Dir. Gral. Des. Agr. F y Pesca Univ. Aut. De Tamaulipas Fundación Produce, A.C.

oduce, A.C. Consorcio Técnico del Noreste, A.C.

23 al 28 de Septiembre de 2002

ANALISIS DE PATERNIDAD EN GANADO

ESTUDIO DE FILIACION Y RECONSTRUCCIÓN DE GENEALOGÍA UTILIZANDO ADN

Arturo Duarte Ortuño

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia/ UAT
Km. 5.5 Carr. Cd. Victoria-Cd. Mante, Cd. Victoria, Tamaulipas
aduarte@fmvz.uat.mx

INTRODUCCION

El desarrollo científico alcanzado por la biología molecular esta aportando un fuerte impacto en las ciencias
de la biología en general. Las aplicaciones en la genética molecular, están contribuyendo a enriquecer y
descifrar los conocimientos que hasta ahora solo pertenecían al misterio que encierran los genes; estas
diminutas partes de la célula, que comprenden toda la información genética, contenida en forma de una
molécula llamada “Acido DesoxirriboNucleico” conocido de manera común como ADN.
El análisis del ADN abre nuevos campos en las ciencias agropecuarias en general y en la veterinaria en
particular, para la identificación de genotipos, en la identificación de semen y de embriones para evitar el
fraude, en aspectos de disputas legales, en la determinación del sexo en embriones previo al trasplante,
estudios de variabilidad genética de las poblaciones y detección de atributos de algunas razas de ganado
como las autóctonas, en el diagnóstico clínico por ejemplo brucelosis y para detección de enfermedades
hereditarias y factores recesivos de importancia económica como el “Weaver” en ganado Suizo y el alelo B,
de la kappa-Caseina que aporta a los animales una mejor calidad de la leche; en estudios de ligamiento de
genes con caracteres económicos y selección a priori de los reproductores más adecuados para el
mejoramiento de esos rasgos, llamado “Selección Asistida por Marcadores Genéticos” y en la determinación
de la paternidad.
El objetivo de esta guía está dirigido a comprender la metodología para el análisis del ADN en la
determinación de la paternidad, genotipificación y su utilidad en una diversidad de aspectos científicos de la
ganadería.

¿QUE ES EL ANALISIS DE PATERNIDAD?

El análisis de paternidad es una prueba genética que se utiliza para verificar la ascendencia de un individuo
a partir de muestras biológicas del individuo analizado y de sus presuntos progenitores. Aunque su
denominación común es análisis de paternidad, se debería designar mas bien “Análisis de filiación o
ascendencia” pues vale igual para analizar la paternidad como la maternidad. Aquí mantendremos el primer
concepto para referirnos al análisis de filiación.

¿CUÁL ES LA UTILIDAD?

Se utiliza para confirmar la paternidad de un individuo y obviamente, para confirmar el pedigrí del animal, la
paternidad garantiza el valor genético del mismo y por lo tanto su valor económico; dándole un valor
agregado al animal. Esta garantía es muy útil tanto en transacciones comerciales como en la cría de
animales de registro o pie de cría.

En transacciones comerciales:
El comprador puede comprobar la ascendencia del animal que está adquiriendo y de la misma manera su
valor real.

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El vendedor de animales de calidad está interesado en establecer con claridad la autenticidad y el origen de
sus animales, para diferenciarlos de otros de menor calidad.

En animales de registro:
Como control del proceso en la inseminación artificial y la transferencia de embriones.
Para garantizar el pedigrí en el programa de mejoramiento genético.

Sin un adecuado control de la paternidad y por lo tanto la genealogía, se tendrán errores en las líneas
genéticas, que desvirtúan los resultados, haciendo improductivos a largo plazo, los programas y esfuerzos
realizados en los programas de mejoramiento genético del rancho y de la población.

Para ilustrar el efecto negativo que puede tener la paternidad mal asignada sobre la selección, se cita un
estudio realizado por Tercero, Guerra y Alemany (1998) en el que se representa la evolución del número de
linajes mal asignados, según diferentes tasas de error en la asignación de paternidad en una generación.
Como se aprecia en la figura 1, el número de paternidades mal asignadas se incrementa progresivamente a
medida que se incrementa el número de generaciones, en mayor o menor medida dependiendo del
porcentaje de error, pero siempre aumenta. Esto se explica debido a que en cada generación el número de
animales se acumula debido a los descendientes mal asignados en generaciones anteriores.

En países desarrollados como España y en ganaderías con experiencia en manejo y adecuado control como
la Frisona, el porcentaje de paternidades mal asignadas es 10% y puede superar 20% en ganaderías de
otras razas con menor control sobre la reproducción, como las que se explotan en forma extensiva. Si bien
es cierto que este tipo de análisis no evita los errores cometidos en la reproducción, sí impide que esos
animales ingresen a los pedigries o líneas genéticas seleccionadas. Al eliminar los animales incorrectamente
asignados, se mantiene constante el error en la asignación de líneas, como se ilustra en la figura 1;
además, si solo se utilizan animales con la paternidad garantizada, se podrá realizar realmente una
selección genética a un nivel muy fino, con un mejoramiento genético muy importante y sostenido, aun en
caracteres poco heredables.

Figura 1. Evolución del porcentaje de animales mal asignados

100
90
80 1%
70
60 5%
50 10%
40
30 20%
20 50%
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Con control
de paternidad

Número de generaciones transcurridas

Adaptado de Tercero et al. 1998.

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EL PROCESO DE ANALISIS

El proceso de análisis de paternidad tiene varias fases, aquí se describen de manera breve y resumida.

Toma de muestra

El análisis de paternidad por medio del ADN, inicia con la extracción de esta información genética a partir de
muestras de cualquier tejido del animal que contenga células con núcleo. Habitualmente se utiliza sangre
periférica o semen; pero puede realizarse de otros tejidos como piel, raíz del pelo, huesos de animales
incluso muertos. Las muestras de semen pueden ser de una pajilla y no se requiere que los
espermatozoides sean viables. Las muestras de sangre se conservan a 4°C utilizando tubos que contiene
EDTA como anticoagulante, nunca utilizar heparina. También se puede utilizar manchas de sangre o semen
tomados en un papel absorbente, son rápidas y facil de transportarse pero generalmente solo se pueden
utilizar una sola vez. Por facilidad de manejo, se prefiere utilizar tejido, tomado de la piel ya que solo se
requiere 3-5 mm3 y se puede transportar y conservar a temperatura ambiente por largos períodos de
tiempo en un medio apropiado, la calidad y cantidad de ADN que se obtiene permite formar un banco de
muestras adicionales para futuros trabajos o referencia.

Procesado de las muestras

Las muestras recibidas en el laboratorio se pasan de inmediato a procesamiento para la extracción de ADN.
Se utiliza solo 2 mm3 de muestra y el resto se guarda por si fuera necesario un nuevo análisis.
Con el ADN extraído se identifican los genotipos mediante la utilización de 9 loci; aunque hay sugerencias
de utilizar 20 loci, se ha demostrado que solo 4 son suficientes para una determinación de 99.9%, sin
embargo, en el laboratorio siempre se trabajan 9 locis para mayor seguridad. El método de análisis se
describe en la siguiente sección.
Una vez extraído el ADN, se amplifica cada locus específico por medio de PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa) utilizando un Termociclador, de modo que se puede visualizar el fragmento obtenido y la
separación de los fragmentos por su tamaño, mediante electroforesis en gel de acrilamida. El resultado final
es una imagen semejante a la que aparece a la derecha de la figura 2.

Fundamentos del Análisis

Los STRs. Los análisis de la paternidad mediante la utilización del ADN, son posibles gracias a la existencia
de ciertos genes o loci llamados “Repetición corta en Tándem” (o microsatélite) de manera común se les
designa como STR de las siglas en inglés Short Tandem Repeat. Estos son fragmentos de ADN que
contienen 2-4 pares de bases repetidas un número variable de veces. Tienen dos características muy
importantes: el alto polimorfismo y su herencia. Son marcadores de tipo microsatélites, polimorfismo que se
basa en VNTRs, están presentes de manera abundante en el genoma de todos los eucariontes analizados
(Weber y May 1989). El ADN microsatélite es extremadamente útil para estudios poblacionales, debido a
que puede ser examinado un solo loci que puede tener hasta 50 alelos (Amos, et al. 1993). Estos
marcadores VNTR, también llamados SSR ó STR son fragmentos de ADN que contienen 2-, 4- ó 6-
unidades bases repetidas un número variable de veces (por ejemplo, CA, CAAC, o GGAACC) que se han
identificado por medio de sondas hechas de oligonucleótidos repetidos en forma escalonada (Weber y May,
1989; Litt and Luty, 1989; Tautz, 1989). Los loci microsatélite se analizan amplificando una región específica
(región “target”) utilizando tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida por la

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separación de los fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida para obtener la mejor resolución
en la lectura. El tamaño de los alelos pueden diferir desde dos hasta varios pares de bases.

El polimorfismo nos permite tener gran número de alelos distintos en cada locus (plural loci, se utiliza aquí
para definir cualquier fragmento de un cromosoma, sin necesidad de conocer sí se trata de varios genes,
uno solo o una parte de él) y por tanto, gran capacidad de discriminación; de tal manera que un alto
porcentaje de los animales son heterocigotos (tienen dos alelos distintos) y estos alelos son distintos entre
los diferentes animales.

La herencia es esencial, pues supone que cada animal recibió un alelo de su padre y el otro procedente de
la madre, por lo tanto permite que se pueda utilizar para identificar la paternidad.

Para ayudar a explicar el concepto, la figura 2 ilustra los alelos de dos animales, el animal 1 con dos alelos,
uno de ellos con 17 repeticiones y el otro con 7 repeticiones, el animal 2 tiene uno de 27 y el otro de 2
repeticiones.

Animal 1 1 2 M
35
Paterno

27
Materno

21
Animal 2
Paterno
11

Materno
5
2

Figura 2. Repeticiones cortas en Tandem

A medida que el número de repeticiones es mayor, los alelos son de mayor tamaño, señalado en la figura
con números a la derecha.

En cada columna se analiza la muestra del animal 1 y 2. Aparecen unas bandas que corresponden a los
fragmentos o alelos de cada animal. Están separados por tamaños, apareciendo los de menos tamaño mas
abajo y por lo tanto su número de repeticiones. Se acostumbra añadir al gel un marcador (M) de fragmentos
de tamaño conocido, sirven para conocer las muestras analizadas por comparación de los tamaños de
fragmentos.

Los loci para el análisis de paternidad

Una vez extraído el ADN de los animales a probar, se realiza la detección para diferentes locus
microsatélites, se ejemplifica en la figura 3 el análisis de uno de estos locus para un animal y sus
progenitores.

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Figura 3. Análisis de un locus para determinación de la paternidad.

P H M VI
35

27
Padre: P
11/17
21
Hijo: H
17/20
17

11

Se comparan las muestras del hijo con las de los padres a probar, el hijo siempre debe compartir un alelo
con la madre y el otro con el padre. Si no comparte un alelo con cada uno de ellos, no podrá ser hijo de esos
dos padres. De esta manera se considera si la paternidad es compatible o no. Compatible significa que el
progenitor correspondiente y el hijo comparten un alelo, siendo posible que sean padre e hijo. Incompatible
significa que no comparten ningún alelo, siendo imposible la relación padre-hijo.

Sin embargo, existe la posibilidad de que no siendo padre-hijo, compartan algunos alelos, razón por la cual
mencionamos antes que en el laboratorio se prueban más de 6 alelos; con estos datos se estima la
probabilidad de paternidad, indica que tan probable es la posibilidad de que sea el padre.

La madre M posee dos loci para este alelo analizado, uno de ellos de 20 repeticiones y el otro de 27, por su
parte el hijo posee el de 20 y viniendo el de 17 repeticiones de origen del padre.

Probabilidad de paternidad

La probabilidad de paternidad nos permite conocer hasta que punto dos individuos comparten alelos por
casualidad o porque son padre-hijo. Una probabilidad de paternidad de 98%, indicaría que es 98% mas
probable que la pareja padre-hijo analizada compartan alelos porque existe una relación de filiación que por
mera casualidad. Cuanto mayor sea este valor, mas probable será que dos animales compartan alelos por
ser padre-hijo y menor por casualidad. Dicho sea de paso, una paternidad compatible pero con baja
probabilidad de paternidad, podría ser incompatible si se analiza con mayor detalle, con mas loci
microsatélites. Por el contrario, una paternidad con alta probabilidad, difícilmente dejará de ser compatible

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por muchos loci que se analicen. En general, en ganado se considera que un valor de 90% o más, la
paternidad es probable y si es mayor de 98.6% está prácticamente probada.

Vamos analizarlo mediante una corrida con datos de campo, utilizado en una ganadería de genotipos
criollos. En cada columna de la figura 4 se analiza la muestra de un animal. Aparecen unas bandas que
corresponden a los fragmentos de los alelos de cada animal. Están separados por tamaños, apareciendo los
de menos tamaño mas abajo y por lo tanto su número de repeticiones. Se acostumbra añadir al gel un
marcador (M1 y M2) de fragmentos de tallas conocidas, sirven para conocer las muestras analizadas por
comparación de los tamaños de fragmentos. Se aprecia el polimorfismo detectado para dos de los 5 loci
estudiados. El locus TGLA126 del cual se detectaron 9 alelos (nominados con las letras A hasta la I). En los
carriles 2, 3 y 4 están los genotipos de una vaca, su cría y el posible padre, el semental no.232 criollo
mexicano de rodeo. La vaca tiene un genotipo C/G, la cría es B/G y el semental es B/F. El alelo G de la cría
fue recibido de la madre, mientras que el alelo B solo pudo venir del semental 232. en el carril 5 y 6 esta el
genotipo de otra vaca (B/G) con su cría (E/G), esta cría no es hija de este semental, pues el alelo E solo
pudo venir de otro semental del grupo. Lo mismo opera para el locus BMS6438 localizado sobre el
cromosoma 1, se muestra el polimorfismo con los 7 alelos encontrados, denominados aquí de A hasta la F
para el de talla más pequeña.

Figura 4. Genotipificación y polimorfismo de dos loci en ganado criollo mexicano

M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M2

280pb
272pb A
Polimorfismo del Locus
TGLA126 con 9 alelos en el 256pb F
carril 7
130 pb A Polimorfismo del Locus BMS6438 con 7
alelos
109pb I
100pb

Si bien es cierto que este tipo de análisis no evita los errores cometidos en la reproducción, sí impide que
esos animales ingresen a los pedigríes o líneas genéticas seleccionadas. Al eliminar los animales
incorrectamente asignados, se mantiene constante un bajo error en la asignación de líneas; además, si
solo se utilizan animales con la paternidad garantizada, se podrá realizar realmente una selección genética a
un nivel muy fino, con un mejoramiento genético muy importante y sostenido, aun en caracteres de baja
heredabilidad.
Una vez identificados todos los genotipos de cada unos de los 9 loci con sus respectivos alelos, se procede
a construir los genotipos, permitiendo con ellos la reconstrucción de los pedigríes de la población
muestreada en un rancho o de un pedigrí en particular. Ya que los pedigríes se han reestructurado, es
posible realizar estimaciones de los valores de heredabilidad para las características económicas que estén
disponibles en la base de datos, como pueden ser el crecimiento, la conformación o tolerancia a los
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parásitos. Los dos aspectos señalados (la genotopificación y reconstrucción molecular de los pedigris junto
con las estimaciones de los valores de la heredabilidad, contribuyen con gran solidez para alcanzar un
mejoramiento genético muy fino y de elevada precisión.

En la tabla 1 se aprecian valores de diferentes locus analizados, cuanto más locus se analicen, mayor será
la probabilidad de paternidad cuando es compatible; es decir a medida que se analizan mas locus, más
difícil es que dos animales que sin estar relacionados genéticamente, compartan alelos en todos los locus.
Con estos locus tomados del banco del genoma bovino en internet, la confiabilidad de la prueba es total.

Tabla 1. Probabilidades promedio y acumuladas según el número de locus analizados.

LOCUS No. De Alelos CONTENIDO DE (PIC) PROBABILIDAD

encontrados INFORMACIÓN ACUMULADA %
POLIMORFICA
TGLA122 12 86.4 82.8
IL2 13 92.0 92.8
TAU 6 71.4 97.0
ET10 14 88.6 98.6
BMS382 9 85.3 99.5
BMS574 11 89.2 99.8

TOTAL 99.8 %

Referencias bibliográficas

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