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Laboratório de Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas

Conservação da Biodiversidade – Restauração de Ecossistemas - Genética de Plantas Nativas


Departamento de Biologia Animal e Vegetal - Departamento de Biologia Geral
Centro de Ciências Biológicas - Universidade Estadual de Londrina
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EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL

1. Ligar o banho-maria e ajustar a temperatura para 60 – 65ºC.


2. Preparar o tampão de extração no momento da sua utilização, de acordo com a quantidade a ser utilizada.
3. Coletar cerca de 50 – 150 mg de folha e transferi-la rapidamente para um almofariz.
4. Adicionar nitrogênio líquido e, após a sua evaporação, pulverizar o material até obter um pó bastante
fino.
5. Acrescentar 3 mL de tampão de extração ao macerado e ressuspendê-lo.
6. Transferir a solução para microtubos estéreis de 1,5 mL, colocando-os em banho-maria a 65oC.
7. Incubar os microtubos em banho-maria entre 60 – 65oC por 30 minutos, agitando-os a cada 10 minutos.
Em seguida retirar os tubos do banho e adicionar 10 microlitros de Proteinase K. Deixar no banho por
mais 30 minutos, sempre agitando-os.
8. Centrifugar em microcentrífuga à 10.000 – 12.000 rpm durante 10 minutos.
9. Verter o sobrenadante para um microtubo limpo.
10. Após o sobrenadante atingir a temperatura ambiente, proceder à primeira extração com fenol-clorofórmio
(1:1), na proporção de 1:1 (1 parte do sobrenadante: 1 parte de fenol-clorofórmio).
11. Inverter o microtubo suavemente por várias vezes para conseguir uma emulsão homogênea.
12. Centrifugar a 10.000 – 12.000 rpm durante 10 minutos.
13. Retirar cuidadosamente os microtubos da microcentrífuga e transferir a fase superior (aquosa) para um
novo microtubo, evitando pegar contaminantes da fase inferior.
14. Adicionar RNAse 100 mg/mL (1:100) e incubar a 37oC por 30 minutos.
15. Adicionar o mesmo volume da solução de clorofil (24 partes de clorofórmio: 1 parte de álcool isoamílico)
16. Agitar suavemenete e centrifugar a 10.000 – 12.000 rpm durante 10 minutos.
17. Transferir a fase superior para um novo microtubo.
18. Adicionar o mesmo volume da solução de clorofil (24 partes de clorofórmio: 1 parte de álcool isoamílico)
19. Agitar suavemenete e centrifugar a 10.000 – 12.000 rpm durante 10 minutos.
20. Transferir a fase superior para um novo microtubo.
21. Adicionar à fase aquosa 1 volume de álcool isopropílico.
22. Homogeneizar a solução até a formação do pellet.
23. Lavar o pellet no prórpuio tubo em álcool 70%, por três vezes.
24. Adicionar 100 μL de água ultra pura e colocar na geladeira, a 4oC, para ressuspender (por 1 hora, ou de
preferência, de um dia para outro).
25. Etiquetar e armazenar no freezer até o momento da quantificação, diluição e amplificação.
Recomendações importantes:
Trabalhar na capela durante todo o procedimento de extração.
Descartar os microtubos e as ponteiras que tiveram algum contato com o fenol no lixo hospitalar.

Tampão de extração do dna genômico:


Para 10 Concentra
Substância
mL ção Final
Tris-HCl 1 M pH 8(1) 1 mL 100 mM
NaCl (PM 58,44) – 5 M 2,8 mL 1,4 M
EDTA 0,5 M, pH 8(2) 400 μL 20 mM
CTAB(3) 0,2 g 2,0 %
Água (q.s.p.) 5,78 mL -
β-mercaptoetanol (2 μl/ mL
de tampão)(4) (último a ser 20 μL 0,2 %
adicionado)
PVP40(4) 0,1g 1,0 %

(1) Trisma 7-9 99% (Sigma); (2) EDTA sem cálcio (C10H14N2Na2O82H2O); (3) Adicionar o CETAB após
todas as outras substâncias, inclusive a água, para evitar a formação de espuma e o conseqüente desvio nas
quantidades estabelecidas; (4) Substâncias a serem acrescentadas ao tampão no momento da extração.

Tampão de armazenamento do DNA (TE):


Concentração
Substância Para 100 mL
Final
Tris-HCl 1M, pH 1 mL 10 mM
8,0
EDTA 0,5M, pH 8,0 200 μL 1 mM
Água (q.s.p.) 100 mL -