Mais uma vez o tratamento a pH 1,5 foi mais eficiente que o tratamento
tradicional, pois ao se comparar o tempo para se atingir t3D, o tratamento a pH 1,5 foi,
aproximadamente, 3,3 vezes mais rápido.
80

Esses resultados, provavelmente, estão relacionados aos efeitos


antimicrobianos dos ácidos e a relação entre pKa e pH. As atividades antimicrobianas
dos ácidos seguem duas teorias: (1) a dissociação do ácido em meio líquido e a
liberação de prótons que reduz o pH extracelular, e (2) o potencial de difusão do ácido,
na sua forma não dissociada, pela parede e membrana celular, que afeta o
metabolismo celular. Este último é reportado como sendo o principal causador de
inibição/inativação microbiana, devido à acidificação do citoplasma e, a uma mais
específica, inibição de diversas funções metabólicas e anabólicas (Janssen et al.,
2007). Sendo o pKa do ácido fosfórico 2,12, quando o pH de uma solução está próximo
desse valor a forma dissociada e não dissociada encontram-se em equilíbrio.
Entretanto, ao se reduzir o pH de uma solução, como, por exemplo, para pH 1,5, o
equilíbrio se direciona para a forma não dissociada. Portanto, ao seu reduzir o pH da
lavagem ácida a valores abaixo do pKa do ácido fosfórico, há acúmulo da forma não
dissociada no ambiente extracelular, que por consequência, leva a um aumento do
fluxo da forma não dissociada para o interior da célula bacteriana (Stratford et al,
2013). Com isso, uma maior eficiência da acidificação citoplasmática e inativação
microbiana são atingidos. Outro fator que pode estar associado à eficiência da
inativação bacteriana está relacionado à presença de componentes presentes no
lúpulo, conhecidos como iso-alfa-ácidos. Esses ácidos fracos são reconhecidos há
muitos anos como os principais agentes de controle de contaminação de cerveja por
bactérias Gram-positivas (Sakamoto et al., 2003). Portanto, o fluxo desses
conservantes naturais presentes na cerveja, pode ter sido favorecido pelo tratamento
a pH 1,5.

A lavagem ácida vem sendo utilizada pelos cervejeiros há mais de 100 anos
como uma estratégia eficiente de redução de bacterias contaminantes do processo
sem afetar adversamente a qualidade da fisiologia da levedura (Cunningham e
Stewart, 2000). Leveduras são reconhecidas por possuírem resistência natural a
condições ácidas, entretanto, se outras condições ambientais se mostrarem
desfavoráveis, a resistência da levedura cervejeira pode cair. (Simpson e Hammond,
1989). A eficiência da lavagem ácida da levedura de reinoculação está diretamente
relacionada à resistência da levedura às condições ácidas ser maior que as das
bactérias contaminantes (Simpson e Hammond, 1989). As leveduras são
reconhecidas como resistentes a ácidos fracos devido a ejeção de prótons via a
81

proteína de membrana conhecida como bomba de prótons H +-ATPase (Carmelo et


al., 1997, Cole e Keenan, 1987, Holyoak et al., 1996). Essa bomba possui uma
eficiência de remoção de prótons do citoplasma, em uma condição normal de
estequiometria, de 1 próton/ATP (Cid et al., 1987).

Através dos dados do presente estudo é possível concluir que a resposta de


inativação das cepas contaminantes é dependente do pH do ácido utilizado. Além
disso, a redução do pH em 0,5 é suficiente para obter inativações mais eficientes em
relação a carga de redução microbiana por tempo de exposição ao tratamento, sem
prejudicar a viabilidade da levedura cervejeira. A aplicação da microbiologia preditiva
de alimentos para a obtenção de parâmetros de inativação se mostrou fundamental
para a avaliação da eficiência do tratamento aplicado. Tendo em vista a variabilidade
intra e inter-espécies do tratamento aplicado, a abordagem preditiva pode ser útil para
uma avaliação das cepas referência para estudos futuros de tratamentos ácidos.

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2003. A model for lactic acid induced inhibition of Yersinia enterocolitica in mono- and
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Whiting, R.C., Golden, M.H., 2002. Variation among Escherichia coli O157:H7 strains
relative to their growth, survival, thermal inactivation, and toxin production in broth.
International Journal of Food Microbiology. v. 75, p. 127-133.
87

Capítulo 3: Modelagem da lavagem ácida eda


lavagem com dióxido de cloro da levedura
cervejeira de reinoculação para a inativação de
bactérias contaminantes e manutenção da
viabilidade
88

Modelagem da lavagem ácida e da lavagem com dióxido de cloro da levedura


cervejeira de reinoculação para a inativação de bactérias contaminantes e
manutenção da viabilidade

Allan Richard Gomes Munford1, Rafael Djalma Chaves1, Anderson de Souza


Sant’Ana1#

1 Faculdade de Engenharia de alimentos, Universidade Estadual de Campinas, São


Paulo, Campinas, Brasil.

Artigo formatado de acordo com as normas de submissão da revista “Food


Microbiology”
89

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi otimizar o procedimento de lavagem do fermento


cervejeiro visando-se inativação de contaminantes sem, no entanto, afetar a
viabilidade da levedura cervejeira. Os processos de lavagem do fermento cervejeiro
foram conduzidos com ácido fosfórico e dióxido de cloro. As variáveis independentes
para a lavagem ácida foram: pH (1-3) e temperatura (1-9°C). Já para a lavagem com
dióxido de cloro foram: concentração do sanitizante (10-90 mg/L) e a temperatura (5-
25°C). Para ambos os tratamentos foram desenhados, através do delineamento
composto central rotacional (DCCR), 11 ensaios independentes, sendo 3, no ponto
central. O micro-organismo alvo dos processos de lavagem ácida e com dióxido de
cloro foi Lactobacillus brevis DSM 6235. Os modelos preditivos obtidos para as 4
variáveis resposta γLA, γCl (redução decimal do contaminante), Vf/V0LA e Vf/V0Cl (razão
da viabilidade da levedura cervejeira), apresentaram R2> 0,80 e valores de Fcalculado>
Ftabelado, portanto considerados preditivos e estatisticamente significantes (p < 0,1). Ao
melhor conhecimento dos autores, este é o primeiro estudo para otimização da
lavagem do fermento cervejeiro com ácido fosfórico ou dióxido de cloro visando-se a
inativação de contaminantes comuns do processo de fermentação. Os resultados
indicaram que as lavagens com ácido fosfórico e dióxido de cloro resultaram em 7 e
6,4 (Log UFC/mL) reduções decimais de L. brevis DSM 6235, respectivamente. Já a
viabilidade da levedura cervejeira variou de 22,3 a 99,4%, dentre os tratamentos
aplicados. A inativação de L. brevis DSM 6235 foi influenciada significativamente pelos
parâmetros pH (Q) e T°C (Q), quando aplicado ácido fosfórico e pelos parâmetros
mg/L (L), mg/L (Q), T°C (Q) e mg/L x T°C quando aplicado ClO2. A validação dos
modelos foi realizada dentro do intervalo dos parâmetros estabelecidos no ensaio,
apresentando valores, dos fatores bias (γLA: 0,93 / Vf/V0LA:0,99 – γCl: 1,0 / Vf/V0Cl: 0,99)
e exatidão (γLA: 1,12 / Vf/V0LA: 1,01 – γCl: 1,08 / Vf/V0Cl: 1,03), próximos a 1. Os
resultados deste trabalho indicam que se o fermento cervejeiro for tratado nas
condições otimizadas estabelecidas, este poderá ser reaproveitado sem
comprometimento da viabilidade da levedura, o que resultará em redução de custos e
menor geração de rejeitos industriais.

Palavras-chave: cerveja, descontaminação, fermentação, mosto, bactérias


deteriorantes, microbiologia preditiva.
90

1. INTRODUÇÃO

No ambiente industrial cervejeiro, a levedura que é recuperada no final do


processo de fermentação, conhecida como levedura de reinoculação, é apontada
como importante fonte de bactérias deteriorantes (OGDEN, 1987). Bactérias dos
gêneros Acetobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Lactobacillus, Obesumbacterium
e Pediococcus tem sido isoladas a partir de leveduras de reinoculação (SIMPSON,
CALEDONIAN, LIMITED, 1987)

Dentre os gêneros citados, as bactérias ácido láticas são reconhecidamente


responsáveis por aproximadamente 70% das contaminações presentes nas
cervejarias (SUZUKI et al., 2006a, 2006b). Dentre as bactérias láticas, as espécies
mais frequentemente detectadas em indústrias cervejeiras são: Lactobacillus brevis e
Pediococcus damnosus(BACK, 1994). Dentre estas, L. brevis pode ser considerado o
responsável por 40% do total de cerveja deteriorada (HOLLEROVÁ, KUBIZNIAKOVÁ,
2001), sendo, desta forma reconhecido como o contaminante mais temido pelos
mestres cervejeiros. A preocupação com a presença deste micro-organismo no
ambiente de produção da cerveja pode ser explicada por sua capacidade de alterar
as características sensoriais do produto final e super atenuar o processo fermentativo,
ou seja, consumir os açúcares fermentescíveis disponíveis no mosto (BACK, 2006,
PRIEST, 2003, VAUGHAN, O’SULLIVAN, VAN SINDEREN, 2005)

Em virtude de seu potencial para deteriorar a cerveja e causar grandes perdas,


as indústrias cervejeiras lançam mão de rigorosos procedimentos de limpeza e
sanificação. Apesar disso, sabe-se que o controle da contaminação do ambiente do
processo de fabricação da cerveja, equipamentos e pessoal, não garantirá a
eliminação completa de contaminantes. A possibilidade de contaminação se torna
ainda mais crítica em processos de fermentação, nos quais parte ou todo fermento é
reutilizado. Especificamente no processo de fabricação de cervejas há, muitas vezes,
a necessidade de se reutilizar o fermento para novas propagações e processos de
fermentação (VERBELEN et al., 2009). A reutilização do fermento se justifica por
questões ambientais e financeiras (BÜHLIGEN et al., 2013). No entanto, ela não deve
resultar em perda da qualidade do produto e, portanto, a garantia da qualidade do
fermento é fator crucial para permitir sua reutilização. Por este motivo, há mais de um
século as indústrias cervejeiras tem aplicado o processo de lavagem ácida
91

(CUNNINGHAM, STEWART, 2000). Este processo é reconhecido como um


tratamento eficiente, pois é capaz de causar entre 2 e 6 reduções decimais na
contagem de bactérias contaminantessem, no entanto, afetar a capacidade
fermentativa e fisiologia da levedura cervejeira (SIMPSON, 1987, SIMPSON,
HAMMOND, 1989). Apesar disso, diferentes protocolos de lavagem do fermento
cervejeiro podem ser utilizados por diferentes cervejarias. Este processo de lavagem
pode também ser aplicado ao fermento cervejeiro ao final de todo processo
fermentativo, enquanto em outras indústrias este procedimento só é realizado quando
alguma contaminação bacteriana relevante é observada (CUNNINGHAM, STEWART,
2000). As condições de lavagem mais utilizadas pela indústria cervejeira constituem-
se de adição de ácido fosfórico de grau alimentício até se atingir pH 2 (± 0,2) e
temperatura do processo menor que 5°C, por não mais que 120 min (SIMPSON,
HAMMOND, 1989, STEWART, HILL, RUSSELL, 2013). O ácido fosfórico é o único
ácido inorgânico utilizado na indústria de alimentos, sendo o segundo ácido mais
utilizado nesse ramo. Dos acidulantes alimentares o ácido fosfórico é o que produz o
menor pH quando se considera a mesma quantidade de ácido adicionado ao alimento,
isso devido aos seus baixos valores de Ka e pKa (7,52 x 10-3 e 2,12,
respectivamente), em comparação com outros ácidos fracos (DZIEZAK, 2003).

A aplicação de ácido fosfórico tem como vantagens ser um ácido inorgânico


fraco de baixo custo, reduz o pH da suspensão de leveduras de forma moderada e
não influenciar o pH final da cerveja (SIMPSON, HAMMOND, 1989), mas possui
desvantagens, como não ser eficiente para a redução de alguns contaminantes do
processo cervejeiro como, como por exemplo a espécie Shimwellia pseudoproteus
(anteriormente classificada como Obesumbacterium proteus) (SIMPSON,
CALEDONIAN, LIMITED, 1987). Por conta disso, a indústria tem buscado outras
alternativas para inativação microbiana através de sanificantes. Dentre os principais
agentes utilizados para sanificação, destaca-se o dióxido de cloro líquido (ClO2(L)).

O dióxido de cloro líquido (ClO2(L)) é um sanificante amplamente utilizado na


atualidade para finalidades diversas relacionadas à inativação microbiana
(TRINETTA, MORGAN, LINTON, 2012). O ClO2(L) tem sido considerado como
potencial sanitizante para o processamento de vegetais, peixes, carne vermelha e
aves (GÓMEZ-LÓPEZ, 2012, HONG et al., 2008, SHEEN, HWANG, JUNEJA,
2011).ClO2(L) é um forte oxidante e agente de ampla e alta ação biocida contra algas,
92

deteriorantes de alimentos e patógenos (GÓMEZ-LÓPEZ, 2012, JUNLI et al., 1997,


KIM, KIM, SONG, 2009, VANDEKINDEREN et al., 2009). O ClO2(L) pode ser utilizado
para lavagem e sanitização de superfícies que entram em contato com alimentos e
diretamente aplicado nos alimentos.

A utilização de dióxido de cloro, para reduzir a contaminação de leveduras de


reinoculação, já foi estudada para processos da indústria de etanol (MENEGHIN et
al., 2008). Entretanto, ao melhor conhecimento dos autores, nenhum trabalho foi
publicado, até o presente momento, sobre as faixas de temperatura e concentração
de dióxido de cloro, nos quais seriam ideais para o tratamento das leveduras de
reinoculação na indústria cervejeira. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho
foi de otimizar processos de lavagem ácida e da lavagem com dióxido de cloro
visando-se a inativação de contaminantes comuns do processo cervejeiro (L. brevis
DSM 6235) e manutenção da viabilidade da levedura cervejeira.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Micro-organismos e condições de cultivo

A cepa de bactéria lática utilizada nesse estudo foi L. brevis DSM 6235. A cepa
de levedura S. cerevisiae Saflager W-35/70 (Fermentis®), amplamente utilizada no
processo de fabricação de cerveja. As culturas foram mantidas congeladas a -20ºC
em criotubos contendo meio MRS (de Man, Rogosa and Sharp - Merck 1.10661,
Darmstadt, Alemanha) para L. brevis e YPD (1% p/v extrato de levedura, 2% p/v
peptona bacteriológica e 2% p/v D-glicose) para a levedura

Para as cepas de L. brevis DSM 6235, uma subcultura foi preparada ao inocular
10 mL de caldo MRS, seguindo-se incubação a 30°C por 24h. Essas subculturas foram
inoculadas em frascos de 250 mL contendo 90 mL de caldo MRS, seguindo-se
incubação a 30°C sob agitação constante (150 rpm por 24h, orbital shaker incubator
G24, New Brunswick Scientific Co., Inc, Edison, NJ, USA). As células foram
recuperadas por centrifugação (14000g, 10 min, 4°C) (Thermo Scientific centrifuge
Heraeus Multifuge X3, Waltham, MA, USA) e lavadas 2 vezes com solução estéril de
tampão fosfato salina PBS (pH 5,6). Após a lavagem, o pellet de células foi suspendido
em PBS (pH 5,6) a uma concentração de aproximadamente 10 10 UFC/mL. Para S.
cerevisiae Saflager W-35/70, uma subcultura foi preparada ao inocular 10 mL de
mosto cervejeiro (12º Plato), seguindo-se incubação a 25°C por 24 h. Essa subcultura
93

foi inoculada em frasco contendo 290 mL de mosto (12ºPlato), seguindo-se outro


período de incubação sob agitação (150 rpm) a 25ºC por 24 h. O inoculo delevedura
foi após a centrifugação (4800 × g, 5 min, 4°C), sendo a taxa de inoculação de 0,35g
de peso úmido de levedura para cada 100 mL de mosto a 12º Plato (~1,2x10 7
UFC/mL).

2.2 Condições da fermentação

Fermentações estáticas (1000 mL de mosto a 12° Plato) foram realizadas em


frascos de 2000 mL incubados a 15 °C por 168 h. O mosto lupulado (9 IBU), com 20%
de maltose de milho, 12° Plato (OG 1.048) e a pH 5,6, foi produzido e doado por uma
cervejaria localizada na região de Campinas, SP, Brasil. Todos os experimentos foram
realizados com uma mesma batelada de mosto. Depois de fervido, no final do
processo de mosturação, o mosto foi resfriado a 4°C e reservado em frascos de 2000
mL a -20ºC. Antes do experimento o mosto foi fundido e pasteurizado a 60°C por 20
min. Em seguida os frascos contendo mosto foram inoculados com S. cerevisiae
Saflager W-35/70, com a taxa descrita no item anterior, seguindo-se incubação a 15ºC
por 168 h. Amostras de mosto não inoculado constituíram o controle negativo.

2.3 Regimes de lavagem

Após 7 dias de fermentação e estabilização do consumo de açúcares


fermentescíveis, mensurados através da avaliação da redução do grau Brix (PAL-1,
ATAGO, Tokyo, Japão), as células de levedura foram recuperadas por centrifugação
(4,000 × g por 10 min). A seguir as células foram ressuspendidas no próprio
sobrenadante da fermentação (cerveja não maturada) na proporção de 1g de células
(massa úmida) para 5 mL de sobrenadante. Então, a suspensão de leveduras foi
alocada em um biorreator encamisado, seguindo-se resfriamento a 4ºC com o uso de
um banho ultratermostatizado com circulação (MA-184, MARCONI, Piracicaba, SP,
Brasil). O conteúdo do biorreator foi continuamente homogeneizado através de
agitador magnético.

Para os regimes de lavagem ácida realizados, ácido fosfórico 85%, de grau


alimentício, foi adicionado à suspensão até a condição apresentada na tabela 1. O
tratamento foi aplicado por 120 min, sendo que o tempo foi contado a partir do
momento em que a temperatura e pH (AK103, AKSO, São Leopoldo, RS, Brasil)
desejados foram atingidos. Para o regime de lavagem com o agente sanificante,
94

dióxido de cloro líquido (Sealed Air Corporation, Brasil) foi adicionado a suspensão
até as condições apresentadas na tabela 2. O tratamento foi aplicado por 30 min,
contados a partir do momento em que a temperatura e concentração do sanitizante
foram atingidos.

2.4 Enumeração de micro-organismos

No tempo inicial (N0) e no final do tratamento (Nf), amostras de 1mL foram


coletadas, seguindo-se diluições decimais em PBS pH 5.6, e plaqueamento em MRS
ágar para contagem de bactérias láticas (30ºC/72h). Após período de incubação, as
colônias foram enumeradas e os resultados expressos como unidades formadoras de
colônias (UFC) por mL, para cada ponto de amostragem. A viabilidade da levedura foi
aferida, tanto nos pontos iniciais (N0), quanto finais (Nf) de todos os ensaios, através
do método de coloração por azul de metileno e contagem de células por câmara de
Neubauer (HEGGART et al., 2000).

2.5 Delineamento experimental, análises estatísticas e validação dos modelos


desenvolvidos

Dois delineamentos compostos centrais rotacionais (DCCR) foram adotados


visando-se a otimização das lavagens e obtenção de modelos de segunda ordem
capazes de predizerem a eficiência da inativação das bactérias láticas (contaminantes
do fermento) (número de reduções decimais, γ, em log UFC/mL), ao mesmo tempo
que resultavam em manutenção da viabilidade da levedura cervejeira (razão entre
viabilidade final e a inicial da levedura cervejeira – Vf/V0). Os DCCR’s foram compostos
de um delineamento fatorial 22, 4 pontos axiais e 3 pontos centrais, totalizando 11
ensaios independentes cada (2k + 2*k + 3n0). Os níveis desses delineamentos estão
apresentados nas tabelas 1 e 5.As faixas foram estabelecidas através de dados
obtidos na literatura (CUNNINGHAM, STEWART, 2000, MENEGHIN et al., 2008,
SIMPSON, 1987, SIMPSON, HAMMOND, 1989) e experimentos prévios (resultados
não apresentados). As tabelas 1 e 5 apresentam as matrizes com os valores reais e
codificados para cada variável analisada. Para a análise estatística dos dados e a
geração de gráficos de superfície de resposta, o programa STATISTICA 8.0 (Statsoft
Inc., Tulsa, OK, USA) e Protimiza Experimental design (Protimiza Inc, Campinas, SP,
Brasil) foram utilizados. A qualidade de ajuste da equação do modelo preditivo foi
expressa pelo coeficiente de determinação (R2) e sua significância estatística foi
95

determinada pelo F test (Analise de variância – ANOVA). Os fatores Bias e exatidão


foram calculados como descrito por Ross (ROSS, 1996).

3. RESULTADOS

3.1 Otimização da lavagem ácida

Os resultados dos processos de lavagem ácida do fermento cervejeiro em


função do pH e temperatura são mostrados na tabela 1. Pode-se observar que a
variação de pH e temperatura de lavagem ácida impactou no número de reduções
decimais (γLA) e razão da viabilidade final e inicial (Vf/V0LA). De um modo geral, quanto
menor o pH da solução de lavagem, maior o valor de γLA. De acordo com os resultados
mostrados na tabela 1, a condição que resultou em valores maiores deγLA e Vf/V0LA foi
a conduzida com pH 1.3 e temperatura de 2,1°C. Neste experimento, o γLA obtido foi
de 6,9 Log UFC/mLe a Vf/V0LA foi de 98,9 % (tabela 1). Por outro lado, as condições
que resultaram em menores γLA após 120 min de tratamento (0,2, 0,9, 1,6 e 2,7 logs
UFC/mL), foram os ensaios 6, 2, 4 e 7, respectivamente. Já os experimentos 3 e 5
resultaram nos piores valores de viabilidade do fermento cervejeiro: 22,3 e 29,5 %,
respectivamente. Ao se analisar os resultados obtidos nos experimentos conduzidos
com pH 1,3 e temperatura de 2,1°C e 7,1°C, pode-se observar que a temperatura
parece ter um papel relevante na perda da viabilidade do fermento cervejeiro em
baixos valores de pH. Por outro lado, quando o pH da lavagem ácida foi igual a 2,7,
observou-se que a variação da temperatura não impactou na perda de viabilidade do
fermento (tabela 1). Os ensaios 3 e 5 deixam claro, o fato de que os binômios de baixo
pH e altas temperaturas são deletérias para a levedura cervejeira. Os valores de γLA
e Vf/V0LA do fermento cervejeiro, obtidos quando os experimentos foram conduzidos
nas condições descritas nos pontos centrais (9-11), apresentaram pequena variação,
indicando, portanto, boa reprodutibilidade dos dados.
96

Tabela 1. DCCR com os valores reais e codificados para as respostas de redução


decimal (γLA) em Log UFC/mL e razão da viabilidade final e inicial (Vf/V0LA) da lavagem
ácida.
Valores experimentais Parâmetros
Ensaios pH T°C γLA Vf/V0LA
1 1,3 (-1) 2,16 (-1) 6,97 98,76
2 2,7 (+1) 2,16 (-1) 0,90 96,84
3 1,3 (-1) 7,8 (+1) 6,65 22,33
4 2,7 (+1) 7,8 (+1) 1,63 95,92
5 1 (-1,41) 5 (0) 7,08 28,53
6 3 (+1,41) 5 (0) 0,20 95,04
7 2 (0) 1 (-1,41) 2,79 91,89
8 2 (0) 9 (+1,41) 5,01 96,87
9 2 (0) 5(0) 5,21 92,14
10 2 (0) 5(0) 5,35 91,19
11 2 (0) 5(0) 4,77 90,87

A tabela 2 apresenta os resultados do teste de significância para os coeficientes


de regressão do modelo polinomial da lavagem ácida. Tendo em vista a grande
variabilidade inerente aos bioprocessos que envolvem micro-organismos, foram
considerados os parâmetros com p-valores menores que 10% (p < 0,1) (RODRIGUES,
IEMMA, 2014). Os resultados indicam que os coeficientes mais significativos, para γLA,
foram os quadráticos para pH e temperatura, sendo ambos responsáveis pela redução
do valor de γLA. Nenhum efeito significativo para γLA foi observado pela interação de
pH e temperatura (p > 0,1). Isso sugere que a interação entre essas variáveis não
afeta o γLA. Para a razão da viabilidade todos os coeficientes se mostraram
significativos (p < 0,1), porem o coeficiente linear de pH apresentou um grande
impacto no aumento da razão da viabilidade, já os coeficientes pH quadrático e
temperatura linear apresentaram influências significativamente semelhantes na
redução da razão da viabilidade (p< 0,1). Para viabilidade a interação entre as
variáveis pH e temperatura se mostrou significativa (p < 0,1), portanto a interação
dessas variáveis influência a resposta do parâmetro em questão. Apesar de alguns
coeficientes não se mostrarem significativos através dos testes estatísticos
empregados, todos foram mantidos nos modelos polinomiais obtidos. Pois, segundo
Rodrigues e Iemma, ao seu utilizar os valores reais para a geração do modelo
polinomial o mesmo não deve ser reparametrizado (RODRIGUES, IEMMA, 2014). As
equações 1 e 2 demonstram os modelos matemáticos polinomiais (valores reais)
97

descrevendo os efeitos do pH e temperatura nos valores de γLA e a razão da


viabilidade para a lavagem ácida da levedura cervejeira:

γ𝐿𝐴 = 5,99 + 1,01 ∗ pH − 1,34 ∗ pH 2 + 0,56 ∗ T − 0,06 ∗ T 2 + 0,13 ∗ pH ∗ T

(1)

𝑉𝑓
= 28,50 + 99,96 ∗ pH − 29,48 ∗ pH 2 − 23,76 ∗ T + 0,16 ∗ T 2 + 9,50 ∗ pH ∗ T
𝑉0 𝐿𝐴

(2)

Tabela 2. Coeficientes de regressão dos modelos polinomiais para a lavagem ácida


para redução decimal e razão da viabilidade.
Erro
Parâmetros Coeficientes de regressão GL p-valor
padrão
γLA(Log UFC/mL)
média 5,99 - 1,362 0,048
pH 1,01 1 1,104 0,455
pH2 -1,34 1 0,256 0,034
T°C 0,56 1 0,224 0,129
T°C2 -0,06 1 0,016 0,052
pH x T°C 0,13 1 0,077 0,223
Erro
Parâmetros Coeficientes de regressão GL p-valor
padrão
Vf/V0LA (%)
média 28,509 - 4,499 0,024
pH 99,960 1 3,648 0,001
pH2 -29,485 1 0,846 0,001
T°C -23,767 1 0,741 0,001
T°C2 0,166 1 0,053 0,088
pH x T°C 9,509 1 0,253 0,001
GL – Graus de liberdade

Para a variável dependente γLA os resultados apresentaram excelente correlação e o


coeficiente de determinação foi de 0,97 e o Fcalc foi de 39,45 (Ftabelado = 3,45). Para a
variável Vf/V0LA o coeficiente de determinação foi de 0,87 e o Fcalc foi de 7,2 (Ftabelado =
3,45), sendo esses valores satisfatórios, tendo em vista que o processo envolve
variáveis biológicas (tabelas 3 e 4). Para ambas variáveis dependentes o Fcalc foi maior
que o Ftabelado, o que tornou possível a geração de superfícies de resposta e a obtenção
de modelos matemáticos. Esses modelos são considerados preditivos e
98

estatisticamente significativos a um intervalo de confiança de 90% (RODRIGUES,


IEMMA, 2014).

Tabela 3. ANOVA para o modelo de redução decimal (γLA) da lavagem ácida


Fonte de Soma dos Graus de Quadrado
Fcalc p-valor
variação quadrados liberdade médio
Regressão 60,22 5 12,04 39,45 <0,00001
Resíduos 1,53 5 0,31
Total 61,75 10
R2 = 0,97 / Ftab = 3,45

Tabela 4. ANOVA para o modelo da razão da viabilidade (Vf/V0LA ) da lavagem ácida


Fonte de Soma dos Graus de Quadrado
Fcalc p-valor
variação quadrados liberdade médio
Regressão 6660,40 5 1332,08 7,02 < 0,00001
Resíduos 948,79 5 189,76
Total 7609,19 10
R2 = 0,87 / Ftab = 3,45

As figuras 1 e 2 apresentam as superfícies de resposta referentes aos modelos


polinomiais de segunda ordem para γLA e razão da viabilidade (Vf/V0LA),
respectivamente. Para que a lavagem ácida seja considerada eficiente, a levedura
deve apresentar uma manutenção da sua viabilidade e a eficiência da redução do
contaminante deve ser máxima. Portanto, para se definir as melhores condições, as
figuras 1 e 2 devem ser analisadas simultaneamente. Com isso, as análises das
figuras revelam que as melhores condições para a inativação se encontram nas faixas
de pH 1,3 a 2 e de temperatura entre 1 a 5 °C. Porém, combinações de baixos pH e
temperaturas mais elevadas reduzem consideravelmente a porcentagem de células
viáveis de leveduras.
99

Fig. 1 Superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para redução decimal (γ LA Log UFC/mL) em
função do pH e temperatura (°C).

Fig 2. Superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para manutenção da viabilidade da levedura
(Vf/V0LA) em função do pH e temperatura (°C).

3.2 Otimização da lavagem com dióxido de cloro

O delineamento composto central rotacional (DCCR) para lavagem com dióxido


de cloro líquido (ClO2(L)) com as variáveis independentes mg/L e temperatura (°C), e
as variáveis dependentes γCl (Log UFC/mL) e Vf/V0Cl, estão apresentadas na tabela 5.
100

Tabela 5. DCCR com os valores reais e codificados para as respostas de redução


decimal (γCl) em Log UFC/mL e razãoda viabilidade final e inicial (Vf/V0Cl) da lavagem
com dióxido de cloro.
Valores experimentais Parâmetros
Ensaios mg/L T°C γCl Vf/V0Cl
1 22 (-1) 8 (-1) 0,26 98,89
2 78 (+1) 8 (-1) 5,37 95,58
3 22 (-1) 22 (+1) 5,17 97,82
4 78 (+1) 22 (+1) 6,27 52,58
5 10 (-1,41) 15 (0) 1,74 99,41
6 90 (+1,41) 15 (0) 6,32 87,52
7 50 (0) 5 (-1,41) 5,36 98,49
8 50 (0) 25 (+1,41) 6,41 86,59
9 50 (0) 15 (0) 4,51 98,17
10 50 (0) 15 (0) 4,09 98,01
11 50 (0) 15 (0) 4,24 97,25

O melhor resultado obtido, para a combinação entre eficiência de inativação do


contaminante e manutenção da viabilidade da levedura, foi de 5,3 Log UFC/mL (N 0
~108 UFC/mL) e 98,4%, no ensaio 7 (tabela 5). Por outro lado, os piores resultados
para inativação do contaminante foram: 0,2 e 1,7 UFC/mL, em 30 min de tratamento,
para os ensaios 1 e 5, respectivamente. Para Vf/V0Cl, os piores ensaios foram os 4, 6
e 8, sendo a razão da viabilidade52,5, 87,5 e 86,6%, respectivamente. Esses baixos
valores de viabilidade são evidências de que a combinação de altas concentrações e
temperatura são nocivas para a levedura cervejeira. Os pontos centrais (9-11)
apresentaram pequena variação, indicando boa reprodutibilidade dos dados
experimentais.

A tabela 6 apresenta os resultados do teste de significância para os coeficientes


de regressão do modelo polinomial da lavagem com dióxido de cloro. Tendo em vista
a grande variabilidade inerente aos bioprocessos que envolvem micro-organismos,
foram considerados os parâmetros com p-valores menores que 10% (p < 0,1)
(RODRIGUES, IEMMA, 2014). Quando observado os valores obtidos para γCl, os
resultados indicam que somente o coeficiente de temperatura linear não foi
significativo (p > 0,1), sendo o p-valor, aproximadamente 10 vezes maior do que o
limiar estabelecido. O coeficiente de regressão para a interação entre mg/L e
temperatura, apesar de ter um pequeno efeito, foi significativo (p<0,1) para a redução
101

do valor de γCl. Sugerindo que a interação dessas variáveis afeta de forma negativa o
valor de γCl. Para a Vf/V0Cl todos os coeficientes se mostraram significativos (p < 0,1),
sendo os coeficientes lineares de temperatura e mg/L, os que apresentaram o maior
impacto no aumento da variável. Sendo os modelos obtidos através dos valores reais,
todos os coeficientes foram mantidos, pois, segundo Rodrigues e Iemma, ao seu
utilizar os valores reais para a geração do modelo polinomial o mesmo não deve ser
reparametrizado (RODRIGUES, IEMMA, 2014). As equações 3 e 4 demonstram os
modelos matemáticos polinomiais descrevendo os efeitos de mg/L e temperatura nos
valores de γCl e Vf/V0Cl para a lavagem com dióxido de cloro:

mg 𝑚𝑔2 𝑚𝑔
γ𝐶𝑙 = −2,35 + 0,16 ∗ − 0,0004 ∗ + 0,002 ∗ 𝑇 + 0,01 ∗ 𝑇 2 − 0,005 ∗𝑇
L 𝐿 𝐿

(3)

𝑉𝑓 mg 𝑚𝑔2 𝑚𝑔
= 56,87 + 0,99 ∗ − 0,005 ∗ + 4,17 ∗ 𝑇 − 0,08 ∗ 𝑇 2 − 0,053 ∗ ∗𝑇
𝑉0 𝐶𝑙 L 𝐿 𝐿

(4)

Para a variável dependente γCl os resultados apresentaram excelente


correlação e o coeficiente de determinação foi de 0,90 e o Fcalc foi de 9,83 (Ftabelado =
3,45). Para a variável Vf/V0Cl o coeficiente de determinação foi de 0,83 e o Fcalc foi de
5,05 (Ftabelado = 3,4), sendo esses valores satisfatórios, tendo em vista que o processo
envolve variáveis biológicas (tabelas 7 e 8). Para ambas variáveis dependentes o Fcalc
foi maior que o Ftabelado, o que tornou possível a geração de superfícies de resposta e
a obtenção de modelos matemáticos. Esses modelos são considerados preditivos e
estatisticamente significativos a um intervalo de confiança de 90% (RODRIGUES,
IEMMA, 2014).
102

Tabela 6. Coeficientes de regressão dos modelos polinomiais para a lavagem com


dióxido de cloro para redução decimal e razão da viabilidade.
Erro
Parâmetros Coeficientes de regressão GL p-valor
padrão
γCl (Log UFC/mL)
média -2,3546 - 0,649 0,068
mg/L 0,1693 1 0,014 0,007
mgL2 -0,0004 1 0,000 0,085
T°C 0,0021 1 0,061 0,976
T°C2 0,0128 1 0,002 0,019
mg/L x T°C -0,0051 1 0,001 0,011
Erro
Parâmetros Coeficientes de regressão GL p-valor
padrão
Vf/V0Cl (%)
média 56,875 - 1,499 0,001
mg/L 0,993 1 0,033 0,001
mgL2 -0,005 1 0,000 0,003
T°C 4,179 1 0,142 0,001
T°C2 -0,086 1 0,004 0,002
mg/L x T°C -0,053 1 0,001 0,001
GL – Graus de liberdade

Tabela 7. ANOVA para o modelo de redução decimal (Vf/V0Cl) da lavagem com dióxido de
cloro
Fonte de Soma dos Graus de
Quadrado médio Fcalc p-valor
variação quadrados liberdade
Regressão 33,49 5 6,70 9,83 <0,00001
Resíduos 3,41 5 0,68
Total 36,90 10
R2 = 0,90 / Ftab = 3,45

Tabela 8. ANOVA para o modelo da razão da viabilidade (Vf/V0Cl) da lavagem com dióxido
de cloro
Fonte de Soma dos Graus de Quadrado
Fcalc P-valor
variação quadrados liberdade médio
Regressão 1618,13 5 323,63 5,05 < 0,00001
Resíduos 320,30 5 64,06
Total 1938,43 10
2
R = 0,83 / Ftab = 3,45

As figuras 3 e 4 apresentam as superfícies de resposta referentes aos modelos


polinomiais de segunda ordem para γCl e razão da viabilidade (Vf/VoCl),
103

respectivamente. Para se considerar o processo de lavagem com dióxido de cloro


otimizado, deve-se encontrar condições em que a levedura apresente uma
manutenção da sua viabilidade (>90%) e a redução do contaminante seja a mais alta
possível. Para se identificar as condições ideias, as figuras devem ser analisadas
simultaneamente. Portanto, ao se analisar as figuras, observa-se que as condições
mais eficientes para a lavagem se encontram nas faixas de 50 a 80 mg/L e entre 5 a
15°C. De forma oposta, combinações de temperaturas mais próximas do ponto
máximo estudado, aliado a altas concentrações do sanitizante reduzem de forma
expressiva a viabilidade do fermento cervejeiro.

Fig. 3 Superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para redução decimal (γ Cl Log UFC/mL) em
função de mg/L e temperatura (°C).

Fig 4. Superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para manutenção da viabilidade da levedura
(Vf/V0Cl) em função da mg/L e temperatura (°C).
104

3.3 Validação dos modelos preditivos

Os modelos preditivos foram verificados através da realização de 4


experimentos com combinações aleatórias de pH/temperatura e mg/L/temperatura
dentro da faixa estudada nos DCCR’s (tabela 9 e 10). Todos os experimentos
permitiram observar que os modelos são válidos. O fator Bias, para as lavagens,
indicou predições com um bom nível de confiança, pois os valores se mantiveram
próximos a 1,0 (γLA: 0,93 / Vf/V0LA:0,99 – γCl: 1,0 / Vf/V0Cl: 0,99); e os fatores de exatidão
(γLA: 1,12 / %Vf/V0LA: 1,01 – γCl: 1,08 / %Vf/V0Cl: 1,03) mostraram um desvio de no
máximo 12% para uma das variáveis resposta estudada.

Tabela 9. Testes de validação dos modelos preditivos para a lavagem ácida.

γLA Vf/V0LA
Ensaios pH T°C
Preditoa Observadob Preditoa Observadob
1 1,5 2 5,53 6,36 93,49 91,22
2 2,2 8 4,19 3,76 92,77 92,63
3 1 4 7,22 8 94,25 97,39
4 1 2 6,38 7,23 90,27 91,33
a - valores preditos pelo modelo / b - valores experimentais

Ao se observar a tabela 9, relacionada à lavagem ácida, podemos inferir que


os experimentos 1, 3 e 4 indicam que a predição do modelo é considerada “fail-safe”
e o experimento 2 sugere um pequeno desvio de predição. Na tabela 10, referente a
lavagem com dióxido de cloro, os experimentos 2 e 3 demonstram que o modelo para
redução decimal é considerado “fail-safe”. Porém os experimentos 1 e 4 apresentaram
pequenos desvios de predição. Em relação a predição da viabilidade, para os 4
experimentos houve uma pequena tendência do modelo a um caráter “fail-dangerous”.

Tabela 10. Testes de validação dos modelos preditivos para a lavagem com dióxido
de cloro.

Concentração γCl Vf/V0Cl


Ensaios T°C
(mg/L) Preditoa Observadob Preditoa Observadob
1 60 10 5,58 5,21 100 98,47
2 30 20 4,25 4,51 99,45 98,16
3 60 5 5 5,5 101,79 99,55
4 30 5 2,65 2,39 93 99,93
a - valores preditos pelo modelo / b - valores experimentais
105

4.DISCUSSÃO

4.1 Otimização da lavagem ácida

A lavagem ácida da levedura de inoculação é um processo centenário


empregado pelos cervejeiros como um método de eliminação de bactérias
contaminantes sem afetar, consideravelmente, as características fisiológicas da
levedura (CUNNINGHAM e STEWART, 2000). Apesar de pesquisas, como as de
Simpson & Hammond, que apresentaram condições validadas para a lavagem ácida,
o processo de lavagem ácida é extremamente variado nas industrias cervejeiras
(CUNNINGHAM, STEWART, 2000, SIMPSON, HAMMOND, 1989). Simpson &
Hammond se basearam, em seus trabalhos sobre a lavagem ácida, nas seguintes
condições de lavagem: pH 2.1 e a temperatura de 4-5°C (SIMPSON, CALEDONIAN,
LIMITED, 1987, SIMPSON, HAMMOND, 1989). Desde então, nenhum dos poucos
novos trabalhos dentro do tema lavagem ácida, buscou otimizar esse processo
explorando as combinações das variáveis pH e temperatura.

Nesse estudo, a otimização do processo da lavagem ácida se deu através da


averiguação do impacto de diferentes combinações das variáveis independentes pH
e temperatura (°C) nas variáveis dependentes redução decimal do contaminante (γLA)
e razão daviabilidade da levedura cervejeira (Vf/V0LA). Para tanto, a abordagem do
delineamento central composto rotacional (DCCR) foi utilizada. Com isso, pode-se
observar que combinações de valores de pH baixos e altas temperaturas são
eficientes para a redução do contaminante. Por exemplo, os valores deγLAalcançados,
como 6,9, 6,6 e 7,0 Log UFC/mL, nos ensaios 1, 3 e 5, respectivamente (tabela 1).
Esses resultados estão de acordo com a teoria dos ácidos fracos, que se define pela
inativação microbiana através da acidificação do citoplasma, por difusão do ácido na
sua forma não dissociada, e interrupção das funções metabólicas (JANSSEN et al.,
2006). Sendo o pKa do ácido fosfórico 2,1, uma solução que apresente um pH próximo
desse valor será constituída por um equilíbrio entre formas dissociadas e não
dissociadas. Por outro lado, quando o pH da solução se encontra abaixo de 2,1, ocorre
um desiquilíbrio que aumenta a concentração das formas não dissociadas. Com isso,
ocorre um maior fluxo da forma não dissociada para o interior da célula bacteriana
(LAMBERT, STRATFORD, 1999, STRATFORD et al., 2013). A eficiência da
inativação bacteriana, nas condições de pH extremamente baixos pode, também,
estar relacionado a presença dos iso-alfa-ácidos. Os iso-alfa-ácidos são ácidos fracos
106

componentes do lúpulo, sendo reconhecidos como os principais agentes


antimicrobianos naturalmente presentes na cerveja (SAKAMOTO, KONINGS, 2003).
Portanto, a redução do pH no tratamento pode ter favorecido um maior fluxo desses
ácidos fracos para o interior do citoplasma bacteriano, aumentando a eficiência da
inativação.

Apesar da relação de maior eficiência de γLA a menores valores de pH, quando


observamos o impacto na variável dependente Vf/V0LA, a temperatura se torna um
fator de extrema relevância. Esse impacto pode ser observado, principalmente, nas
diferenças da viabilidade final obtida entre os ensaios 1 e 3 (tabela 1). No ensaio 1, a
combinação de um baixo valor de pH (1,3) e uma baixa temperatura (2,1°C)
proporcionou uma condição de tratamento eficiente, onde a eficiência de redução do
contaminante foi uma das mais altas do presente estudo (6,9 Log UFC/mL), e a
porcentagem da relação entre a viabilidade final e inicial se manteve alta (98,7). Por
outro lado, no ensaio 3, uma variação de 3,6 vezes a temperatura gerou uma
viabilidade 4,4 vezes menor, mas como uma redução decimal semelhante.

4.2 Otimização da lavagem com dióxido de cloro

Apesar do extenso uso do dióxido de cloro como sanitizante para a indústria de


água para consumo (WHO, 2005), o reconhecimento desse agente sanificante como
potencial para a lavagem de frutas e vegetais (GÓMEZ-LÓPEZ, 2012) e a aplicação
do mesmo para lavagem de superfícies de processos industriais (LEE et al., 2004), o
mesmo foi pouco explorado para a aplicação de lavagem da levedura de reinoculação
em processos industriais. Meneghin e colaboradores (2008) buscaram estudar a
resposta de bactérias contaminantes comuns ao processo e, também, do inóculo de
levedura ao tratamento com dióxido de cloro. A faixa de concentração do sanitizante
estudada foi de 1 a 200 mg/L através da técnica de concentração mínima inibitória
(CMI). Dentre as bactérias estudadas, Bacillus subtilis apresentou a menor CMI,
sendo inibida a 10 mg/L de ClO2 e Lactobacillus plantanarum a maior, com um CMI
de 125 mg/L. A levedura cervejeira foi afetada em concentrações superiores a 50
mg/L, porém a sensibilidade a diferentes concentrações se mostrou dependente da
cepa de levedura estudada (MENEGHIN et al., 2008). Desde então, nenhum, dos
poucos novos trabalhos dentro do tema lavagem do inóculo de levedura buscou
otimizar esse processo explorando as combinações das variáveis concentração de
ClO2(l) (mg/L) e temperatura.
107

Nesse estudo, a otimização do processo da lavagem com dióxido de cloro se


deu através da averiguação do impacto de diferentes combinações das variáveis
independentes mg/L e temperatura (°C), nas variáveis dependentes redução decimal
do contaminante (γCl) e viabilidade da levedura cervejeira (Vf/V0Cl). Para isso a
abordagem do delineamento central composto rotacional (DCCR) foi utilizada. Com
isso, pode-se observar que dentre as faixas estudadas, altas concentrações aliadas a
altas temperaturas são mais eficientes em reduzir a população do contaminante. Por
exemplo, os valores de γCl atingidos, como 6,4, 6,3 e 6,2 Log UFC/mL, nos ensaios 8,
6 e 4, respectivamente (tabela 2). Os ensaios 1 e 3 demonstram claramente que a
temperatura do tratamento tem um impacto direto na eficiência do sanitizante em
relação a redução do contaminante (tabela 2). No ensaio 1, a baixa temperatura,
reduziu a eficiência do sanitizante para quase zero. Por outro lado, no ensaio 3, com
a mesma concentração de sanitizante a uma temperatura 2,7 vezes maior, a redução
foi de 5,1 Log UFC/mL. Estudos já relacionaram a queda de eficiência de inativação
de contaminantes em água, ao se utilizar dióxido de cloro a baixas temperaturas.
Esses estudos relatam que a eficiência do sanitizante foi diminuída em 40% quando
a redução da temperatura do tratamento se deu de 20 para 10°C (LECHEVALLIER,
NORTON, ATHERHOLT, 1997, USEPA, 1999, 2006). Comportamento similar foi
obtido em estudos realizados em cistos de Giardia, no qual a eficiência de inativação
com dióxido de cloro cai pela metade com a redução de cada 10°C (FINCH,
BELOSEVIC, 2002).

Assim como observado na otimização da lavagem ácida, o impacto do


tratamento na variável dependente Vf/V0Cl está diretamente ligada a temperatura.
Concentrações altas do sanitizante em paralelo com temperaturas mais altas se
mostraram negativas na manutenção da viabilidade da levedura. Esse resultado pode
ser observando, principalmente, nas diferenças da viabilidade final obtida entre os
ensaios 2 e 4 (tabela 2). No ensaio 2, a combinação de uma alta concentração (78
mg/L) e uma baixa temperatura (8°C) proporcionou uma condição de tratamento
eficiente. Nesse caso a redução do contaminante foi de 5,3 Log UFC/mL e a
porcentagem da relação entre a viabilidade final e inicial foi de 95,5. Por outro lado,
no ensaio 4, uma variação de +14°C gerou uma viabilidade 1,8 vezes menor.
108

5.CONCLUSÃO

Através dos dados do presente estudo é possível afirmar que a utilização do


DCCR como ferramenta para se estudar faixas de tratamentos químicos para a
redução de micro-organismos contaminantes do processo cervejeiro, assim como
entender o impacto do mesmo na viabilidade de leveduras, se provou uma ferramenta
eficaz. Esse foi o primeiro estudo com foco em buscar a otimização de processos de
sanitização das leveduras de inoculação da indústria cervejeira. Esse estudo
proporcionou o entendimento de como o pH e a concentração do sanitizante aliado à
variação da temperatura impactam na eficiência de redução do contaminante e na
manutenção da viabilidade da levedura cervejeira. Além de que, essa metodologia
possibilitou a produção de modelos preditivos validados, que podem ser utilizados
para se definir protocolos de lavagem dentro do ambiente industrial. Tendo em vista,
a busca constante por processos mais eficientes e redução de custos, os binômios
que poderiam ser estudados em uma escala industrial seriam: lavagem ácida, pH 2 /
9 °C e para lavagem com dióxido de cloro, 22 mg/L / 22°C. No caso da lavagem ácida,
no qual tem seu processo padronizado a pH 2 / 4°C, a temperatura convencional de
4 °C seria acrescida de 5 °C, com isso reduzindo os custos de resfriamento do
processo. Na lavagem com dióxido de cloro o processo poderia ser realizado em uma
temperatura ainda mais alta, ou seja, com um custo muito menor do atual para manter
o processo de lavagem a 4 °C.

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Discussão Geral

A reinoculação da levedura em novas bateladas de produção cervejeira é


prática rotineira em pequenas, médias e grandes indústrias de cerveja. Uma das
características de grande importância econômica, na prática da reutilização da
levedura, está relacionada aos elevados custos de implementação de plantas de
propagação de leveduras que consomem espaço, energia e efetivo somente para a
multiplicação dessas células. Apesar de a reinoculação ser uma prática comum e
empregada entre 8-15 fermentações, a reutilização, em teoria pode acontecer por um
número ilimitado de vezes. O que define o número preciso de vezes que a cultura
pode ser reutilizada é dependente da estirpe utilizada, a qualidade em que a levedura
colhida se encontra, estabilidade microbiológica, demanda e em algumas instâncias,
as políticas da indústria cervejeira.

Fator primordial, para se reutilizar a levedura em novas bateladas


fermentativas, é a garantia da ausência de micro-organismos deteriorantes do
processo, tais como as bactérias ácido láticas: Lactobacillus brevis e Pediococcus
damnosus. Ambos reconhecidos como os principais deteriorantes dentro do ambiente
de produção e, também, do produto final. Para se garantir a ausência dessas bactérias
na levedura de reinoculação, a prática da lavagem ácida vem sendo empregada a
anos como a principal estratégia de sanitização. Entretanto, desde 1989, quando
Simpson e Hammond estipularam o protocolo para a realização dessa lavagem,
poucos trabalhos foram realizados para se entender mais profundamente a cinética
de inativação esses micro-organismos ou formas de se otimizar esse processo.
Portanto, até então os trabalhos relacionados a esse tema e, as aplicações industriais,
se baseiam nos seguintes parâmetros de lavagem: Utilizar ácido fosfórico de grau
alimentício, manter o pH igual a 2, temperatura menor ou igual a 4°C por não mais
que 2 horas de tratamento.

Ao se utilizar as ferramentas de microbiologia preditiva, para se estudar a


cinética de inativação microbiana, é possível obter parâmetros e equações
matemáticas que auxiliam na predição do comportamento do micro-organismo a
determinado tratamento. E esse conhecimento pode ser fundamental para tomada de
decisões dentro do ambiente industrial. Dentre os possíveis parâmetros que podem
ser obtidos através de modelos preditivos aplicados a inativação microbiana, dois
117

merecem especial menção, o δ (delta – tempo para primeira redução decimal) e o t3D
(tempo para se obter 4 reduções decimais).

Os valores de δ e t3D para L. brevis, L. casei e P. damnosus (ATCC e DSM)


foram dependentes da variação de pH em 0,5. Sendo que a variação de tempo para
a primeira redução decimal, ao se comparar o tratamento a pH 2 de L. brevis e P.
damnosus (DSM), com o tratamento a pH 1,5, foi de aproximadamente de 10 vezes.
Para os mesmos micro-organismos citados e tratamento, a variação de t3D foi de 2,4
vezes menor para o tratamento a pH 1,5 para L. brevis e, aproximadamente, 11 vezes
menor para P. damnosus (DSM). Sendo que para todos os tratamentos realizados a
levedura não apresentou redução logarítmica significativa. O conhecimento sobre as
diferentes respostas dos principais micro-organismos contaminantes do processo aos
tratamentos aplicados, pode auxiliar na definição de uma espécie referência para
futuros testes de otimização desse processo.

A partir dos resultados obtidos no primeiro estudo ficou claro que a bactéria L.
brevis, dentre as bactérias estudadas, é a mais resistente aos tratamentos ácidos
aplicados. Portanto a mesma foi escolhida como micro-organismo de referência para
os estudos de otimização. Tendo em vista a resistência desse e outros micro-
organismos ao tratamento ácido, e o crescente interesse da aplicação do dióxido de
cloro como sanitizante na indústria de alimentos e bebidas, foram formulados 2
delineamentos centrais compostos rotacionais para se avaliar o impacto dessas
lavagens na levedura e bactéria alvo.

Através dos experimentos de otimização foram obtidos 4 modelos matemáticos


considerados preditivos e estatisticamente significativos (R2> 0,80, Fcalculado > Ftabelado
e p < 0,1). Com esses modelos é possível, dentro da faixa das variáveis estudadas,
prever qual será a redução decimal do micro-organismo alvo e qual será a viabilidade
da levedura ao final do processo de lavagem. Através dessa abordagem a indústria
cervejeira, conhecendo o nível de contaminação do seu fermento de reinoculação,
poderia utilizar os modelos para realizar a escolha do tratamento mais eficiente em
reduzir os contaminantes, mantendo a viabilidade da levedura e com o melhor custo
benefício.
118

Conclusão Geral

A partir dessa pesquisa foram obtidas as seguintes conclusões:

 A redução de 0,5 no pH da tradicional lavagem ácida proporcionou resultados


mais eficientes de inativação, sem prejudicar a viabilidade da levedura
cervejeira, quando comparado os valores de δ e t3Dentre os tratamentos,
 Sobre os efeitos da lavagem ácida, existe uma variabilidade inter e intra-
espécies, quanto a resposta de inativação, tanto para pH 2 quanto para pH 1,5,
 O uso de modelos preditivos se mostrou eficiente para a avalização dos
parâmetros de inativação das cepas deteriorantes do processo cervejeiro,
sendo o modelo de Weibull e suas variações, o que melhor se ajustou aos
dados,
 Dentre as cepas contaminantes avaliadas nesse trabalho, o Lactobacillus
brevis se mostrou mais resistente aos tratamentos ácidos empregados, sendo
considerado um potencial micro-organismo alvo para esse tipo de estudo,
 Através da ferramenta de otimização DCCR (delineamento central composto
rotacional) foi possível observar que além do pH, a temperatura também
impacta na eficiência de redução do contaminante e na manutenção da
viabilidade da levedura,
 Através da otimização da lavagem com dióxido de cloro foi possível constarar
que esse método é eficaz em reduzir o contaminante e manter a viabilidade da
levedura a baixas concentrações (22ppm) e temperaturas mais altas (22°C).
 Os modelos gerados pelo DCCR foram considerados preditivos (R2> 0,8 e
Fcalculado> Ftabelado) estatisticamente significativos (p < 1) e foram validados com
fatores bias/exatidão próximos a 1.
 Através da combinação de ambos os estudos é possível aferir que o processo
de lavagem de leveduras de reinoculação pode ser otimizado e trazer soluções
mais eficazes e econômicas para a indústria cervejeira.
119

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