História:

-estrutura do DNA
-engenharia genética: combinação do DNA da E. colo com o papiloma
vírus (1972)
-descrição de enzimas de restrição específicas de DNA para clonagem in
vitro (1975)
-nova metodologia: Southern blotting (1975) – clivagem de DNA pelas
enzimas, eletroforese, transferência de bandas para uma membrana e
hibridização por sondas
-técnica de sequenciamento determinou alterações em DNA e doenças
genéticas (1977)
-surgimento da PCR (princípios 1971/experimentos década de 80)

Definição:
Isolar e amplificar genes específicos de interesse e introduzi-lo em um
vetor para haver a clonagem, ou seja, ocorre a multiplicação. Mais comum fazer
com microrganismos por se desenvolver rapidamente e ser de fácil manipulação.

Etapas:
1°- fragmento de DNA (inserto) é amplificado e ligado ao DNA do vetor,
gerando uma molécula de DNA recombinante
2°- DNA recombinante é propagado em uma célula hospedeira
susceptível a diversos antibióticos

Informações necessárias:
-saber a sequência de nucleotídeos
-organismo de origem
-para procariotos pode ser realizado a PCR para amplificar
-para eucariotos deve ser retirado os introns, pois estes podem
atrapalhar na expressão do gene em uma célula procariota (não possuem
a maquinaria necessária para processamento do mRNA) – pode ocorrer
solução através da RT-PCR

Enzimas de restrição
 Tipo I – sequência assimétrica e clivagem com distância aleatória do local
de reconhecimento
Tipo II – estruturas palindromicas e clivagem no sítio se reconhecimento
Tipo III – sequência assimétrica e clivagem entre 24 a 26 pdb posteriores
*Após clivagem há pontas para que outro DNA se ligue

PCR
-PCR normal
-RT-PCR: para microrganismos sem introns, pois estes não tem
maquinaria para retirar os introns do mRNA após a transcrição

Vetores
-vírus VS40 foi o primeiro utilizado
-os mais comuns são os plasmídeos e os fagos

Aplicação
-muito utilizado para produção de vacinas através de proteínas da cepa7
viral – mais segura que a vacina com o vírus morto
-transformação de genes (ex: produção de insulina por bactérias)