Extracción y cuantificación de proteínas

Arévalo Arcos Leonardo Josué; Camas Regalado José Eduardo; Cruz Rodríguez Julio; Hernández Ovalle Karina; Solís Cruz
Karla Jazmín.

Resumen. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica, representa
cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.

Palabras clave: Proteínas, Extracción, Cuantificación, Caseína.

Introducción. añadieron 28,57 ml de NaOH 5N y luego 0,14 g de

La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina,
riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K),
minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales
en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo
todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos
(lactosa) y lípidos. Los únicos elementos
importantes de los que carece la leche son el hierro
y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar
de manera general en proteínas globulares y fibrosas.
Las proteínas globulares son aquellas que tienden a
agregarse en formas esferoidales y no establecen
interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrógeno (característicos de las proteínas
fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones
coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína,
lacto albúminas y lacto globulinas (todas
globulares). La caseína es una proteína conjugada
de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la
leche por acidificación y forma una masa blanca.
Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas que
están químicamente unidas a una sustancia que
contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría
de los grupos fosfato están unidos por los grupos
hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La
caseína en la leche se encuentra en forma de sal
cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa
cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en
la leche y el 2,7% en composición de la leche
líquida. La caseína está formada por alpha (s1),
alpha (s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína.
Materiales y Métodos.
Reactivo de Biuret. Se preparó del siguiente modo:
se disolvieron 0,54 g de CuSO4.5H2O (sulfato de
cobre II pentahidratado) y 0,95 g de NaEDTA en
100 ml de H2O. Mientras estaba en agitación se
KI como estabilizante y se guardó en un frasco de
vidrio.
Reactivo de Bradford. Se preparó del siguiente
modo: se mezclaron 10 mg de azul de comassie con
10 ml de H3PO4 al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Se añadió agua destilada hasta 100 ml y se filtró a
través de papel filtro con la ayuda de la bomba de
vacío. Se guardó en un frasco color ámbar envuelto
con papel aluminio para evitar contacto con la luz.
Solución estándar de proteína. Utilizamos
albumina para la preparación de la solución,
tomamos 2100 mg de albumina y los disolvimos en
70 ml de agua destilada, para obtener una solución
de 30 mg/ml.
Caseína. La obtención de caseína consistió en 7
pasos: 1) se calentó 150 ml de agua a 38 °C en un
vaso de precipitado y se agregó 50 ml de leche
(Pradel Ligth). Después gota a gota y con agitación
se adiciono ácido acético 1M hasta formar
precipitado, 2) Se dejó sedimentar y se filtró con la
bomba de vacío, 3) se lavó el precipitado con 20 ml
de etanol en el mismo filtro, 4) secamos el
precipitado con pliegues de papel filtro, 5) colocamos
el precipitado en un vaso de precipitado pequeño
previamente pesado, añadimos el precipitado y
volvimos a pesar, después se agregó 5 ml de éter
etílico, 6) se volvió a lavar con etanol y se filtró
nuevamente, 7) se obtuvo caseína.
Muestra de caseína. Para la preparación de la
muestra se disolvieron 0,50 g de caseína en 20 ml de
agua destilada.
Método de Biuret. Para la cuantificación de
proteínas por este método se prepararon 5 tubos para
hacer la curva estándar: blanco) se agregó 1 ml de
agua destilada, 1) se agregó 0,25 ml de solución
estándar de proteína y 0,75 ml de agua destilada, 2)
se agregó 0,50 ml de solución estándar de proteína y
0,50 ml de agua destilada, 3) se agregó 0,75 ml de
solución estándar de proteína y 0,25 ml de agua
destilada, 4) se agregó 1 ml de solución estándar de La absorbancia de la muestra de caseína, respecto a
proteína. Para evaluar la muestra se usó 1 tubo: 6) 1 los métodos usados fue la siguiente (cuadro 3):
ml de muestra.
A todos los tubos se le añadió 1,6 ml de reactivo de Biuret (545nm) Bradford (595nm)
Biuret y se leyó la absorbancia a 545nm en el Abs 1.543 1.77
espectrofotómetro. Cuadro 3. Absorbancia de la caseína
Método de Bradford: Para la cuantificación de
proteínas por este método se prepararon 5 tubos para Para hallar la concentracion de nuestras
hacer la curva estándar: blanco) se agregó 1 ml de
muestras utilizamos las siguientes graficas
agua destilada, 1) se agregó 0,25 ml de solución
estándar de proteína y 0,75 ml de agua destilada, 2) (figura 1 y 2) ya que son con las que podemos
se agregó 0,50 ml de solución estándar de proteína y acercarnos con mas precision al valor
0,50 ml de agua destilada, 3) se agregó 0,75 ml de verdadero.
solución estándar de proteína y 0,25 ml de agua
destilada, 4) se agregó 1 ml de solución estándar de
proteína. Para evaluar la muestra se usó 1 tubo: 6) 1
ml de muestra.
A todos los tubos se le añadió 1,6 ml de reactivo de
Bradford y se leyó la absorbancia a 595nm en el
espectrofotómetro.

Resultados y discusión.
Se obtuvieron 1,24 g de caseína como resultado de
la extracción.
Utilizamos el espectrofotómetro para la elaboración Figura 1.- Curva patrón de proteínas con reactivo de
de la curva de cuantificación de proteínas mediante Biuret, albumina a 30 mg/ml.
el método de Biuret (cuadro 1) y Bradford (cuadro
2) calculamos la absorbancia y se obtuvieron los
siguientes datos:

Tubo SEP1 (ml) A545 nm

blanco 0 0
1 0,25 0.398
2 0,50 0.488
3 0,75 0.622
4 1 1.29
Cuadro 1. Resultados de
absorbancia reactivo de Biuret Figura 2.- Curva patrón de proteínas con reactivo de
Bradford, albumina a 30 mg/ml.
Tubo SEP (ml) A595 nm
blanco 0 0 Al elaborar la curva de calibración obtuvimos dos
1 0,25 1.235 ecuaciones lineales, una para Biuret (1) y otra para
2 0,50 1.568 Bradford (2).
3 0,75 1.815
4 1 1.985
Cuadro 2. Resultados de
absorbancia reactivo de Bradford

1
Solución Estándar de Proteínas
De las cuales despejamos a la variable “x” que
representa la concentración de proteína y obtuvimos
que:
una curva patrón originada a partir de una proteína
conocida.
Tenemos que de caseína se extrajo un total de 1,24
gr de 50 ml de leche de vaca marca Pradel Light,
respecto a la concentración normal teórica que es de
2.73 gr de 100 ml de leche de vaca3, podemos decir
la leche Pradel contiene una cantidad bastante
aproximada de caseína que debe tener la leche vaca.

Bibliografía.
En donde “y” representa la absorbancia de la  Miller D. D. 2001. Química de los alimentos, manual
muestra, del modo que al sustituir a la ecuación nos de laboratorio. Limusa Wiley, México.
queda que las concentraciones obtenidas son las
siguientes (cuadro 4):

Caseína con Caseína con

Biuret Bradford
Concentración 44.58 mg/ml 22.61 mg/ml
Cuadro 4. Concentración de la caseína

Para la cuantificación de proteínas mediante el

método de Biuret y Bradford se hallaron diferentes
resultados, lo anterior puede ser explicado
considerando que el método de Biuret es de baja
sensibilidad, por lo que son útiles para muestras
altamente concentradas mientras que el de Bradford
es de alta sensibilidad.
Otro de los factores a discutir es la utilización de
albumina en lugar de BSA (Albumina Serica
Bovina) que es la indicada para este tipo de pruebas
por ser más estable y aumentar la señal en los
ensayos.
En cuanto a los resultados de concentración
expresados podemos notar que la diferencia es
significativa y esto se debe a que el reactivo de
Bradford es algo sensible con la luz, por lo cual
deducimos que ese fue el factor que influyó en la
variación de nuestros datos.
Conclusiones.
La cuantificación de proteínas se realizó aplicando
los métodos de Biuret (poco sensible) y Bradford
(más sensible) 2 , los cuales de manera eficiente y
sencilla permiten determinar la concentración de
proteína en una o varias muestras problema, que
resultan al interpolar los valores de absorbancia en

2
La inmunología en el diagnóstico clínico; Susana
3
Fiorentino; Santafé de Bogota: Centro Editorial Javeriano, http://www.unicef.cl/lactancia/docs/mod01/Mod%201be
CEJA; 1994; Pagina 57; 200 p.; Colección textos y neficios%20manual.pdf
manuales.