UNIVERSIDAD DE PANAMA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
ESCUELA DE BIOLOGIA

TEMA DE ANTEPROYECTO

Determinación de la presencia de Campylobacter spp. por inmunoensayo visual 3M TECRA

CAMPYVIA, en muestras de carcasas de pollo fresco.

Estudiantes:
ADDIS MONTENEGRO 8-780-2483
STEPHANIE SAM 6-712-1253

Profesor asesor:
RICARDO SOUSA

Mayo de 2010

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 INDICE

Página

I. Introducción………………………………………………………………………….... 3

II. Antecedentes…………………………………………………………………………... 4

III. Justificación……………………………………………………………………………. 9

IV. Objetivos……………………………………………………………………………… 11

V. Hipótesis………………………………………………………………………………. 11

VI. Materiales y Métodos…………………………………………………………………. 12

VII. Resultados a esperar…………………………………………………………………... 16

VIII. Cronograma de actividades………………………………………………………….... 16

IX. Presupuesto………………………………………………………………………….... 17

X. Referencias bibliográficas…………………………………………………………….. 18

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 I. INTRODUCCIÓN

Los alimentos son uno de los vehículos de transmisión de enfermedades bacterianas. Entre
estos, tenemos a los productos derivados de la industria avícola. La contaminación se produce
principalmente durante la fase del sacrificio de animales y del procesamiento de algunos
productos que entran en contacto con las heces.

Según la Seguridad alimentaria microbiana, se estima que cada año en los Estados Unidos
hay aproximadamente 76 millones de enfermedades transmitidas por alimentos. Si bien, la
mayoría de estas enfermedades no se diagnostican y no son declaradas como tal, por lo tanto,
aproximadamente 325.000 casos resultan en hospitalización, y 5.000 casos son fatales. Casi 2,4
millones de casos son causados por Campylobacter spp., 1,4 millones de casos son causados por
Salmonella no tifoidea y 270.000 casos son causados por Escherichia coli patógena, incluyendo
E. coli O157: H7. (Mead y col., 1999).

Zhao y col. (2001), realizaron un estudio sobre la prevalencia de Campylobacter, E. coli y

Salmonella, en pollos, pavos, puercos y carne de res. Estos productos provenían de 59
supermercados de cuatro cadenas distintas. Entre los resultados obtenidos, llamó la atención la
prevalencia en Campylobacter. De los cuatro productos, el pollo fue el que obtuvo un índice de
contaminación mayor con 70,7%, le siguió el pavo con 14%, el puerco con 1.7% y de último la
carne de res con 0.5%.

En la República de Panamá, no se han hecho estudios sobre la prevalencia de Campylobacter

en alimentos. Considerando, que es un microorganismo emergente en el ámbito internacional, es
pertinente realizar un estudio sobre su detección en pollo crudo. Para esta investigación, se
utilizará una técnica rápida de inmunoensayo, que es el TECRA CAMPY VÍA, de la 3 M.

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 II. ANTECEDENTES

Las diarreas infecciosas son un gran problema en los países en desarrollo y ocupan altas tasas
de morbilidad y mortalidad, especialmente en niños de corta edad. Hasta hace poco tiempo sólo
era posible conocer su etiología en un porcentaje de casos relativamente bajo. Sin embargo, en
los últimos años, con la aplicación de nuevas metodologías, se pudo incluir dentro del espectro
de agentes microbianos a “nuevos enteropatógenos”, como son los Rotavirus, Criptosporidium,
Aeromonas y las especies termófilas de Campylobacter. (Malbrán, 2001)

El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) reporta más de 10.000 casos
por año, de enfermedades microbianas. Sin embargo, muchos de estos casos no son
diagnosticados o no se denuncian. Aunque la vigilancia activa, reporta 20 casos por cada
100.000 personas, se calcula que el Campylobacter causa de 2 a 4 millones de casos por año en
los Estados Unidos. De los cuales, 124 muertes anuales se atribuyen a C. jejuni (CDC, 2005).
Las estimaciones actuales son que por cada caso de campilobacteriosis el gasto es de 920
dólares en promedio, con un costo anual total de aproximadamente de mil millones de dólares
(CAST, 1994). El CDC informó que la incidencia de infección por Campylobacter, disminuyó en
un 30 por ciento en el período de diez años entre 1996 y 2006 (MMWR, 2007).

Estudios realizados en el Reino Unido (2000), reportaron que las especies de Campylobacter
fueron la mayor causa de enteritis bacterial aguda. Este estudio se realizó para determinar la
prevalencia de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli en bovinos frescos, ovinos, hígado de
porcino y porciones de aves, comparados con cepas asociados a casos humanos de
campylobacteriosis, ocurrido en el mismo periodo. Se examinaron 489 muestras, y se aislaron
73.2% de especies de Campylobacter. El pollo presentó la tasa más alta de contaminación 83.3%
y el Campylobacter jejunii predominó con 77.3% (Marler, 2010)

Se ha demostrado que la ingestión de 500 organismos (una cantidad que se puede encontrar
en una gota de jugo de pollo), puede causar enfermedad en seres humanos (Tauxe, 1992; FSIS,
1996). Aún así, la prevalencia de Campylobacter jejuni en el medio ambiente, se producen como
aislados, eventos esporádicos, y no son generalmente una parte de brotes importantes. Los
reportes de brotes de más de 1.000 enfermos de campylobacteriosis se han documentado, y su

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frecuencia es del consumo de leche contaminada o de suministros de agua no clorada. ( Internet
Medical Publishing, 2008).

Según Marta Chavarria; Cerca del 30% de los casos de campilobacteriosis humana en la UE
están relacionados con una inadecuada manipulación, preparación y consumo de la carne de
pollo. Este microorganismo infecta el tracto gastrointestinal y generalmente se transmite a través
de alimentos o agua contaminada. Esto incluye carnes (especialmente el pollo), el agua de
fuentes contaminadas (riachuelos de la montaña o ríos que están cerca de donde pastan los
animales) y leche o productos lácteos que no han sido pasteurizados. La carne contaminada
infecta a los humanos en forma indirecta, si no se cocina de manera adecuada y no se somete a la
temperatura que elimina el patógeno y que se alcanza con los tratamientos térmicos. (Chavarría,
2010).

Otra forma indirecta de contaminación, es por medio del jugo de la carne, que actúa como
vehículo de infección y es capaz de contaminar utensilios y superficies, tales como: tablas de
picar, cuchillos e inclusive otros alimentos que entren en contacto. (Chavarría, 2010)

Los animales domésticos pueden ser portadores de Campylobacter y transmitir la bacteria a

sus dueños. El caso menos común de transmisión, es de persona a persona, por el contacto
directo con la materia fecal de una persona infectada. (Nemours Foundation, 2010)

En general, los niños menores de un año, los adolescentes, las personas inmunosuprimidas y
los adultos jóvenes son los más afectados. (Nemours Foundation, 2010)

El Campylobacter jejuni, es un bacilo Gram-negativo, microaerófilo, termófilo que crece

mejor a 42 °C y a bajas concentraciones de oxígeno. Estas características son adaptaciones para
el crecimiento en su hábitat normal (los intestinos de las aves de sangre caliente y mamíferos).
Varias especies estrechamente relacionadas con características similares, Campylobacter coli,
Campylobacter fetus y Campylobacter upsalienis, también pueden causar enfermedad en el
hombre, pero son responsables de menos del 1% de las infecciones humanas por año, y no son de
origen alimentario. (CDC, 2005).

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 El cuadro N° 1 muestra las características físico-químicas del C. jejunii

Cuadro N° 1
Características físico – químicas de Campylobacter.

Características Resultados
Crecimiento a 25° -
Crecimiento a 35-37 °C -
Crecimiento a 42 °C +
Reducción de nitratos +
Test de la catalasa +
Test de la oxidasa +
Crecimiento en agar de MacConkey +
Motilidad +
Consumo de glucosa -
Hidrólisis de hipurato +
Resistencia al ácido nalidíxico -
Resistencia a la cefalotina +
pH (49 - 9) +

Fuente: Farace y Viñas, 2007.

La enfermedad causada por la ingestión de estas bacterias se llama campilobacteriosis y la

diarrea sanguinolenta es el síntoma más común. Los otros síntomas típicos de la infección
incluyen fiebre, náuseas, vómitos, dolor abdominal, dolor de cabeza y muscular. La mayoría de
los casos son leves, no requieren hospitalización, y puede ser autolimitada. Sin embargo, la
infección por Campylobacter jejuni puede ser grave y potencialmente mortal, si la presentan con
otras enfermedades. (Donato, 2007)

El período de incubación (el tiempo entre la exposición a la bacteria y la aparición del primer
síntoma), es de dos a cinco días, pero los brotes pueden ocurrir hasta 10 días después de la
ingestión. La enfermedad por lo general, no dura más de una semana. Sin embargo, los casos
graves puede persistir durante un máximo de tres semanas, y aproximadamente el 25% de los
individuos presentan recaída de los síntomas. (Barreda, 2004)

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 Además del tracto gastrointestinal, el Campylobacter también puede afectar a otras partes del
cuerpo. Puede producirse bacteriemia, es decir, las bacterias pueden circular en el torrente
sanguíneo. Esto es más común, en pacientes jóvenes, ancianos y en aquéllos con enfermedades
crónicas o sistemas inmunitarios débiles. Dependiendo del paciente, este trastorno puede
resolverse sin síntomas o puede afectar a una serie de órganos. (Nemours Foundation, 2010)

En casos aislados, puede aparecer una forma inusual de artritis después de una infección por
Campylobacter. Algunos informes indican que esta infección bacteriana ha provocado el
síndrome Guillain-Barre, una enfermedad que afecta el sistema nervioso. Esta enfermedad es un
trastorno en el cual el sistema inmunológico del cuerpo ataca a sus nervios, a menudo después de
la infección con un virus respiratorio o gripe estomacal. (Marler, 2010)

La bacteria que provoca la enfermedad, "Campylobacter", llega a las personas por distintas
vías: (Chavarria, 10 Marzo del 2010)
 A través del ambiente
 Por contacto directo con animales enfermos
 Por el consumo de alimentos contaminados
 Agua no tratada

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) sostiene que la información sobre la

incidencia de esta enfermedad en humanos, es todavía limitada y varía mucho en función del
país. De ahí la necesidad de establecer nuevos mecanismos de control y métodos de supervisión
que permitan resultados más precisos para conocer el alcance real de la enfermedad y, por tanto,
las acciones que se deben adoptarse como medidas de prevención. (Chavarrías, 2010)

Tomando en cuenta las condiciones de tensión de oxígeno y la temperatura de incubación, la

FDA recomienda un medio de aislamiento que consiste en un agar selectivo sin sangre y en
condiciones anaerobias (Oxoid). Las colonias presuntivas de Campylobacter (pequeñas,
grisáceas, húmedas) son repicadas en un medio de cultivo con agar - sangre e incubadas a 42°C

7
por 48 h. Las colonias aisladas del agar sangre, son identificadas posteriormente por la prueba de
tinción de Gram, Oxidasa y Catalasa.

Los métodos tradicionales tardan alrededor de 4 días para obtener un resultado positivo o
negativo. Actualmente con las técnicas rápidas de inmunoensayo de la 3M, podemos minimizar
este tiempo, en aproximadamente 42 horas. El kit 3M TECRA CAMPY VIA, es una de las
pruebas disponibles más rápida, simple, precisa, confiable y económica, para detectar
Campylobacter.

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III. JUSTIFICACIÓN

La intoxicación alimentaria se debe a la ingestión de alimentos contaminados con la toxina de

microorganismos patógenos. (Murria, 1995). Los alimentos implicados con más frecuencia son
los productos cárnicos, principalmente el pollo, ya que resulta ser un medio adecuado que
permite el crecimiento del microorganismo y la liberación de toxinas. (Bryan, 1998; CDC, 1999;
Fernández, 2001; Frazier y Werthott, 1993). Por lo expuesto, es importante detectar en forma
preventiva cualquier microorganismo que pueda ser de riesgo a la salud.

Se han realizado muchos estudios para identificar los patógenos asociados al consumo de esta
carne, que pueden afectar la salud de la población, tales como Salmonella spp. y Campylobacter
jejuni (Bryan y Doyle, 1995; Herrarte, 2004; Carrillo, 2009). Esta bacteria causa
campilobacteriosis y es la fuente más frecuente de gastroenteritis aguda. En Estados Unidos, esta
bacteria causa aproximadamente 2.4 millones de casos de gastroenteritis por año (Tauxe, 1992;
citado por Hiett et al., 2002).

Los brotes de campilobacteriosis son poco comunes pero han sido reportados en diferentes
partes del mundo, usualmente han sido causados por el consumo de leche sin pasteurizar, de agua
no tratada y ocasionalmente por la ingesta de pollo insuficientemente cocido y de otros alimentos
contaminados (Lehner et al., 2000; Melby et al., 2000; Park, 2002). En el estado de Oklahoma
ocurrió un brote de campilobacteriosis, en el que se afectaron 16 a 20 personas que almorzaron
en un restaurante. La causa del brote fue contaminación cruzada entre lechuga y pollo crudo
(CDC, 1998). En septiembre del 1998 se reportó un brote en el Centro de Juventud Austriaco,
donde 28 de los 38 niños exhibieron síntomas clásicos de campilobacteriosis. La causa del brote
fue la ingesta de leche sin pasteurizar distribuida por una vaquería local (Lehner et al., 2000). En
una comunidad subártica ocurrió un brote de gastroenteritis causado por C. jejuni. La comunidad
consumió agua no clorada durante aproximadamente cuatro semanas en el verano de 1998. Se
afectaron 330 personas (Melby et al., 2000).

Es de gran importancia supervisar las buenas prácticas en el manejo apropiado de los

alimentos en todas las cadenas alimentarias, desde la producción, procesamiento y almacenajes

9
en las industrias, servicios de comida, hasta en los hogares, para minimizar la presencia e
infecciones por este patógeno.

Esta investigación ayudará al Ministerio de Salud y las entidades de salud responsables de

velar por la inocuidad alimentaria en el país, para estandarizar la detección de Campylobacter
spp. en alimentos más sospechosos y establecer medidas de control, como la prevención de
ETAs por Campylobacter.

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IV. OBJETIVOS

Objetivo general:

 Detectar la presencia de Campylobacter spp. en carcasas de pollo fresco, procedentes de un

establecimiento local, utilizando el Kit 3M TECRA CAMPYVIA.

Objetivos específicos:

 Recolectar muestras de pollos en un establecimiento local.

 Determinar con el inmunoensayo visual de 3M TECRA CAMPYVIA la presencia de
Campylobacter spp, en carne de pollo.

 Analizar la importancia de la prevalencia de Campylobacter spp. como microorganismos

causantes de infecciones por alimentos en nuestro país.

 Confirmar la presencia de Campylobacter jejuni en muestras de pollo fresco mediante

pruebas bioquímicas.

V. HIPÓTESIS

Hi: Las muestras de pollo fresco tomadas de establecimientos local contienen Campylobacter
spp.

Ho: Las muestras de pollo fresco tomadas de establecimientos local no contienen

Campylobacter spp.

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VI. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales incluidos en el Kit 3M TECRA

 Concentrado de buffer de lavado
 Control positivo
 Control negativo
 Conjugado
 Diluyente del conjugado
 Substrato
 Diluyente para el substrato
 Solución Stop
 Pocillos recubiertos de anticuerpos
 Aditivo para muestras
 Libreta de Instrucciones
 Hoja de registro de resultados de muestras
 Tarjetas de colores No. 2

Materiales requeridos no incluidos en el Kit 3M TECRA

 Incubadora a 42C
 Pipetas electrónicas para dispensar 1ml, 0.20ml y 0.05ml
 Puntas de pipetas
 Botellas plásticas lavadoras ( 500 ml )
 Papel plástico o papel Wrap
 Baño María o equivalente a 100º C
 Tubos de ensayo ( 5ml)
 Stomacher ó licuadora
 Bolsas para el stomacher ( 400ml )
 Kit 3M TECRA LISVIA

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Medios de Cultivo para el enriquecimiento:

TCE(B): 3MTM Campylobacter Broth Base for TecraTM Kits (3M, 1984)

Recolección de Muestras:
Las muestras de carcasas de pollo fresco serán colectadas de un establecimiento local y serán
analizadas el mismo día de recolección. Se transportarán en una hielera con un refrigerante y se
mantendrán a bajas temperaturas hasta que se le realice la prueba TECRA CAMPY VIA de
inmunoensayo visual. La toma de muestra se realizará 2 veces a la semana por un periodo de 4
meses.

Procedimiento del análisis:

3M TECRATM Campylobacter Inmunoensayo Visual (VIA)

El presente Protocolo puede ser utilizado para probar las carnes crudas, aves de corral crudas y
alimentos para animales

Enriquecimiento primario

Añadir 25 g de muestra a 225 ml de caldo de

Campylobacter para el Kit TECRA (CBT) Primer Día

Incubar a 42 ° C (± 1 ° C) durante 40-48 horas

Preparación de la prueba de ELISA

Añadir 50 μL del aditivo de muestra a un tubo

rotulado.
Segundo día

Transferir de 1 ml de la muestra contenida en el caldo

CBT al tubo con el aditivo.

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 Calentar durante 15 minutos en un baño de agua
hirviendo (100°C)

Negativo Positivo

Añadir 200μL del control positivo, control negativo y muestras

en pocillos individuales

Cubra los pocillos con plástico wrap

Incubar 36 ° C (± 1 ° C) durante 60 minutos

Lavar 3 veces

Añadir 200μL del conjugado a cada pocillo

Cubra los pocillos con plástico Wrap

Incubar 36 ° C (± 1 ° C) durante 30 minutos

Lavar 4 veces

Añadir 200μL del sustrato a cada pocillo

Incubar 20 -25 ° C (temperatura ambiente) durante 15 minutos

Leer y registrar los resultados

Elaborar pruebas bioquímicas

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IMPORTANTE:
El caldo de enriquecimiento debe estar a Temperatura de 20° a 25°C antes de mezclarlo con la
muestras.

Prueba de confirmación:
Sistema automatizado para microbiología (vitek).
El sistema Vitek es un sistema automatizado, fabricado por bioMerieux, Inc., Hazelwood, MO.
Está basado en el principio básico de fotometría. Las bacterias utilizan un substrato que produce
un cambio de color y densidad óptica. Estos cambios son detectados por diodos emisores de luz
y detectores fototransistores. Este sistema está compuesto por un módulo de filtro-sello, una
incubadora con lector, un módulo de computadora, una terminal de datos y una impresora. Este
sistema es capaz de identificar bacterias gram positivas y gram negativas, anaerobios y
levaduras. También realiza pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Es capaz de realizar
“Tamizajes” de orina con enumeración e identificación.

Los patrones bioquímicos son automáticamente analizados y almacenados por el sistema

automático VITEK. Al final de cada ciclo de incubación, la terminal de datos imprime un
informe para cada tarjeta del lector/incubador.

Los porcentajes de probabilidades del informe indican la probabilidad de que el organismo

escogido sea identificado correctamente a partir del grupo de organismos dados. La probabilidad
está determinada por el patrón de reacción bioquímica establecido por la computadora
programada VITEK.

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VII. RESULTADOS A ESPERAR

Con el uso de la técnica de 3M TECRA CAMPY VIA, se espera detectar la presencia de

Campylobacter spp. en las muestras de carcasas de pollo fresco. De esta forma, se puede calcular
el porcentaje de incidencia de esta bacteria en estos productos en nuestro país.

VIII. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Actividades

Recopilación X X X X X X X X X X X X X X X X
de Bibliografía
Selección del X X
sitio de
muestreo
Toma de X X X X X X X X X
muestra
Preparación de X X X X X X X X X
reactivos y
medios de
cultivos
Preparación de X X X X X X X X X
muestras
Realizar el X X X X X X X X X
inmunoensayo
Analizar los X X X X X X X X X
resultados
Análisis X X X X X
estadístico

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IX. PRESUPUESTO

MATERIALES PRECIO POR UNIDAD

EQUIPOS
Incubadora 1,000.00
Autoclave 1,500.00
Homogenizador 550.00
Hot plate 245.00
Baño María 1,000.00

MATERIALES Y CRISTALERIA
Tubos de ensayo 10ml 62.80
Botellas lavadoras 20.00
Pipetas electrónica 20-200 ul 900.84
Puntas de Pipetas 16.00
Elermeyer 1000ml
Probeta 500ml
Papel Wrap 10.00
Hielera 20.00
Bolsas estériles para toma de muestra 30.00

REACTIVOS
Papel indicador de pH 20.00
Agua destilada 50.00
TECRA Campylobacter suplemento selectivo 370.00
TCEB ( caldo de enriquecimiento para 170.00
Campylobacter marca Tecra )
Kit Inmunoensayo TECRA para la identificación 1,300.00

de Campylobacter spp.(2 kit de 48 pruebas)

MUESTRA
Pollo crudo 200.00

TRANSPORTE 100.00

ALIMENTACIÒN 150.00

MATERIAL FUNGIBLE
Hojas Blancas 2.00
Plumas 4.00
Lápices 1.00
Fotocopias 10.00
Impresión 40.00

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 Folder 15.00
Internet 30.00

Subtotal 7,816.64
Imprevistos 500.00
Total 8,316.64

FINANCIAMIENTO
Este proyecto será financiado por la Empresa 3M y por la Caja del Seguro Social.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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