PROTOCOLO PARA EL TRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PERIFITON Y MONTAJE

DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS DE DIATOMEAS

Saúl Blanco
Universidad de León
degsbl@unileon.es

I. Tratamiento de muestras de perifiton para la obtención

de frústulos de diatomeas

Fundamento:

La identificación y recuento microscópicos de diatomeas

requiere la obtención de suspensiones de frústulos libres
de materia orgánica. Los frústulos son la cubierta silícea
de las diatomeas, su forma y ornamentación es la base de la
taxonomía de estas algas. Para vaciar el contenido celular
de las diatomeas y eliminar otros organismos no
silicificados, es necesario someter a la muestra a una
oxidación intensa mediante peróxido de hidrógeno.

Material:

- Equipo de vacío (bomba, quitasatos, conductos, válvula,

cánula)
- Matraces aforados o erlenmeyer de 200 – 250 mL
(1/muestra)
- Rotulador de vidrio
- Cuaderno de laboratorio
- Guantes de látex
- Campana de gases
- Placa térmica con agitador
- Agua destilada

1
- Papel de filtro
- Pipeta Pasteur
- Viales herméticos (1/muestra)
- Etiquetas y cajas para las muestras

Reactivos:

- Peróxido de hidrógeno 100 vol. (30 % v/v)

- Ácido clorhídrico 1 M
- Formaldehído 35 % v/v

Método:

1. Las muestras de perifiton (epiliton, epifiton) deben

haber permanecido almacenadas fijadas con formaldehído al 4
% v/v, tamponado con HEPES (N-2- hidroximetilpiperazina-n-
2’-ácido sulfónico), borato o carbonato sódico, o
hexametileno-tetramina, en botes herméticos opacos y en
lugar fresco y oscuro. (Para almacenamientos prolongados,
comprobar periódicamente el pH y el grado de silicificación
de los frústulos).

2. Trabájese con una submuestra de aproximadamente la mitad

del volumen de la muestra original. El resto se preservará
en el recipiente original por si hubiera que repetir el
proceso. Para submuestras que ocupen un volumen superior a
50 mL, decantar en el propio recipiente durante 12 h y
eliminar el sobrenadante (Véase USO DE LA BOMBA DE VACÍO).
Si la fracción sedimentada ocupa más de 50 mL, tomar una
submuestra de 50 mL y desechar el resto. No importa que
queden restos de macrófitos, macroalgas, etc.

3. (Recomedable trabajar en campana de gases). Con guantes

de látex, agítese y viértase el contenido de cada

2
recipiente en matraces aforados o erlenmeyer de 200 – 250
mL y enrásese a este volumen con peróxido de hidrógeno 100
vol. Cada matraz debe identificarse con rotuladores de
vidrio con un código numérico. En un cuaderno de
laboratorio, relaciónese este código con la identificación
de la etiqueta de cada muestra con todos los datos
disponibles. Es esencial identificar con exactitud cada
muestra a lo largo de todo el proceso.

4. Para muestras ricas en materia orgánica, es posible que

la reacción de oxidación (sobre todo durante el
calentamiento) haga efervescer la mezcla y se desaloje
cierta cantidad. Con guantes de látex, límpiese el exterior
del recipiente con papel de filtro.

5. Tápense los recipientes con tapones de papel de filtro.

Colóquense en la placa calefactora (preferible bajo campana
de gases), a 150º C durante 12 h, si es posible con
agitación leve. Vigilar de vez en cuando la reacción.
Posteriormente, dejar reposar las muestras 12 h en frío en
un lugar sin vibraciones.

6. Eliminar el sobrenadante (Véase USO DE LA BOMBA DE

VACÍO). Limpiar los restos de materia orgánica que quedan
en el interior del tubo del matraz aforado/erlenmeyer con
papel de filtro. Resuspender el pellet. Añadir una gota de
ácido clorhídrico diluido con una pipeta Pasteur (no tocar
los bordes del recipiente). Si se observa reacción, seguir
añadiendo gota a gota, agitando suavemente, hasta que
desaparezca. Enrasar con agua destilada1. Dejar decantar en
un lugar frío y sin vibraciones durante 12 h.

1
No tocar los bordes del grifo del depósito de agua destilada con el
recipiente.

3
7. Eliminar el sobrenadante (Véase USO DE LA BOMBA DE
VACÍO). Resuspender el pellet y enrasar con agua destilada.
Dejar decantar en un lugar frío y sin vibraciones durante
12 h.

8. Eliminar el sobrenadante (Véase USO DE LA BOMBA DE

VACÍO). Resuspender el pellet y rellenar –si es necesario-
con agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 10
mL2. Verter este volumen en un vial hermético de 10 mL,
agitando enérgicamente varias veces a fin de recuperar todo
el contenido.

9. Con una pipeta Pasteur, añadir unas gotas de

formaldehído 35% v/v para prevenir el crecimiento de hongos
y tapar herméticamente. Etiquetar3 el vial con todos los
datos disponibles y la fecha de tratamiento. Almacenar en
cajas etiquetadas.

10. Lavar interior y exterior de los recipientes dos veces

con agua destilada, agitando enérgicamente para asegurarse
de que no quedan restos de muestra. Borrar la etiqueta con
metanol. Dejar secar y almacenar en un sitio seguro.

USO DE LA BOMBA DE VACÍO: Utilizar un quitasato de

emergencia entre la bomba y el quitasato principal. Unir el
conducto de la bomba a la boca del quitasato de emergencia
y la salida de éste a la boca del quitasato principal a
través de un conducto con válvula de despresurización.
Ajustar l a cánula a la salida del quitasato principal.
Ajustar al otro extremo de la cánula una pipeta Pasteur.
Encender la bomba. Aplicar la pipeta sobre la superficie

2
En caso de que se aprecie la presencia de arena/sólidos gruesos,
agitar, dejar decantar durante 20” y recuperar con una pipeta 10 mL
del sobrenadante en un vial hermético de 10 mL . Desechar el pellet.
3
Utilizar etiquetas y rotuladores indelebles. Cubrir la etiqueta
escrita con papel de celo.

4
del líquido a extraer sin tocar las paredes o el fondo del
recipiente. De esta forma se podrá reutilizar la pipeta
para otras muestras. No apurar todo el sobrenadante, dejar
algo sobre el pellet para resuspender la muestra y no
contaminar la pipeta. Una vez terminado, dejar funcionando
la bomba hasta vaciar la cánula. Despresurizar accionando
la válvula y apagar la bomba. Desconectar todos los
componentes. Vaciar los quitasatos (usar guantes: contienen
peróxido de hidrógeno) en un recipiente para residuos de
agua oxigenada. Lavar interior y exterior de los quitasatos
dos veces con agua destilada, agitando enérgicamente para
asegurarse de que no quedan restos de muestra. Dejar secar
y almacenar en un sitio seguro. Ídem para la pipeta
Pasteur.

5
II. Montaje de preparaciones microscópicas permanentes de
diatomeas

Fundamento:

Para la observación de diatomeas en microscopía óptica es

necesario el montaje de preparaciones permanentes
definitivas utilizando como medio una resina sintética
(Naphrax ®), con un coeficiente de difracción 1,7, que
permite obtener imágenes microscópicas contrastadas en
campo claro de los frústulos. Las preparaciones pueden
almacenarse entonces de manera indefinida.

Material:

- Portaobjetos de vidrio de
- Cubreobjetos redondos de
- Pinzas
- Rotulador no permanente
- Rotulador de vidrio
- Cuaderno de laboratorio
- Pipetas Pasteur (1/muestra)
- Caja de cartón
- Flexo
- Campana de gases
- Agua destilada
- Varilla de vidrio
- Placa calefactora
- Cuchilla (escalpelo)
- Papel de filtro
- Etanol
- Microscopio óptico directo
- Caja para muestras microscópicas

6
Reactivos:

- Naphrax (0,1 mL/muestra)

Método:

11. De cada muestra se realizarán tres preparaciones

iguales (réplicas). Colocar con pinzas (no tocar con la
mano) 3 filas de cubreobjetos (3 réplicas) en una
superficie plana y nivelada4, lejos de fuentes de
vibración5. Colóquense tantas columnas de cubreobjetos como
muestras se vayan a procesar. Identifíquese cada uno de los
cubreobjetos (muestra/réplica) escribiendo un código sobre
la superficie con un rotulador no permanente. Relaciónese
este código con la identificación de cada muestra en el
cuaderno de laboratorio.

12. Agítese enérgicamente el vial con la muestra y

colóquese 0,1 – 1 mL (en función de la concentración –
turbidez-) de la misma sobre cada cubreobjetos con una
pipeta Pasteur, repartiendo este volumen por toda su
superficie. Si fuera necesario, rellenar con una pipeta
Pasteur con agua destilada hasta cubrir toda la superficie
del cubreobjetos6. Desechar las pipetas entre muestras.
Dejar decantar hasta que se evapore todo el
líquido(usualmente unas 12 h, se puede acelerar colocando
un flexo cerca de las muestras) en un lugar resguardado del
polvo (tapar con una caja).

4
Es recomendable trabajar sobre una tabla barnizada sobre la que se
pueda escribir.
5
Es necesario ubicar esta superficie lejos de lugares frecuentados y
con actividad habitual, para evitar que se le dé accidentalmente un
golpe.
6
Si la tensión superficial se rompe y el líquido se desborda del
cubreobjetos, hay que desecharlo y reemplazarlo por otro. La
superficie de trabajo ha de permanecer totalmente seca y limpia.

7
13. (Operar en campana de gases). Colocar una gota de
Naphrax7 (0,1 mL) en el centro del portaobjetos -
previamente etiquetado8- con una varilla de vidrio. Coger
el cubreobjetos y volcarlo sobre el portaobjetos de forma
que la muestra quede en contacto con el Naphrax.

14. Colocar el cubreobjetos en el borde de una placa

calefactora a 150º C. El Naphrax comenzará a burbujear
(evaporación del tolueno). Cuando deje de hacerlo, retirar
la preparación y depositarla rápidamente sobre una
superficie plana y fría. Desplazar las burbujas hasta el
exterior aplicando una ligera presión sobre el cubreobjetos
antes de que cristalice. En caso de que queden burbujas se
puede recalentar y repetir el proceso.

15. Raspar los restos de Naphrax que sobren con una

cuchilla y limpiar la muestra con un papel de filtro
empapado en etanol. Verificar a simple vista y con un
microscopio directo (400 X) los siguientes aspectos:

a) Que el reparto de frústulos es homogéneo por toda

la preparación. En caso contrario, añádase algún
agente surfactante (p. ej. unas gotas de etanol en
la muestra original) y repetir desde el punto 12,
asegurándose que no se toca la superficie de
trabajo durante la decantación.
b) Que no hay un exceso de materia orgánica
(partículas oscuras), indicativo de que la
oxidación no fue completa. En este caso, sométase
la suspensión de frústulos a una nueva oxidación
(punto3).

7
El recipiente de Naphrax debe permanecer cerrado herméticamente todo
el tiempo posible.
8
Utilizar etiquetas y rotuladores indelebles. Cubrir la etiqueta
escrita con papel de celo.

8
 c) Que no hay un exceso de materia inorgánica
(partículas incoloras). En este caso, la
concentración de partículas silíceas grandes se
puede disminuir agitando la suspensión de
frústulos, dejando decantar durante 20”,
recuperando el sobrenadante y desechando el pellet.
d) Que no hay un exceso de frústulos fragmentados en
la preparación, o de frústulos con pérdida de
silicificación. En ese caso la oxidación ha sido
demasiado violenta: repetir desde el paso 3,
reduciendo el tiempo y/o la temperatura de reacción
e) Que hay una densidad adecuada de valvas en el campo
óptico (5-50 valvas/campo a 400 X). En caso
contrario, reajustar la proporción muestra/agua en
el paso 12.

6. Almacenar la preparación en una caja para muestras

microscópicas convenientemente etiquetada. Almacenar porta
y cubreobjetos no usados en las cajas originales,
resguardados del polvo.