Interacciones proteína-nanopartícula

El papel clave de las interacciones proteína-nanopartícula en la nanomedicina y la nanotoxicidad ha

comenzado a surgir recientemente con el desarrollo de la idea de la nanopartícula-proteína 'corona'.
Esta capa dinámica de proteínas (y otras biomoléculas) se adsorbe a las superficies de las
nanopartículas inmediatamente después del contacto con los sistemas vivos. Mientras que en el
campo de los biomateriales se reconoce el papel de las moléculas adsorbidas en las respuestas
celulares, hay varias cuestiones nuevas en juego en lo que respecta a las nanopartículas. Mostramos
aquí que la adsorción de proteínas altamente selectiva, sumada al hecho de que las partículas
pueden alcanzar ubicaciones subcelulares, da como resultado nuevos impactos potenciales
significativos para las nanopartículas sobre las interacciones de proteínas y el comportamiento
celular.

Iseult Lynch * y Kenneth A. Dawson

UCD BioNano Institute, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irlanda
* Correo electrónico: Iseult@fiachra.ucd.ie

Este artículo no pretende proporcionar una revisión exhaustiva de todos los artículos publicados
sobre las interacciones proteína-nanopartícula, sino que busca proporcionar una instantánea de la
gama de actividades y resaltar algunas de las direcciones de investigación clave y los paradigmas
que están surgiendo y evolucionando en esta arena emocionante. Un ejemplo importante incluye
el reciente descubrimiento de que las nanopartículas pueden afectar los procesos de fibrilación de
proteínas.

Dentro de la comunidad de dispositivos médicos, ahora se acepta que las superficies materiales se
modifican por la adsorción de biomoléculas como las proteínas en un entorno biológico1-10, y existe
cierto consenso de que las respuestas celulares a los materiales en un medio biológico reflejan la
capa de biomoléculas adsorbidas, en lugar del material en sí mismo 1,3,6. Un estudio temprano en
el campo de las interacciones de proteínas con superficies planas llamó la atención sobre el hecho
de que la distorsión de la proteína puede ocurrir después de la adsorción11. Sin embargo, la
importancia de la capa de proteína adsorbida en las interacciones mediadoras con los sistemas vivos
ha sido más lenta en emerger en el caso de las interacciones nanopartícula-proteína. Mientras que
los estudios de adsorción de proteínas a nanopartículas comienzan a aparecer 12-14, la importancia
de la estructura detallada de la interfaz proteína-solución adsorbida (la superficie externa de la capa
de proteína adsorbida teniendo en cuenta cualquier cambio en la estructura de la proteína) aún no
ha sido ampliamente apreciado en la literatura de nanotoxicología 1,15,16, a pesar del hecho de
que esta es la superficie primaria en contacto con las células.

Por supuesto, cuando uno cambia de una superficie plana a partículas, y cuando las partículas se
vuelven más pequeñas (llegando al tamaño de las proteínas mismas), la composición y organización
de la proteína asociada cambiará drásticamente, partiendo del simple caso límite de superficies
planas. Podemos esperar que esto lleve a consecuencias biológicas bastante diferentes.

De hecho, existe el potencial de que las superficies altamente curvadas (nanopartículas muy
pequeñas) puedan suprimir la adsorción de proteínas hasta el punto en que ya no ocurre, un efecto
que probablemente sea selectivo para proteínas más grandes, ofreciendo una ruta para el control
diferencial de la adsorción de la proteína 17. Además, las superficies planas solo pueden afectar el
proceso biológico a través de los receptores de la superficie celular, como las integrinas, mientras
que las nanopartículas pueden entrar en las células y, por lo tanto, acceder a una amplia gama de
procesos biológicos adicionales.

Curiosamente, en lugar de complicar la historia, estudios recientes sugieren que las superficies de
nanomateriales, que tienen una superficie mucho mayor que las planas, son más susceptibles a los
estudios para determinar la identidad y los tiempos de residencia de las proteínas adsorbidas 2,18.
De hecho, se puede realizar la determinación directa de los efectos de curvatura sobre la adsorción
de proteínas, ya que con algunos tipos de material, el tamaño de la partícula puede aumentarse
hasta que desaparezcan los efectos de curvatura, dejando una superficie efectivamente plana. Esto
ofrece varias posibilidades en términos de detección de alto rendimiento o en masa de las
interacciones nanopartícula-proteína, un concepto que puede tener aplicabilidad como una nueva
clasificación de nanopartículas basadas en sus moléculas de proteínas asociadas, o 'corona de
proteínas'. Recientemente, hemos introducido el concepto de "corona de nanopartículas-proteínas"
como la colección en evolución de proteínas que se asocian con nanopartículas en fluidos biológicos,
que es, de hecho, la "entidad biológicamente relevante" que interactúa con las células 19.

Aquí revisamos algunos de los estudios recientes sobre las interacciones entre proteínas de
nanopartículas a la luz del hecho de que los efectos biológicos de las nanopartículas se ven afectados
por la naturaleza de la capa de proteína adsorbida o la corona de proteína (biomolécula). Dado que
los usos potenciales de las nanopartículas en aplicaciones biológicas como la nanomedicina son bien
conocidos, y la importancia creciente del campo emergente de la nanotoxicología, que apunta a
abordar la seguridad de las nanopartículas diseñadas, la relevancia de las interacciones proteína-
nanopartícula no puede exagerarse. Si bien la mayoría de los conocimientos sobre las interacciones
de las proteínas con las partículas provienen de estudios en solución e in vitro, es claro que las
direcciones futuras requerirán estudios en condiciones competitivas vinculantes, como las que
ocurren in vivo.

La corona de nanopartículas-proteína
Es una regla (casi) universal de los materiales en biología que un material siempre está cubierto por
proteínas inmediatamente al contacto con un entorno fisiológico, y creemos que este fenómeno
también será clave para comprender gran parte del mundo de la bionanociencia 19. Recientemente
hemos argumentado que la unidad efectiva de interés en la interacción de los nanomateriales no es
la nanopartícula per se, sino la partícula y su "corona" de proteínas más o menos fuertemente
asociadas del suero u otros fluidos corporales 1,2. Sin embargo, es importante entender que no es
solo la composición y organización de esta capa de proteína, sino también el tiempo de intercambio
de las proteínas en las nanopartículas que las células vivas "leen".

Concebimos que las proteínas asociadas con una partícula poseen un amplio rango de afinidades
para la superficie de la partícula, dando como resultado un rango de diferentes tiempos de
residencia para las proteínas en una superficie de nanopartículas. En esencia, esperamos una gran
variedad de constantes de equilibrio (una para cada proteína) que represente los mecanismos de
unión bastante diferentes (y competitivos) presentes. Esto significa que vemos las proteínas
asociadas con una partícula como una "corona", en lugar de una capa sólida fija (Fig. 1). La
composición de la corona proteínica en cualquier momento dado estará determinada por las
concentraciones de las más de 3700 proteínas en el plasma 20, y las velocidades cinéticas de
activación y desactivación (o constantes de unión en equilibrio) de cada proteína para la
nanopartícula particular. Esta corona puede no alcanzar el equilibrio inmediatamente cuando se
expone a un fluido biológico. Las proteínas con altas concentraciones y altas constantes de velocidad
de asociación ocuparán inicialmente la superficie de las nanopartículas, pero también pueden
disociarse rápidamente para ser reemplazadas por proteínas de menor concentración, intercambio
más lento y mayor afinidad 18.
Fig. 1 Representación esquemática de la corona de proteína en una nanopartícula que ilustra los
procesos de intercambio y las constantes de equilibrio. Las tasas de cambio son una función
compleja de la afinidad por la superficie, los efectos de curvatura de la superficie y los cambios en
el medio circundante, y se necesita mucho trabajo para evaluar las constantes de equilibrio bajo
diferentes condiciones.

Por lo tanto, la corona proteica es la identidad biológica de una nanopartícula, ya que es lo que la
célula "ve" e interactúa. Los procesos de intercambio también pueden ser importantes cuando las
partículas se redistribuyen de un compartimento u órgano a otro, como cuando se absorben en las
células del torrente sanguíneo, o tras el transporte desde el citosol al núcleo.

Los estudios de adsorción de proteínas albúmina de suero bovino (BSA), mioglobina (Mb) y
citocromo c (CytC) sobre monocapas autoensambladas de ácido mercaptoundecanoico (MUA) en
nanopartículas de Au utilizando la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) muestran que las tres
proteínas forman capas de adsorción que consisten en una fracción adsorbida irreversiblemente y
una fracción reversiblemente adsorbida 21. Esto se corresponde muy bien con la noción de una
corona de nanopartículas-proteínas, que se propone tener una corona dura compuesta de aquellas
proteínas que tienen una fuerte adsorción a las nanopartículas y un tiempo de residencia largo y
una corona más suave compuesta por aquellas proteínas con residencia más corta tiempos y / o
afinidades más bajas.

Una revisión de la literatura sobre la unión de nanopartículas y proteínas muestra que la gran
mayoría de los tipos de nanopartículas estudiados hasta ahora se unen a las apolipoproteínas 18. A
primera vista, este es un resultado sorprendente, y bastante distinto del de una superficie plana. Sin
embargo, el hecho de que se sepa que las apolipoproteínas están involucradas en complejos de
lipoproteínas, que a su vez tienen tamaños a nanoescala (Fig. 2) que van desde 100 nm (quilomicrón)
a ~ 10 nm (lipoproteínas de alta densidad), puede significar que hay interacciones dependientes del
tamaño que conducen la unión de apolipoproteínas a nanopartículas. Esto es interesante desde el
punto de vista de la interacción de las nanopartículas con las células, ya que los complejos de
lipoproteínas están implicados en los procesos celulares generales del metabolismo del colesterol
22,23. Por lo tanto, existen múltiples receptores para los complejos de apolipoproteínas en las
superficies celulares que las nanopartículas con apolipoproteínas adsorbidas en la superficie pueden
potencialmente explotar para ingresar a las células 24.

Si consideramos nuevamente los problemas del transporte de nanopartículas y el destino en

animales y humanos, también es relevante que la apolipoproteína E se haya asociado a algunas
nanopartículas 18. Esto tiene consecuencias potencialmente importantes para la neurotoxicidad y
el desarrollo de neuroterapias, ya que se sabe que la apolipoproteína E está implicada en el tráfico
hacia el cerebro 25,26. Por lo tanto, hipotetizamos que es la corona de nanopartículas-proteínas
(además del tamaño y la forma) la que determina la ubicación subcelular final de una nanopartícula
específica al interactuar con una célula y, por lo tanto, el rango de procesos de enfermedad a los
que puede acceder la nanopartícula 1. Siguiendo con esto, proponemos que, en el futuro, las
nanopartículas podrían clasificarse en términos de su corona biomolécula, que media su interacción
con la maquinaria celular. Esto representaría un paradigma verdaderamente nuevo en el campo de
la toxicología a nanoescala, y en el diseño de nanovehículos para la nanomedicina.

Los primeros informes de la influencia biológica directa de proteínas adsorbidas a nanopartículas

están emergiendo ahora. Los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT) y la sílice amorfa
recubierta con albúmina de 10 nm han demostrado inducir respuestas antiinflamatorias en
macrófagos, medida como inducción inhibida de ciclooxigenasa-2 (Cox-2) por lipopolisacáridos en
condiciones sin suero 27. El bloqueo de la adsorción de albúmina mediante el prerrecubrimiento de
las nanopartículas con un tensioactivo no iónico (Pluronic F127) también inhibe las propiedades
antiinflamatorias de las nanopartículas. Estas observaciones sugieren un papel importante para las
proteínas adsorbidas en la modulación de la captación y la toxicidad de SWNTs y nanosized de sílice
amorfa 27. Sin embargo, como estos estudios se realizaron en condiciones libres de suero, no está
claro si la albúmina permanecerá unida a las nanopartículas en condiciones de unión competitiva,
como ocurre en el plasma o en un medio celular.

Fig. 2 (a) Estructura cristalina de la proteína apolipoproteína A-1, y esquema de la apolipoproteína

A-1 en un complejo de lipoproteínas compuesto por fosfolípidos. (Cortesía del Grupo Computacional
Teórico y Biofísico, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.) (B) Comparación de tamaño de
una nanopartícula de 70 nm con complejos de lipoproteínas - quilomicrones, lipoproteínas de muy
baja, baja y alta densidad. Estas lipoproteínas pasan rutinariamente a las células, y está claro que
las nanopartículas de un tamaño similar recubiertas con apolipoproteína A-1 podrían reconocerse
como lipoproteínas.
Efectos sobre la conformación proteica de la unión a nanopartículas
Las proteínas son cadenas de aminoácidos, donde la secuencia exacta de los aminoácidos determina
la forma, la estructura y la función de la proteína. Las unidades principales de estructura secundaria
de proteínas son α-hélices y β-láminas, y la disposición tridimensional de éstas es la estructura
terciaria (α-hélice, que se muestra en rojo, y β-láminas, azul, las estructuras se ilustran en la Fig. 1).
La conformación nativa de una proteína está estrechamente controlada por la complementariedad
de forma de los residuos hidrofóbicos que permiten el empaquetado cercano de los núcleos 28. Sin
embargo, las proteínas son marginalmente estables porque las interacciones beneficiosas que
gobiernan la estructura nativa se contrarrestan con una gran pérdida de entropía asociada al paso
de un gran conjunto de estados a un conjunto más restringido de conformaciones, así como por las
repulsivas interacciones electrostáticas presentes en los estados nativos 29. Por lo tanto, la
interacción con una superficie puede alterar fácilmente la conformación nativa y, por lo tanto, la
función proteica. Esto tiene implicaciones para el impacto biológico de las nanopartículas.

El efecto de la química de la superficie de los biomateriales en el proceso de adsorción de proteínas

ha sido un tema de gran interés durante muchos años, y se conoce mucho en este campo 30. La
adsorción de proteínas a diversos materiales ha sido ampliamente estudiada y se ha descubierto
que factores como las interacciones electrostáticas, las interacciones hidrofóbicas y las
interacciones químicas específicas entre la proteína y el adsorbente juegan un papel importante. La
adsorción selectiva de proteínas en diversos adsorbentes sintéticos se ha examinado en diferentes
condiciones (como el pH de la solución y la concentración de proteínas) y para muchas proteínas el
mecanismo de adsorción selectiva se ha atribuido a interacciones electrostáticas 12.

Más recientemente, se han estudiado muchas combinaciones diferentes de nanopartículas y

proteínas usando una variedad de técnicas diferentes. Hemos realizado un estudio detallado de la
interacción de la albúmina sérica humana (HSA) con nanopartículas poliméricas de mayor
hidrofobicidad y tamaño utilizando calorimetría de titulación isotérmica (ITC) 13, así como estudios
de la interacción de mezclas complejas de proteínas con las mismas partículas usando técnicas tales
como resonancia de plasmón superficial (SPR), filtración en gel y espectrometría de masas 2,18. En
el caso de las partículas de polímero (descritas en detalle en otra parte 2), la interacción con HSA
ocurre con una liberación de calor (un cambio de entalpía discernible), mientras que otras proteínas
que hemos estudiado (incluyendo fibrinógeno, lisosima, ovoalbúmina y humano carbónico)
anhidrasa II) se unen sin cambio de entalpía. La unión de estas proteínas parece estar impulsada por
la entropía como resultado de la liberación de agua unida de la superficie de la nanopartícula 14.
Por lo tanto, la reducción de la entropía de la proteína es más que compensada por la entropía
incrementada de las moléculas de agua. En el caso de la unión dirigida por entropía, la interacción
no da como resultado un cambio de conformación de la proteína. Esto ha sido confirmado por
espectroscopia de dicroísmo circular (CD) y la unión ha sido confirmada por mediciones de SPR 14.

Si bien hay muchos resultados en la literatura, hemos seleccionado algunos documentos clave para
resaltar aquí donde las nanopartículas son de particular interés comercial, por ejemplo, los puntos
cuánticos (QD) y nanopartículas de Au, que se están desarrollando para una gama de aplicaciones
de formación de imágenes in vivo, o históricamente, por ejemplo, el asbesto, que es el único caso
conocido hasta la fecha de toxicidad inducida por partículas. Hemos elegido documentos
representativos donde se observan efectos a nanoescala muy pronunciados.

La interacción entre la hemoglobina adulta humana (Hb) y los QDs desnudos de CdS se ha
investigado mediante fluorescencia, fluorescencia sincrónica, CD y técnicas espectroscópicas Raman
bajo pH fisiológico 7.43. Los CdS QDs alteran drásticamente la conformación de Hb, apagando la
fluorescencia intrínseca de Hb y disminuyendo el contenido de hélice α de la estructura secundaria
de 72.5% a 60.8%. Los resultados de los espectros de Raman indican que los átomos de azufre de
los residuos de cisteína forman enlaces químicos directos en la superficie de los QDs de CdS 15.

El crisotilo sintético geoinspirado es un estándar de referencia de asbesto, y se ha utilizado para

investigar el intercambio homomolecular de BSA entre el estado adsorbido y disuelto en la interfaz
entre las fibras de asbesto y el medio biológico. La espectroscopía de infrarrojo por transformada
de Fourier (FTIR) y la espectroscopia de CD muestran que, en estado sólido, las modificaciones de
BSA son impulsadas por la interacción de la superficie con el sustrato 16. Una vez que BSA se desorbe
de nuevo a la solución, su estructura se reorganiza, aunque algunas de las modificaciones con
respecto a las especies nativas son irreversibles 16. Se han observado efectos similares con las
nanopartículas de poliestireno: la adsorción y posterior desorción de las partículas de poliestireno
causa cambios irreversibles en la estabilidad y la estructura secundaria de BSA 31. El contenido de
hélice α se reduce, mientras que el giro β (una región de la proteína que implica cuatro residuos
consecutivos donde la cadena polipeptídica se repliega sobre sí misma en casi 180 °) 32 se
incrementa la fracción en las moléculas intercambiadas. El cambio conformacional irreversible
inducido por la superficie puede estar relacionado con la agregación de moléculas de BSA después
de la exposición a una superficie hidrófoba 31.

El efecto de la curvatura (ángulo) entre las caras de cristal de las nanopartículas de Au protegidas
con péptidos (que son especies poliédricas) en la estructura secundaria de los péptidos es un
problema inexplorado, pero potencialmente crítico. Una investigación estructural reciente de un
péptido que contiene 16 aminoácidos en monocapas autoensambladas (SAM) tanto
bidimensionales como tridimensionales con diámetros centrales crecientes y, por lo tanto,
curvatura decreciente entre las caras cristalográficas, muestra que el grado de curvatura superficial
tiene un efecto profundo en la estructura secundaria del péptido. Además, una monocapa
tridimensional (en nanopartículas de Au) no siempre se parece a la monocapa bidimensional en una
superficie de Au 33.

La funcionalización de superficies de nanopartículas con péptidos se usa cada vez más para controlar
la interacción de nanopartículas con proteínas 34,35. La investigación del efecto de las
nanopartículas de Au con ligandos positivos, negativos y neutros en la estructura CytC adjunta revela
que la proteína conserva su estructura con ligandos neutros, pero desnaturaliza en presencia de
especies cargadas 34. Estudios similares de la interacción de nanopartículas de Au funcionalizadas
con L / D-leucina y / o residuos de L / D-fenilalanina con alfa-quimiotripsina (ChT) y CytC muestran
que la quiralidad de los grupos terminales de nanopartículas funcionalizadas afecta sustancialmente
a la estabilidad del complejo resultante, con hasta 20 veces las diferencias entre las partículas de
hidrofobicidad idéntica. Esto demuestra que la información estructural de los ligandos se puede
utilizar para controlar el reconocimiento de proteínas 35.

Métodos para evaluar la unión de proteínas a nanopartículas

Muchos métodos se utilizan comúnmente para estudiar las interacciones nanopartícula-proteína,
varios de los cuales ya se han mencionado en las secciones anteriores, como FTIR, espectroscopia
de CD, ITC, SPR, espectrometría de masas y espectroscopía de fluorescencia 2,13,15,16,18, 31.

Recientemente, informamos el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño para estudiar las
interacciones nanopartícula-proteína, con énfasis específico en la determinación de los tiempos de
residencia de las proteínas en nanopartículas con el fin de identificar aquellas proteínas que pueden
ser relevantes en el calendario biológico 2. Este método se basa en el hecho de que las
nanopartículas son demasiado grandes para entrar en los poros de la matriz de exclusión de tamaño
y pasan a través de la columna en el volumen vacío, mientras que las proteínas son lo
suficientemente pequeñas para entrar en los poros y el tiempo que pasan dentro los poros
dependen de su peso molecular. Por lo tanto, cada proteína eluye con un volumen característico.
Sin embargo, en presencia de nanopartículas, el volumen de elución de proteínas se desplaza hacia
tiempos de elución más tempranos según la duración de la interacción entre la proteína y la
nanopartícula, es decir, la proteína se engancha en la columna de la nanopartícula y, por lo tanto,
las proteínas asociadas a nanopartículas se separan de las proteínas no asociadas (Fig. 3). Usando
esta técnica, hemos podido identificar aquellas proteínas que se unen, así como sus tiempos de
asociación 2.

Las técnicas informadas aquí son una mezcla de las de fácil acceso (fluorescencia y CD) y altamente
especializadas (SPR y espectrometría de masas). Esta distinción es importante en términos de la
detección masiva de interacciones proteína-nanopartícula para caracterizar nanopartículas en
términos de su corona proteica. Para que esto sea factible para la detección / caracterización de las
30 000 nanopartículas que se dice que están en la tubería industrial en todo el mundo, las técnicas
experimentales deben ser robustas, de fácil acceso y de alto rendimiento (cuando sea posible).
Destacamos aquí otro enfoque que potencialmente podría contribuir a la detección a gran escala
de las interacciones nanopartícula-proteína, es decir, el potencial zeta.

La interacción de BSA con carga negativa y lisozima cargada positivamente con un rango de
partículas de óxido metálico (alúmina, sílice, titanio y partículas de zirconia con diámetros de 73-
271 nm) se ha estudiado mediante el potencial zeta 36. Las proteínas adsorbidas cambian los
potenciales zeta y los puntos isoeléctricos (IEP) de las partículas de óxido. La cantidad de proteína
adsorbida en las superficies de partículas de alúmina, sílice y titania (pero no en la zirconia) se
correlaciona con el potencial zeta. Para las partículas de zirconia ligeramente menos hidrófilas, se
observan cantidades significativas de adsorción de proteínas incluso en condiciones electrostáticas
repulsivas, tal vez debido a que el efecto hidrofóbico desempeña un papel más importante para la
zirconia que las interacciones electrostáticas 36. Si bien estos datos por sí solos no proporcionan
mucha información sobre los efectos de la interacción sobre la conformación proteica, puede ser
posible correlacionar el potencial zeta de los complejos nanopartícula-proteína con la naturaleza de
las proteínas principales adsorbidas y, a largo plazo, correlacionarse esto a la absorción de
nanopartículas por las células.

Fig. 3 Estudio de cromatografía de exclusión por tamaño de las interacciones nanopartícula-

proteína. El tiempo de elución de las proteínas se desplaza en función de su afinidad por la superficie
de las nanopartículas, cuanto más tiempo se asocia la proteína con la nanopartícula, antes se eluye
la proteína de la columna 2. Las proteínas que tienen tiempos de residencia suficientemente largos
eluyen en el volumen vacío con las nanopartículas. Está claro que cada fracción recogida de la
columna de exclusión por tamaño contiene muchas proteínas diferentes, que pueden separarse
adicionalmente por electroforesis en gel usando geles de acrilamida desnaturalizantes como se
muestra a la derecha. Las diferentes bandas de gel pueden ser cortadas y las proteínas identificadas
por espectrometría de masas. (Reproducido con permiso de 2. © 2007 National Academy of
Sciences).

Aumento de la estabilidad / actividad proteica al unirse a las nanopartículas

Si bien, en general, la pérdida de la estructura secundaria y los cambios consiguientes en la actividad
de las proteínas tras la unión a las nanopartículas puede considerarse un inconveniente o una fuente
potencial de toxicidad de las nanopartículas, también hay un posible resultado positivo. Los usos
prometedores de las nanopartículas incluyen aumentar la estabilidad de la proteína hacia la
degradación de la enzima y aumentar la actividad de las enzimas a través de la inmovilización en las
superficies. Enzimas como Candida rugosa lipasa (CRL) y Pseudomonas cepacia lipasa (PCL) han sido
adsorbidas en poliestireno (PS) y polimetilmetacrilato (PMMA) nanoestructurados mediante la
simple adición de la solución de lipasa a las nanopartículas poliméricas en condiciones favorables
para las proteínas (pH 7,6) 37. La adsorción conduce a un rendimiento mejorado en términos de
actividad y selectividad con respecto a la mostrada por lipasas adsorbidas en los mismos portadores
no nanoestructurados, así como una enantioselectividad y pH incrementados y estabilidad térmica
37.

La superficie altamente curvada de los fullerenos C60 también ha demostrado mejorar la estabilidad
de la enzima en entornos fuertemente desnaturalizantes en mayor medida que los soportes planos.
La vida media de una enzima modelo, la peroxidasa de soja, adsorbida en fullerenos a 95 ° C es ~ 2,5
veces mayor que la de la enzima adsorbida en copos de grafito y ~ 13 veces más alta que la de la
enzima nativa 38. Se han encontrado observaciones similares con otros soportes a nanoescala que
incluyen sílice y nanopartículas de Au. La capacidad de mejorar la estabilidad de las proteínas
interconectándolas con los nanomateriales puede afectar numerosos campos que van desde el
diseño de diagnósticos, sensores y nanocompuestos hasta la administración de fármacos 38.

Papel potencial de las nanopartículas en la fibrilación de proteínas

Las proteínas amiloidogénicas son un grupo de proteínas que se agregan bajo ciertas condiciones
para formar estructuras altamente insolubles (fibrillas), que se precipitan para formar placas. Estos
agregados están implicados en una serie de afecciones patológicas graves e irreversiblemente
progresivas (enfermedades de la proliferación de la proteína), como la enfermedad de Alzheimer,
la enfermedad de Parkinson y la amiloidosis relacionada con la diálisis. Se conocen al menos 20 de
tales enfermedades.

Recientemente hemos informado que una gama de nanopartículas diferentes, que incluyen
partículas de polímero, óxido de cerio, nanotubos de carbono y QD recubiertos de poli (etilenglicol)
(PEG), aumentan la tasa de fibrilación de la proteína amiloidogénica β-2-microglobulina en
condiciones donde la proteína se encuentra en un estado globular ligeramente fundido a un pH de
2.539. Como las fibrillas formadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) no parecen
crecer fuera de las nanopartículas (Fig. 4), hemos sugerido un mecanismo basado en la
concentración localmente aumentada de la proteína en las proximidades de la superficie de las
nanopartículas. Esto, creemos, aumenta la probabilidad de la formación de un oligómero crítico que,
una vez formado, regrese a la fase de solución. Múltiples capas de proteína unidas a las partículas e
interacción con las partículas no parecen tener mucho efecto sobre la conformación de proteína
determinada por fluorescencia de los residuos de triptófano, con ligeros efectos observados para la
capa de proteína más interna y sin efectos observados para capas posteriores 39. Un informe más
reciente de Bellezza y colaboradores,40 sugiere que la interacción de Mb con nanopartículas de
zirconia injertadas con fosfato induce reordenamientos significativos en la estructura Mb,
particularmente la pérdida de la estructura secundaria (α-hélices). La cantidad de Mb ligado implica
una monocapa de moléculas adsorbidas. Las mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM)
indican que la interacción también afecta la morfología de la proteína unida, induciendo la
nucleación de agregados similares a los prefibrilares a pH 4.7, cuya apariencia y altura (2-4 nm) son
consistentes con los ensambles tipo prefibrilar visto previamente para Mb 40.

Fig. 4 Se ha demostrado que las nanopartículas aumentan la tasa de fibrilación de proteínas

amiloidogénicas usando ensayos basados en la unión de tioflavina-T a fibrillas de proteína39. La
presencia de partículas poliméricas de 70 nm y 200 nm da como resultado un tiempo de fibrilación
reducido para la β-2-microglobulina (B2m), la proteína implicada en la amiloidosis relacionada con
la diálisis. (a) Ensayos de tioflavina-T en ausencia (negro) y presencia de nanopartículas de diferente
tamaño y composición. Como la tioflavina-T solo emite fluorescencia cuando está unida a las
fibrillas, el inicio de la fluorescencia se correlaciona con el inicio de la fibrilación. (b) TEM de las
fibrillas de proteínas en presencia de nanopartículas que muestran que las fibrillas no crecen a partir
de las nanopartículas. Barra de escala: 100 nm. (Reproducido con permiso de 39. © 2007 National
Academy of Sciences).

Es bien sabido que Mb puede nuclear estructuras fibrilares solo bajo condiciones desestabilizadoras,
donde tiene al menos una conformación parcialmente desplegada 41. En este caso, los autores
afirman que los agregados de tipo prefibrilar siempre se observan junto a las nanopartículas de
ZrO2-P, lo que sugiere que las estructuras de tipo prefibrilar se desarrollan a partir de la proteína
unida.

También se ha informado recientemente de otras estructuras a nanoescala para inducir la fibrilación

de proteínas: los dendrímeros (polímeros sintéticos ramificados simétricamente que se pueden
fabricar con un alto grado de definición y, por lo tanto, se presentan como entidades
monodispersas) interactúan y perturban las conformaciones de polipéptidos, con una eficiencia
particular hacia las estructuras amiloides. Se ha demostrado que varios dendrímeros catiónicos son
potencialmente desagregados hacia los agregados de priones y capaces de eliminar las moléculas
de priones en el estado infeccioso (PrPSc) de manera eficaz tanto de células de neuroblastoma
infectadas con PrPSc como de homogenatos de cerebro que contienen PrPSc 42. Sin embargo, los
mismos dendrímeros tienen efectos variables sobre la estabilidad de diferentes proteínas, lo que
sugiere que no actúan como desnaturalizantes genéricos, sino que ejercen sus efectos a través de
interacciones específicas con partes individuales de cada proteína.

Los estudios en animales han demostrado que el fullereno hidratado C60 puede tener una capacidad
antiamiloidogénica resultante de la inhibición de la fibrilación del péptido beta-amiloide 25-35 43.
Una única inyección intracerebroventricular de un fullereno hidratado C60 a una dosis de 7,2 nmol
/ ventrículo mejora significativamente el rendimiento de una tarea cognitiva en ratas de control. Los
estudios TEM han confirmado que el fullereno hidratado C60 inhibe la fibrilación del péptido
amiloide-beta 25-35. Esto sugiere un papel potencial para las nanopartículas en el desarrollo de
terapias contra las enfermedades amiloidogénicas. Actualmente no existe una cura o diagnóstico
confiable hasta la autopsia en muchos casos (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer), por lo que
avances como estos son muy emocionantes.

Uso de nanopartículas para estudiar las interacciones proteína-proteína

Para cumplir sus funciones biológicas, las proteínas deben interactuar con otras moléculas. Por
ejemplo, las enzimas, los receptores y los factores de transcripción deben unir sus sustratos,
ligandos y elementos de ADN diana, respectivamente, para ejecutar su función. Por lo tanto,
pequeños cambios en la conformación de proteínas, como podría ser inducido por la interacción
con la superficie de una nanopartícula modificada genéticamente, pueden tener un impacto
significativo en la función de una proteína y en su interacción con otras proteínas (interacciones
proteína-proteína). Además de identificar las proteínas directamente implicadas en la corona de
una nanopartícula, también es importante comprender el efecto de incorporar una proteína en una
corona de nanopartículas en las interacciones proteína-proteína, con el fin de determinar los
impactos biológicos inducidos por las nanopartículas.

Las nanopartículas y las superficies nanoestructuradas ofrecen una nueva ruta para estudiar las
interacciones de proteínas, tanto proteína-ligando como proteína-proteína. Por ejemplo, hemos
estudiado la unión de HSA a una serie de nanopartículas poliméricas de hidrofobicidad creciente en
presencia y ausencia de ácido oleico 13, que es uno de los ligandos clave a los que la HSA se une
durante su funcionamiento normal 44. Se observan patrones de interacción muy diferentes con y
sin ácido oleico: HSA en complejo con ácido oleico da una señal endotérmica y una estequiometría
inferior en comparación con la señal exotérmica de apo-HSA (en ausencia de ácido oleico), como se
muestra en la Fig. 5. Un estudio reciente que usa nanocristales semiconductores (QD de diámetro
promedio inferior a 2 nm) conjugado directamente con HSA ha demostrado que estos conjugados
pueden usarse como marcadores biológicos fluorescentes. Utilizando medidas de transferencia de
energía de resonancia de fluorescencia (FRET) del aminoácido triptófano (Trp214) al QD, es posible
seguir los cambios locales y globales en la estructura HSA durante los procesos de desplegamiento
y relegamiento térmico 45.
Fig. 5 ITC se ha utilizado para estudiar las interacciones nanopartícula-proteína y nanopartícula-
proteína-ligando13. Los gráficos muestran la unión de HSA en ausencia (a) y presencia (b) de ácido
oleico (uno de los principales ligandos que se une a HSA) a nanopartículas hidrófobas de 70 nm. Las
isotermas de unión también brindan información sobre el número de moléculas unidas y la energía
de la unión. En estos estudios, se tituló 1 mg / ml de HSA en partículas de 10 mg / ml. (Reproducido
con permiso de 13. © 2007 American Chemical Society).

Recientemente, se ha descrito una nanopartícula de doble función que combina la purificación de

proteína marcada con histidina con el etiquetado de fluoróforo específico del sitio46. Las partículas
son nanopartículas de sílice quelatada de níquel dopado con tetrametilrodamina, superficie
modificada con ácido nitrilotriacético. Cuando se exponen a un lisado bacteriano que contiene el
dominio de unión al ligando del receptor de estrógeno (ER alfa) como un componente minoritario,
estas perlas muestran una unión de especificidad muy alta, lo que permite la purificación de la
proteína en un solo paso. Las partículas también exhiben una buena actividad para la unión del
ligando y la unión inducida por el ligando a los coactivadores en los experimentos de FRET en
solución y en los análisis fluorométricos y FRET de microarrays de proteínas 46.

Del rango de estudios presentado aquí, está claro que la investigación sobre las interacciones de las
proteínas de nanopartículas es un área dinámica, pero aún queda mucho por hacer. También parece
haber una contradicción considerable en términos de los hallazgos, con, por ejemplo, una mayor
estabilidad de la proteína tras la unión informada para algunos pares proteína-nanopartícula y la
desestabilización de proteínas informada para otros pares proteína-nanopartícula. Además, los
efectos de las nanopartículas en la fibrilación de proteínas parecen ser específicos de pares de
proteínas de nanopartículas. Por lo tanto, estamos un tanto lejos de los paradigmas generales,
aunque la corona de nanopartículas y proteínas como la identidad biológica de las nanopartículas
parece ser un efecto general, con el potencial de unificar varios hallazgos en un enfoque general
para caracterizar las interacciones entre nanopartículas y proteínas.

Conclusión
Nuestra hipótesis central es que, en lugar de la simple nanopartícula en sí, es la corona dinámica de
biomoléculas asociadas que define la identidad biológica de la nanopartícula. Por lo tanto, esta
corona podría conducir a un sistema de clasificación de nanoseguridad más claro, y también es esta
corona la que podría usarse para diseñar resultados nanomédicos. Por lo tanto, creemos que los
esfuerzos muy considerables se dirigirán cada vez más a este desafío por parte de la comunidad
científica.

También notamos la sorprendente característica de que las nanopartículas a veces son capaces de
inducir efectos dramáticos sobre las interacciones de proteínas, como en el caso de la fibrilación de
proteínas. Esta observación, cuando se combina con el potencial de las nanopartículas para
transportarse al cerebro, implica la necesidad de estudiar todo este campo con más profundidad en
el futuro.

Los científicos en el siglo XX desarrollaron la química física superficial y los campos relacionados a
un alto punto de logro. Es una observación interesante que una vez más, aunque en un contexto
bastante diferente, la adsorción de biomoléculas de gran superficie se ha convertido en un campo
clave para el desarrollo de las interacciones bionano.

Agradecimientos
Financiación de ESF EPITOPEMAP, EU NanoInteract, EU CIPSNAC, EI y SFI BioNanoInteract. Los
autores desean agradecer a Sara Linse, Tommy Cedervall, Celia Cabailero-Lago y Anna Salvati por
sus contribuciones al trabajo revisado aquí.
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