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Estudio in vitro de la citotoxicidad de

nanopartículas de TiO2

CONFERENCE PAPER · OCTOBER 2014

DOI: 10.13140/2.1.3867.8726

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4 AUTHORS, INCLUDING:

Jonathan Maximiliano Schuster Margarita Laczeski

Instituto de Materiales de Misiones - IMAM (… National University of Misiones
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Carlos Enrique Schvezov

INSTITUTO DE MATERIALES DE MISIONES
31 PUBLICATIONS 7 CITATIONS

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Available from: Jonathan Maximiliano Schuster

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 CONGRESO INTERNACIONAL DE METALURGIA Y MATERIALES SAM-CONAMET/IBEROMAT/MATERIA 2014 1
SANTA FE, ARGENTINA – 21–24 OCTUBRE, 2014

Tópico: C13. Biomateriales

Estudio in vitro de la citotoxicidad de nanopartículas de TiO2

Jonathan M. Schuster a,*, Margarita E. Laczeski b, Mario R. Rosenberger a, Carlos E. Schvezov a

a
Instituto de Materiales de Misiones (IMAM), Universidad Nacional de Misiones – CONICET, Félix de Azara 1552, Posadas(3300), Misiones, Argentina.
b
Instituto de Biotecnología Misiones “Dra. María EbeReca” (InBioMis), Universidad Nacional de Misiones, Ruta Nacional 12 km 7 1/2 Miguel Lanús
(3304), Misiones, Argentina.
*Autor correspondiente.Dirección de correo electrónico: jschuster@fceqyn.unam.edu.ar

ABSTRACT

Titanium dioxide (TiO2) coatings are widely employed in human implants due to their good corrosion resistance and tissue biocompatibility. In the case of
moving implants the TiO2 coating is subject to wear releasing nano and micrometrics debris to the surrounding system. The debris may promote or produce
redox reactions due to its electronic properties acting as donor or acceptors of electrons in its interaction with the many surrounding organic compounds, this
may produce the formation of free radicals which are strongly oxidant degrading the organic compounds. When the debris are of nanometric size the surface
/volume ratio is larger and therefore the relative activity per unit of mass, and the consequent relative higher degree of oxidative stress of the cells. In the
present paper the capacity of TiO2 nanoparticles (Degussa P-25) to produce cell damage or death in a short period of time (3 hours) is evaluated and reported.
The cells studied were the lymphocytes and the following techniques to determine the effects on the cells were used; trypan blue exclusion test, DNA laddering
and observation of apoptotic bodies. The results obtained with each technique show that the nanoparticles of TiO 2 produce damage in the cell membrane of the
isolated lymphocytes, no apoptotic bodies were observed in the treatments with the nanoparticles and in the case of the DNA laddering technique no
fragmentation of the DNA (apoptosis marker) was detected on the cells.
Keywords: Titanium Dioxide, Nanoparticles, Cytotoxicity, DNA laddering, Implantable Prosthesis.

RESUMEN

Los recubrimientos de óxido de titanio (TiO2) son utilizados en una amplia gama de dispositivos médicos implantables, estos confieren a la prótesis resistencia
a la corrosión y una mejor compatibilidad con los tejidos. En el caso de prótesis recubiertas con una capa de óxido de titanio que poseen partes móviles, el
recubrimiento de TiO2 está sometido a desgaste por lo tanto pueden liberar fragmentos, tanto de tamaño micrométrico como nanométrico. El TiO2 es un
semiconductor. El mismo puede actuar como dador o aceptor de electrones pudiendo reaccionar con especies dadoras y aceptoras de electrones, adsorbidas en
la superficie de la partícula o cercanas a ella, dando lugar a reacciones rédox que generan radicales libres, estos son muy oxidantes y provocan la degradación
de gran variedad de compuestos orgánicos. En forma de nanopartículas se incrementa el área superficial del TiO 2, por lo tanto, se espera una mayor actividad
por unidad de masa en comparación con las partículas más grandes y un mayor nivel de estrés oxidativo sobre las células. En este trabajo se evaluó la
capacidad de las nanopartículas de TiO2 (Degussa P-25) para producir daño y muerte celular a corto plazo (3 horas) en linfocitos asilados a través de las
técnicas de: método de exclusión por azul de Tripano, DNA laddering y observación de cuerpos apoptóticos. Se encontró que las nanopartículas producen
daños en la membrana celular en los linfocitos aislados. No se detectaron cuerpos apoptóticos en ninguno de los tratamientos con nanopartículas. La técnica de
DNA laddering tampoco detectó fragmentación del ADN de la célula (marcador de apoptosis) en los tratamientos probados.
Palabras Clave: Dióxido de Titanio, Nanopartículas, Citotoxicidad, DNA laddering, Prótesis Implantables.

conductor o como aislante dependiendo de diversos factores, como por

1. Introducción
El titanio puro o en aleaciones se utiliza extensamente para una amplia
gama de dispositivos médicos implantables, tales como: implantes
dentales, prótesis articulares, stents cardiovasculares y dispositivos de
fijación de la columna vertebral; debido a su combinación ventajosa de
propiedades biológicas y físico-química. El titanio tiene una alta
reactividad con el oxígeno, formando una delgada y compacta capa de
óxido de titanio en la superficie que le confiere resistencia a la corrosión.
Esta capa (o película) puede ser natural o sintetizada por diferentes
métodos físico-químicos [1,2]. Las películas de TiO2 poseen óptimas
propiedades antitrombogénicas, esta propiedad lo hace muy útil para
recubrimientos de materiales que estarán en contacto con la sangre [3,4].
El TiO2 es un semiconductor; es decir que se comporta como un
ejemplo, el campo eléctrico o magnético, la presión, la radiación que le
incide o la temperatura del ambiente en el que se encuentre [5]. El mismo
puede actuar como dador o aceptor de electrones pudiendo reaccionar con
especies dadoras y aceptoras de electrones, adsorbidas en la superficie de
o cercanas a ella, dando lugar a reacciones rédox que generan radicales
libres, estos son muy oxidantes y provocan la degradación de gran
variedad de compuestos orgánicos [6].
El desgaste es una causa importante de la degradación estructural de las
prótesis con partes móviles [7]. Una de las mayores causas del fracaso de
los implantes de titanio es la generación de iones y de partículas (nano y
micropartículas) a través de la fractura y la abrasión de las capas de óxido
metálico de protección y su deposición en el tejido local [8]. Estas entran
en contacto con tejidos humanos generando efectos de corto (inflamación,
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daño celular) y de largo plazo (aberraciones cromosómicas, toxicidad,
carcinogenicidad) [8].
Los nanomateriales son objetos que tienen una dimensión inferior a 100
nm, mientras que las nanopartículas se definen como partículas con tres
dimensiones de menos de 100 nm [9]. Debido a su tamaño
extremadamente pequeño, las nanopartículas tienen una superficie mucho
mayor que la misma masa de materiales en la micro escala. Las
propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas son atribuibles a: su
pequeño tamaño (área de superficie y distribución de tamaño),
composición química (pureza, cristalinidad, propiedades electrónicas,
etc.), estructura de superficie (reactividad de la superficie, grupos
superficiales, recubrimientos inorgánicos u orgánicos, etc.), solubilidad,
forma y agregación [10]. El incremento en la reactividad superficial
predice que las nanopartículas presentan una mayor actividad biológica
por unidad de masa en comparación con las partículas más grandes. En el
caso del TiO2 se incrementaría su capacidad de dar lugar a reacciones
rédox que generan radicales libres que son muy oxidantes y provocan la
degradación de gran variedad de compuestos orgánicos [11].
Estudios sugieren que los nanomateriales no son inherentemente benignos
y que afectan los comportamientos biológicos a nivel celular, subcelular y
proteico. Además, algunas nanopartículas pueden viajar por todo el
cuerpo, depositarse en órganos, penetrar las membranas celulares, alojarse
en las mitocondrias y desencadenar respuestas perjudiciales [10].
El TiO2 es una sustancia biológicamente inerte en la forma macroscópica
y no dañina para los humanos, no se reportó citotoxicidad o genotoxicidad
[12,13]. En cuanto a las nanopartículas de TiO2, su efecto sobre los
sistemas biológicos es incompleta y contradictoria [14-16].
Es muy importante saber si los fragmentos (nanopartículas) que pueden
ser desprendidos de los implantes son capaces de producir la muerte
celular de tejidos humanos y si así lo fuera, cual es el mecanismo por el
cual se lleva a cabo el proceso, apoptosis o necrosis, ya que tienen efectos
muy diferentes sobre las células adyacentes. La necrosis se da cuando una
célula presenta un daño severo y pierde, entre otras cosas, la integridad de
su membrana que la lleva a muerte por lisis. En estas circunstancias se
libera el contenido celular (ej.: enzimas proteolíticas intracelulares) lo que
in vivo provoca lesión tisular y favorece la aparición de procesos
inflamatorios [17,18].La muerte celular por apoptosis es una muerte
fisiológica, que se puede presentar, ya sea porque el organismo requiere
para su desarrollo de la muerte en particular de esa célula, o bien porque
la célula sufrió un daño irreparable y la célula muere en beneficio del
organismo. La célula muere por activación de una serie de mecanismos
que provocan que no pierda la integridad de su membrana, esto sucederá
hacia el final del proceso. Esto no se observa in vivo ya que las células
apoptóticas son eliminadas por fagocitosis antes de perder la integridad de
la membrana [17,18].Una característica (marcador) que se considera
exclusiva de la muerte apoptótica, es la degradación internucleosomal del
ácido desoxirribonucleico (ADN), de manera tal que al someterse a una
separación por electroforesis en un gel de agarosa, se advierte un patrón
de bandas discretas característico, al que se denomina patrón en escalera.
Este patrón revela que durante la muerte por apoptosis los fragmentos
producidos son múltiplos de 180 pares de bases, correspondientes a la
longitud del ADN que se enrolla alrededor de cada nucleosoma. Los
nucleosomas, constituidos por un núcleo de histonas rodeado por dos asas
de ADN, son elementos estructurales de la cromatina. Durante la muerte
por apoptosis la activación de proteasas específicas promueve la
degradación de proteínas componentes de la matriz nuclear, como la
cromatina se encuentra adosada a las proteínas de esta matriz la
fragmentación de las mismas promueve la desorganización de la
cromatina. La subsecuente activación de endonucleasas que tienen acceso
a las regiones de ADN entre cada nucleosoma hidroliza el ADN
produciendo fragmentos cuya longitud es un múltiplo del número de bases
enrolladas en un nucleosoma [19,20]. En el caso de la muerte por necrosis
el patrón es una mancha difusa y que es originado por la fragmentación
inespecífica del ADN. En la apoptosis se induce la reorganización del
citoesqueleto y la desintegración (vesicularización) de la célula en cuerpos
apoptóticos, esto no ocurre en la necrosis [21].
En el presente trabajo, se investiga los efectos provocados por la
exposición a corto plazo, in vitro, de linfocitos humanos a nanopartículas
de TiO2 que puedan ser liberadas desde una prótesis implantada por
procesos de desgaste; evaluando la viabilidad de los linfocitos, la
fragmentación del ADN y la formación de cuerpos apoptóticos.
2. Materiales y Métodos
2.1. Preparación de suspensión de nanopartículas de TiO2
Se utilizó la forma comercial en polvo TiO2 Degussa P-25 (Alemania),
cuyas propiedades se detallan en la Tabla 1, para simular los fragmentos
nanométricos de TiO2 liberados desde una prótesis implantada sometida a
desgaste. Para la preparación de la soluciones se coloca una cantidad
apropiada de P-25 en una solución de cloruro de sodio al 0.9%y es
sometida a un proceso de sonicado para preparar la solución madre (0,01
g de TiO2 /mL de solución). Las soluciones de trabajo (125 μg/mL y 250
μg/mL) se realizarán mediante dilución en serie, seguido por sonicación y
agitación vigorosa. El criterio para la selección de la dosis (0, 125, 250
μg/ml) para el ensayo se basó en los informes de estudios anteriores
realizadas en linfocitos humanos [22,23].
Tabla 1 – Propiedades de las partículas de TiO2 Degussa P-25 [6].
Propiedad TiO2 Degussa P-25
Área superficial 40-50 m2/g
Composición de fases cristalinas 15-30% rutilo, 85-70% anatasa
Diámetro medio de partículas 30 nm
2.2. Aislamiento de linfocitos humanos
Se realizaron extracciones de sangre entera anticoagulada con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) (dilución 1/100) por venopunción (10
ml) procedente de 10 individuos sanos, de sexo masculino, edad 20 y 35
años, no fumadores, que no ingieran bebidas alcohólicas, no consuman
drogas y que no hayan padecido recientemente una enfermedad
infecciosa. Antes de la extracción de sangre, se obtuvo el consentimiento
informado del paciente mayor de edad.
La sangre tiene una fase sólida, que incluye a los eritrocitos (o glóbulos
rojos), los leucocitos (o glóbulos blancos) y las plaquetas; y una fase
líquida, representada por el plasma sanguíneo. Los glóbulos blancos se
clasifican a su vez en polinucleares y mononucleares. Para aislar los
linfocitos (leucocitos mononucleares) a partir de sangre entera se utilizó el
método de Bøyum [24] basado en la centrifugación de la muestra sobre un
gradiente de densidad discontinuo, cuyo medio original consistía en una
mezcla de ficoll y diatrizoato de sodio, con densidad de 1,077 g/mL. Este
método es rápido y simple, por lo que se utiliza muy comúnmente para
obtener preparaciones enriquecidas de linfocitos sanguíneos. Aunque
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estrictamente esta técnica resulta en la separación de los leucocitos plasmática formando una vesícula, estas estructuras, son denominadas
mononucleares, que incluyen tanto a los linfocitos como a los monocitos, cuerpos apoptóticos.
los primeros superan ampliamente en número a los segundos, cuando se
trabaja con muestras de sangre periférica. La mezcla de ficoll-diatrizoato 3. Resultados y Discusión
está disponible comercialmente, estéril y lista para su uso. En este trabajo
se utilizó Ficoll-Paque®. 3.1. Viabilidad de los linfocitos: Método de exclusión por azul de
Los linfocitos aislados se resuspendieron con 700 μl de solución de tripano
cloruro de sodio (0,9 %) y glucosa (5 %), que es una solución isotónica
(con respecto a los linfocitos) y aportadora de energía. En los linfocitos aislados el grupo control (0 μg/ml) tuvo una viabilidad
promedio de 99,7±0,8% mientras que los del tratamiento con 125 μg/ml y
2.3. Exposición de los linfocitos a las nanopartículas de TiO2 250 μg/ml tuvieron una viabilidad de 92,5±1,6% y 89,6±2,8% (ver Tabla
2 y Figura 1). Teniendo en cuenta estos resultados las nanopartículas de
Los linfocitos fueron incubados por 3 horas a 37 ºC en solución salina TiO2 (en ambas concentraciones) producirían daño a la membrana
glucosada con diferentes concentraciones de nanopartículas de TiO 2 (125 plasmática de los linfocitos. El posible mecanismo de daño a la membrana
y 250 μg/ml). En el grupo control los linfocitos fueron incubados en de los linfocitos sería la peroxidación lipídica de los fosfolípidos de
solución salina glucosada. membrana causada por los radicales libres generados por las
Después de estos tratamientos los linfocitos fueron procesados para el nanopartículas de TiO2 [27,28]. Se sabe que este método es una técnica
estudio de citotoxicidad y para la detección de la fragmentación del ADN. simple y rápida para la medición de la viabilidad celular pero tiene el
inconveniente de que la misma se determina indirectamente a partir de la
2.4. Viabilidad de los linfocitos: Método de exclusión por azul de integridad de la membrana celular. Resulta conveniente analizar entonces,
tripano que es posible que la viabilidad de una célula esté comprometida
(entendiéndose como la capacidad de crecer, funcionalidad normal, etc.)
El azul de tripano (Biopack, Argentina) es un colorante utilizado para el manteniéndose su integridad de membrana (al menos transitoriamente).
recuento de células íntegras por exclusión de dicho colorante. Este método Por el contrario, la integridad de la membrana celular puede ser anormal y
está basado en que las células vivas no se colorean debido a que la sin embargo la célula puede ser capaz de repararse a sí misma y ser
membrana celular íntegra es selectiva respecto a qué compuestos pueden plenamente viable. Otro problema potencial puede aparecer porque el
atravesarla y no captan el azul de tripano, mientras que sí atraviesa la método se evalúa subjetivamente y pequeñas cantidades de absorción de
membrana de las células no viables. Se cuentan como muertas las células colorante indicativo de lesión de celular pueden pasar desapercibidos [25].
teñidas de azul y como vivas las refringentes (sin color) [25].
Tabla 1 – Viabilidad (%) de los linfocitos obtenida por el método de
2.5. Fragmentación del ADN: técnica DNA laddering exclusión por azul de tripano. Tiempo de exposición 3 horas.
Individuos 0 μg/ml 125 μg/ml 250 μg/ml
Para observar la presencia del marcador de la apoptosis (fragmentación
del ADN) se utilizó la técnica de DNA Laddering, para ello se realizó la
extracción de ADN genómico total de los linfocitos sometidos a los 1 100 94,4 92,4
diferentes tratamientos utilizando el protocolo de Miller et al. modificado 2 100 93,1 86,1
[26]. Se analizó el ADN aislado de las muestras mediante corridas 3 100 94,6 88,8
electroforéticas en geles de agarosa al 1,5 % teñidas con GelRed TM, 4 100 90,2 92,1
Biotium, Inc.; EEUU, en cuba electroforética (Electrophoresis Subsistem 5 100 89,4 85,5
70 Labnet Internacional) y posterior observación de las bandas en 6 99,2 92,7 88,2
transiluminador UV (Modelo MUV 21-312-220). Se corrió junto al 7 100 92,8 87,3
marcador de peso molecular, Marcador de ADN (D0017) 100 a 1000 pb– 8 100 92,5 93,2
INBIO, Argentina. 9 100 91,8 91,6
10 97,6 93,3 91,0
2.6. Cuerpos apoptóticos Promedio 99,7 92,5* 89,6*
D. E. 0,8 1,6 2,8
Para observar la presencia del marcador de la apoptosis (cuerpos * exhiben una diferencia estadísticamente significativa con el grupo

apoptóticos), se tomó 5 μl de suspensión de linfocitos de cada tratamiento de control negativo según el Test de Student, p < 0.01

y se realizó un frotis (extendido de una gota de suspensión de linfocitos en D.E. (desvío estándar)

la superficie de un portaobjetos). Se llevó a cabo la tinción de

MayGrünwald-Giemsa y la observación a 1000 aumentos con aceite de
inmersión. El tamaño de los linfocitos es pequeño, similar al de un
eritrocito (6-10 micras), el núcleo es de forma redondeada, con cromatina
muy densa que se tiñe intensamente de azul oscuro. El citoplasma, que se
tiñe de azul celeste, es pequeño y forma una especie de aureola alrededor
del núcleo. En linfocitos que han sufrido apoptosis fragmentos nucleares
junto con los constituyentes del citoplasma (incluyendo orgánulos
intactos) son empaquetados y envueltos por fragmentos de membrana
3.2. Fragmentación del ADN: técnica DNA laddering
El resultado de la técnica de DNA laddering en linfocitos aislados
sometidos a los diferentes dosis de nanopartículas de TiO2 fue en todos los
casos negativo, es decir, se observó ADN genómico íntegro, ninguno de
los tratamientos utilizados logró desencadenar apoptosis o necrosis en las
3 horas de incubación (ver Figura 2). El proceso de la apoptosis involucra
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activación de genes específicos y por ello resulta difícil detectar a corto
plazo los marcadores de la misma.
Figura 1 - Método de exclusión por azul de tripano (400 X). Las
flechas señalan: (a) Linfocitos Viables y (b) Linfocitos no viables. La
escala (abajo derecha) corresponde a 30 μm.
Figura 2 – Resultado del ensayo DNA laddering en linfocitos aislados
sometidos a los diferentes dosis de nanopartículas de TiO2. (a)
Individuo 1, (b) Individuo 2.
Figura 3 - Linfocito normal observado en el frotis realizado a partir
del individuo 3 (1000X). La escala (abajo izquierda) corresponde a 10
μm.
3.3. Cuerpos apoptóticos
Se analizaron al microscopio óptico en total 40 frotis en busca de la
presencia de cuerpos apoptóticos, en cada frotis se observaron 25
linfocitos. Todos los linfocitos observados fueron normales (ver Figura 3).
La ausencia de cuerpos apoptóticos está en total acuerdo con los
resultados de la técnica de DNA laddering no indicando la presencia de
apoptosis ya que ambos son marcadores tardíos de la misma.
4. Conclusiones
 No se pudo demostrar la inducción de la apoptosis por
nanopartículas de TiO2 (en concentraciones de 125 μg/ml y 250
μg/ml) en el corto plazo (3 horas) en linfocitos aislados.
 A través de la técnica de DNA laddering no se evidenció
fragmentación del ADN en ninguno de los tratamientos utilizados.
 Con la técnica de azul de tripano se evidenció el daño a la integridad
de la membrana celular por parte de las nanopartículas de TiO 2 (en
concentraciones de 125 μg/ml y 250 μg/ml) en linfocitos.
 La ausencia de cuerpos apoptóticos en los frotis analizados está en
concordancia con los resultados de la técnica de DNA laddering
(ausencia de apoptosis).
 La técnica de azul de tripano y la de DNA laddering evalúan eventos
diferentes, tempranos y tardíos respectivamente, en el proceso de
muerte celular. Por lo tanto los resultados de ambas técnicas son
compatibles.
Agradecimientos
A la Dra. Marta Litter de CNEA por proporcionarnos las nanopartículas
de dióxido de titanio (P-25).
A la Guarnición Militar Posadas y en especial a la Compañía de Sanidad
12 del Ejército Argentino por el aporte voluntario de individuos que
participaron en este estudio y por ceder las instalaciones y el
asesoramiento del personal del Servicio de Laboratorio para el
procesamiento inicial de las muestras de sangre obtenidas.
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