A.

Definisi DNA Rekombinan

Menurut Cohen dan Boyer (1980: DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang dibuat
dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama.
Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam
DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda
untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik (News Medical.Net)

Robert (2009) mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena
penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul DNA yang
sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. Rekayasa genetika adalah serangkaian teknik untuk
memodifikasi dan merekomendasi gen dari berbagai organisme yang berbeda yang juga disebut
teknologi DNA rekombinan.

B. Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik kejuruteraan genetik yang melibatkan penggunaan
DNA rekombinan - yaitu DNA yang menggabungkan maklumat genetik dua species organisme yang
berlainan. Jika gen-gen ini digabungkan dalam sel telur atau sel sperma supaya maklumat genetik ini
boleh diturunkan kepada progeni, maka hasil daripada gabungan ini dinamakan organisme transgenik.
Penghasilan DNA rekombinan melibatkan tiga proses:
1. Manipulasi DNA in vitro (luar sel organisma)
2. Gabungan, atau rekombinasi DNA sesuatu organisma dengan DNA bakteria dalam plasmid atau
bakteriofak
3. Pengklonan, atau teknik untuk mereplikasi progeni yang membawa DNA rekombinan.
Proses-proses diatas pertama kali dilakukan oleh Paul Berg dan A.D. Kaiser pada tahun 1972. Mereka
berjaya memasukkan DNA prokariot kedalam bakteria, kemudian oleh S.N. Cohen dan Herbert Boyer
yang berjaya menggabungkan DNA organisme eukariot bersama plasmid bakteria.
Komponen yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk
memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan
mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan
untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah
diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA
untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.
Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag. Enzim restriksi,
digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens
spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama
enzim endonuklease restriksi.
Ada dua bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika yaitu sebagai berikut :
1. Enzim seluler/Cellular Enzymes
Enzim yang dipakai dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah :
a. enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan
berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim ini yang
paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat
sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.
b. DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini
mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk barunya.
Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak mengherankan, karena
semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka.

c. RNA polimerisasi yaitu enzim yang berfungsi untuk ’membaca sekuen DNA dan mengsintesis
molekul RNA komplementer. Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak
ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’ gen mereka.

d. DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan genetik
dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan
DNA atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara DNA atau RNA yang satu dengan
lainnya.

e. Reverse transcriptases adalah enzim yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA
membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom
RNA mereka menjadi DNA ketika mereka menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika
bertemu dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil dan dipisahkan
oleh introns dalam kromosom.

2. Vektor natural/ Natural Vectors

Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus
bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang
dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah ini. Vektor disini bisa diartikan
sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya.

Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil
rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan
digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan
tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah
plasmid dan virus atau bacteriophage (Witarto, 2005).
Proses pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:
1. Teknik mengisolasi DNA
2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease
3. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase
4. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)
5. Vektor berkembang dengan seleksi DNA yang direkayasa.
Gambar 1: mekanisme DNA Rekombinan
1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding sel. Dalam
proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel telah
dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan
buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat
(SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan melakukan sentrifugasi
sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak serta organel target yang pada akhirnya didapatlkan
DNA yang nantinya dilakukan pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.

2. Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim restriksi.
Ada dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi
tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:

a. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA.

b. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya.

c. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Berdasarkan
tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu:

Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua untai DNA
terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang
runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA
dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain.

Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua
fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing
untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung tumpul sulit dilakukan
sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau
penambahan enzim deoksinukleotidil transferase.

3. Tahap selanjutnya adalah penyambungan molekul DNA. Ada tiga cara yang dapat digunakan
untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA
ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Ketiga yaitu pemberian enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Suhu optimum bagi
aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami
terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan
terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan
15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).

4. Setelah tahap penyambungan molekul DNA, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan
teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik
telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan,
campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.
Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformasi karena sel
inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA
rekombinan.

5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Oleh karena DNA yang
dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi
untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel
transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel
yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Pada dasarnya ada
tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu:
1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal.
2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan
3. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari
fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in
vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan
hibridisasi koloni (Tjahjoleksono, 2009).

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu:

1. Transformasi : transfer DNA yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang
berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan terlepas
ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel.
2. Konjugasi : merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui
kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang berdekatan.
Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.

3. Transduksi : transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan menggunakan
virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur donor yang
menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA lainnya adalah
DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag.

C. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan

Berbagai penelitian tentang DNA rekombinan banyak gunakan dan dimanfaatkan dalam berbagai
bidang, diantaranya :
1. Bidang industri
Penelitian rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat dengan cepat. Berbagai usaha yang
telah giat dilakukan misalnya :
1. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam langsung dari dalam bumi
2. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia
Mencipatkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia seperti etilen yang diperlukan
untuk pembuatan plastic
2. Bidang Pertanian
Beberapa manfaat rekayasa genetika dalam bidang pertanian diantaranya adalah:

1. Mengganti pemakaian pupuk nitrogen yang banyak dipergunakan tapi mahal harganya, oleh
fiksasi nitrogen secara alamiah. Bakteri tanah Rhizobium sp dapat mengadakan infeksi ke dalam akar
dari tanaman family Leguminosae. Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan bakteri yang terdapat di
dalamnya dapat mengikat zat lemas bebas dari udara untuk di ubahnya menjadi nitrogen yang dapat
diambil dan digunakan oleh tanaman tersebut.

2. Teknik rekayasa genetika mengusahakan tanaman-tanaman (terutama yang mempunyai arti

ekonomi) yang tidak begitu pekah terhadap penyakit yang disebabkan oleh bakteri, jamur dan cacing.

3. Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida sendiri.

3. Bidang Peternakan
1. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas yang dapat mematikan
anak-anak babi
2. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan mulut, yaitu penyakit ganas
dan sangat menular pada sapi, domba, kambing, rusa dan babi
4. Bidang Kedokteran
Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yang dibutuhkan dalam
bidang kedokteran yaitu pembuatan insulin manusia oleh bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan
penyakit diabetes (Wikipedia.org).

Apakah Manfaat Teknologi DNA Rekombinan ?

Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan
pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA
Rekombinan.

Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah
berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah digunakan
untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia.
Bagaimanakah kita dapat memperoleh insulin manusia ini ?. Apakah untuk mengobati orang yang
sakit diabetes ini kita harus mengorbankan orang yang sehat untuk diekstrak insulinnya ?. Tentu saja
tidak. Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri.
Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah berhasil
memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri.

Contoh lainnya adalah kapas transgenik. Kapas transgenik pernah ramai dibicarakan di media masa
kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas transgenik adalah kapas-bt. Tanaman kapas-bt telah
mengandung gen penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis (Bt). Toksin tersebut
dapat membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan terhadap serangan hama.

Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan sebagian dari hasil rekayasa yang
dilakukan manusia terhadap makhluk hidup dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.

ALAT DAN BAHAN UNTUK DNA REKOMBINAN

Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada
pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid,
transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA

Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau
mengubah sifat bakteri.

Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda.
Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan.

Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA.

Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk
mendeteksi klon yang benar.