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Ferramentas de análise molecular


e os agentes das grandes endemias

Molecular analysis tools and the agents


of great endemic diseases

Samuel Goldenberg 1

Abstract Recent developments in the field of Resumo Os desenvolvimentos recentes no


molecular biology pave the way for the study, campo da biologia molecular abrem novas
diagnostics and therapeutics of endemic dis- perspectivas para o estudo, diagnóstico e tera-
eases that affect mainly developing countries. pêutica das grandes endemias que afetam so-
Gene manipulation techniques allow the large bretudo as nações em desenvolvimento. As téc-
scale expression of pathogen genes with a po- nicas de manipulação de genes permitem a ex-
tential use in diagnostics or vaccine produc- pressão de antígenos de patógenos em larga es-
tion. In addition, these techniques might re- cala, com a potencial utilização como reagen-
sult in new attenuated vaccines. On the other tes para diagnóstico ou imunógenos. Adicio-
hand, the determination of the nucleotide se- nalmente, essas técnicas poderão levar à ob-
quence of the genome of pathogens might lead tenção de novas vacinas vivas atenuadas. Por
to new targets for drug rational design with a outro lado, a determinação da seqüência dos
potential use in chemotherapy. However these genomas de patógenos poderá levar a novos al-
progresses will not be available to developing vos para o desenho racional de drogas com po-
countries unless a continuous program for re- tencial quimioterápico. Entretanto, esses avan-
search funding and human resources forma- ços só estarão à disposição dos países em de-
tion in these new technologies is adopted. senvolvimento se houver um programa contí-
Key words Biotechnology, Molecular Analy- nuo de investimento e de formação e valoriza-
sis, Endemic Diseases ção de recursos humanos competentes nessas
novas tecnologias.
Palavras-chave Biotecnologia, Análise Mo-
lecular, Doenças Endêmicas

1 Instituto de Biologia
Molecular do Paraná
(IBPM) e Instituto
Oswaldo Cruz, Fiocruz.
Rua Algacyr Munhoz
Mader, 3.775
81350-010 Curitiba PR.
sgoldenb@tecpar.br
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Introdução segundo mecanismo mais importante para a


aquisição da doença de Chagas (Dias & Scho-
As condições de saúde da população mundial field, 1999), e, há alguns anos, os casos de aqui-
podem ser paradoxais. Enquanto em alguns sição de doença de Chagas por via transfusio-
países a expectativa de vida da população ul- nal suplantavam em nosso país os novos casos
trapassa os 80 anos, em muitos outros ela mal por infecção com o inseto vetor, vulgarmente
chega aos 40 anos (Singer & Daar, 2001). No conhecido como barbeiro. Foi somente com a
caso de grande parte dos países em desenvolvi- obrigatoriedade do controle do sangue pelos
mento, as desigualdades sociais e as políticas de bancos de sangue estatais que esse quadro pôde
governo em saúde descontinuadas acabam ge- ser parcialmente controlado (Moraes-Souza,
rando uma situação caótica, onde convivem in- 1999).
divíduos portadores de enfermidades típicas Em geral, o diagnóstico de doenças teve um
das populações dos países desenvolvidos e in- grande avanço nos últimos anos com a técnica
divíduos portadores de doenças já erradicadas de PCR (polymerase chain reaction ou reação
ou inexistentes naqueles países. Exemplifican- em cadeia da polimerase) (Weiss, 1995). A rea-
do, em um grande centro urbano, como a cida- ção de PCR permite que uma dada seqüência
de de São Paulo, temos indivíduos com insufi- de ácido nucléico (geralmente, DNA ou então
ciência cardíaca provocada pelo estresse e pela um RNA que deve ser previamente copiado
alimentação rica em lipídios convivendo com numa molécula de DNA, pela técnica de RT-
pacientes com insuficiência cardíaca provoca- PCR) seja amplificada milhares de vezes me-
da pela doença de Chagas. diante o uso de reagentes adequados; pequenas
Todavia, a saúde pública pode dar um im- seqüências de DNA (oligonucleotídeos) com-
portante salto qualitativo pelo uso de ferramen- plementares ao DNA-alvo que se quer amplifi-
tas poderosas desenvolvidas na última década car que uma vez hibridadas com a seqüência
com o emprego de técnicas da biologia mole- alvo através da complementaridade do parea-
cular. As técnicas de clonagem e de expressão mento de bases do DNA são copiadas milhares
de genes permitiram grandes avanços para a de vezes com a enzima DNA polimerase extraí-
produção de reagentes para diagnóstico e vaci- da de bactérias termo-resistentes. Após a exe-
nas, enquanto as técnicas de amplificação de cução de vários ciclos de amplificação a eleva-
DNA permitiram consideráveis progressos no das temperaturas, o produto final obtido é a
diagnóstico de enfermidades congênitas e doen- molécula-alvo amplificada milhares de vezes,
ças causadas por patógenos de diferentes natu- permitindo sua detecção e caracterização. Hoje
rezas. Mais recentemente, com a maior difusão em dia, há um grande número de testes para
da técnica de microarranjos de alta densidade diagnóstico comercialmente disponível que uti-
ou “chip de DNA”, novas perspectivas se abrem liza a tecnologia da PCR.
para o diagnóstico molecular para estudos re- A técnica de PCR, entretanto, pode não ser
lacionados à resistência de patógenos a drogas adequada para o diagnóstico de doenças, nas
e para o campo da farmacogenômica. quais o parasita apresenta a estratégia de per-
manecer oculto em algum órgão ou tecido, dei-
xando a infecção em estado latente, tal como
Diagnóstico ocorre na fase indeterminada da doença de
Chagas. Além disso, para o diagnóstico de um
O diagnóstico preciso e rápido é essencial para grande número de amostras – bancos de san-
várias doenças, tanto para permitir uma even- gue, por exemplo – ou para o trabalho com
tual quimioprofilaxia, como para evitar sua amostras no campo, as técnicas de amplifica-
disseminação. A transmissão e aquisição de pa- ção de ácidos nucléicos não são apropriadas
togenias por via transfusional é de extrema re- tanto pela dificuldade de automação como pe-
levância para a saúde pública. Houve recente- lo custo intrínseco dos testes. Assim, a opção é
mente, na Ásia, a notificação de mais de 500 a utilização de testes sorológicos, preferencial-
mil casos de pacientes infectados com o vírus mente o teste de ELISA, tanto pela especifici-
HIV por terem doado ou recebido sangue com dade e sensibilidade do mesmo como pela pos-
agulhas contaminadas (Cohen, 2001). Aqui sibilidade de automação. A qualidade dos testes
mesmo, no Brasil, tivemos um grande número de ELISA melhorou nos últimos tempos graças
de hemofílicos que contraiu Aids por transfu- ao uso de antígenos recombinantes, aumentan-
são com sangue contaminado. A transfusão é o do sua especificidade.
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Vários kits comerciais para diagnóstico, que te, resultando na apresentação do antígeno va-
utilizam a PCR, foram desenvolvidos, sendo cinal ao sistema imune do hospedeiro. A gran-
amplamente utilizados por laboratórios de de vantagem dessa vacina é que antígenos que
análises clínicas (Pfaller, 2001). A despeito das devem sofrer modificações especiais pós-tra-
desvantagens mencionadas para o uso da PCR, ducionais características de células de eucario-
a precisão no diagnóstico positivo não deixa dú- tos superiores serão convenientemente proces-
vidas, permitindo a pronta intervenção do clí- sados. O problema que ainda se coloca quanto
nico. Adicionalmente, essa metodologia é bas- a esse tipo de metodologia é o risco de integra-
tante adequada para a detecção de genes de re- ção deste DNA exógeno no DNA do hospedei-
sistência a drogas em patógenos, permitindo ro, que pode levar a manifestações de difícil
que se ataque de maneira mais precisa os casos previsibilidade, incluindo a indução de câncer
de infecção persistente ou infecção hospitalar. ou ainda a indução de doenças auto-imunes
No caso de algumas moléstias causadas por ví- (Robertson & Griffiths, 2001). Todavia, desen-
rus, a utilização da PCR é importante não ape- volvimentos importantes estão sendo feitos
nas para a detecção, mas para a mensuração da nessa área e os ensaios com vacinas animais
carga viral. De fato, a decisão de se iniciar um permitirão que se estabeleçam as condições de
tratamento ou mesmo a dosagem do quimiote- segurança para a futura imunização de huma-
rápico depende da carga viral. O procedimento nos com vacinas DNA.
é particularmente relevante no caso da Aids, Uma segunda abordagem interessante trata
um dos grandes problemas de saúde pública da obtenção de vacinas vivas com patógenos
mundial. atenuados. Os avanços recentes na genética
Algumas moléstias são causadas por mi- molecular de microorganismos (Waters & Jan-
croorganismos que não podem ser cultivados se, 1999) permitem imaginar a obtenção de va-
facilmente ou que levam longos períodos para cinas vivas, isto é, parasitas modificados gene-
crescerem em cultura, como é o caso de micro- ticamente de tal forma que genes de virulência
bactérias que causam a hanseníase ou a tuber- tenham sido eliminados do genoma, fazendo
culose, ou ainda o Helicobacter pylori associado com que os possíveis antígenos vacinais sejam
a vários tipos de úlcera. Nesses casos, as técni- apresentados ao sistema imune do hospedeiro
cas de amplificação são úteis não apenas para o sem que a doença se manifeste. Como alterna-
diagnóstico mas também para a tipagem do tiva, há atualmente um grande esforço para a
patógeno ou até para evitar intervenções cirúr- obtenção de insetos vetores de doenças trans-
gicas (no caso de úlcera). gênicos (Beerntsen et al., 2000), ou seja, cujos
genes foram manipulados de tal forma que o
parasita que utiliza o inseto como hospedeiro
Vacinas intermediário não possa mais desenvolver-se
no mesmo, eliminando, portanto, o ciclo da do-
Estima-se que a próxima década trará grandes ença. Estudos recentes com mosquitos trans-
desenvolvimentos na área de vacinas. A produ- missores da malária se mostram bastante pro-
ção de antígenos vacinais por técnicas de DNA missores. Entretanto, o problema que se coloca
recombinante e a conjugação de múltiplos an- nesta última abordagem é a do impacto am-
tígenos permitirão a multivacinação em uma biental de se lançar uma espécie modificada na
única dose. Assim, é essencial que os países em natureza.
desenvolvimento invistam recursos para a for-
mação de recursos humanos capacitados nas
novas tecnologias para que possam desenvol- Quimioterapia
ver os produtos de que necessitam para sanar
os problemas de saúde regionais. Duas aborda- Uma grande revolução científica neste novo sé-
gens interessantes do ponto de vista tecnológi- culo é, sem dúvida, a determinação da seqüên-
co poderão ganhar a escala industrial. Uma de- cia nucleotídica completa de vários organismos
las é a vacinação via DNA (Gurunathan et al., pelos “projetos genoma”. A compreensão da or-
2000). No caso de vacinas DNA, a imunização ganização e funcionamento dos diferentes ge-
é feita pela injeção diretamente com o gene (a nomas poderá mostrar vias metabólicas pecu-
seqüência de DNA) que codifica um antígeno liares que serviriam como alvos para o desenvol-
vacinal. Este DNA, uma vez introduzido nas vimento de drogas específicas (Bentley, 2000).
células do indivíduo, é expresso funcionalmen- É interessante notar que a análise dos dados ge-
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rados com os poucos genomas completados que permitem a análise simultânea de milhares
mostra que grande parte dos genes seqüencia- de genes e a elucidação de sua possível função
dos é, na realidade do momento, desconhecida. pelo estudo de sua expressão ao longo da dife-
É muito provável que haja genes que codificam renciação ou desenvolvimento de uma célula
enzimas que poderiam ser alvos potenciais pa- ou um indivíduo. Tecnologias apropriadas e
ra o desenvolvimento de novas drogas quimio- novos instrumentos tornam possível colocar
terápicas. De fato, várias iniciativas, compreen- em uma simples lâmina de microscópio milha-
dendo projetos genoma de patógenos, estão em res de genes e analisar a sua expressão em dife-
curso e a análise funcional dos genes seqüen- rentes situações. Esses genes imobilizados são
ciados deverá revelar novos horizontes para a analisados por hibridação com genes isolados
melhor compreensão dos mecanismos de pato- das células em estudo em diferentes situações e
gênese, dos mecanismos de evasão do sistema marcados com fluoróforos de tal maneira que
imune do hospedeiro e dos mapas metabólicos a partir da observação da cor e da intensidade
de patógenos (Carucci, 2001). do sinal após a hibridação pode-se estimar a
Além dos avanços nos projetos genoma, vá- expressão de um gene particular qualitativa e
rios esforços estão sendo concentrados nos pro- quantitativamente. Essas lâminas com milhares
jetos proteoma que visam mapear e caracteri- de seqüências gênicas identificáveis e expostas
zar a totalidade das proteínas de um organis- ordenadamente são denominadas de microar-
mo. O conjunto de dados gerado, associado ranjos de alta densidade, chips de DNA ou ain-
com os avanços obtidos na expressão de genes da biochips (Schena et al., 1995; Watson et al.,
utilizando técnicas de DNA recombinante, per- 1998; Jain, 2001). O potencial dessa metodolo-
mite hoje a obtenção de dados cristalográficos gia é fantástico, pois em um simples experi-
de uma grande quantidade de proteínas (As- mento é possível analisar, por exemplo, os ge-
hton et al., 2001). De posse desses dados estru- nes que são expressos quando um parasita pas-
turais, pode-se iniciar a verdadeira farmacoge- sa de uma forma não-infectiva para uma for-
nômica, que consiste no desenho racional de ma infectiva, ou ainda os genes que são dife-
drogas. Estas drogas poderiam ser aplicadas, rencialmente expressos em células resistentes a
por exemplo, para a quimioterapia de doenças, drogas, ou ainda que genes das células dos ma-
para as quais não há vacinas disponíveis; e de- míferos têm sua expressão alterada quando a
veriam ser efetivas contra o patógeno e absolu- célula é invadida por um patógeno. Assim, es-
tamente inócuas para o hospedeiro. pera-se que a compreensão da biologia funda-
Um dos problemas relacionados à necessi- mental de patógenos, bem como a dos meca-
dade de desenvolvimento de novas drogas ba- nismos de patogenicidade, tenha um grande
seadas em desenho racional é o da existência de avanço nos próximos anos, resultando no de-
patógenos que ao longo dos anos desenvolve- senvolvimento de novos reagentes para a profi-
ram resistência múltipla a drogas, agravando, laxia de doenças infectocontagiosas (Cum-
em muito, o quadro clínico e podendo levar o mings & Relman 2000). O avanço nessa área
paciente infectado a óbito. O caso da malária é tem sido tão vigoroso que podemos prever que
típico, onde cepas de P. falciparum resistentes à em curto espaço terá disponível no mercado
cloroquina resultam em um grave problema de biochips que permitirão detectar a propensão
saúde pública. Grave também é o problema das de um indivíduo em adquirir certas patologias.
infecções hospitalares por cepas de bactérias
resistentes à meticilina.
Considerações finais

Microarranjos de alta densidade: Os avanços recentes da biologia molecular, da


chips de DNA mesma forma que permitem que se ataque de
maneira mais racional a compreensão e o tra-
O avanço recente da genômica estrutural, le- tamento de diversas patologias, podendo ser de
vando à determinação da seqüência dos genes grande aplicabilidade no estudo das grandes
de vários organismos, permitiu o acúmulo de endemias, podem contribuir para aumentar
uma enormidade de dados, havendo a necessi- ainda mais as desigualdades entre as nações de-
dade de se compreender a funcionalidade dos senvolvidas e o resto do planeta. Uma nova re-
genes estocados nos bancos de dados. Atual- volução está em seu início: a revolução da ge-
mente estão sendo desenvolvidas estratégias nômica. Se houver uma política continuada de
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apoio ao desenvolvimento científico e à forma- do Estado, nos tempos modernos, ciência e tec-
ção de recursos humanos é muito provável que nologia devem ser somadas a esse binômio. É
as nações menos desenvolvidas possam não só nossa responsabilidade apresentar soluções pa-
acompanhar, de maneira competitiva, os avan- ra os problemas de saúde que afligem a maior
ços das nações economicamente desenvolvidas, parte de nossa população e, assim, contribuir
mas resolver seus próprios problemas sem a para diminuir as enormes diferenças sociais da
necessidade de pagar ônus exorbitantes à in- nação. É preciso criar programas voltados para
dústria farmacêutica internacional. Ao longo o estudo de nossos grandes problemas de saú-
do último século tivemos a revolução indus- de. A universidade brasileira e a comunidade
trial, a revolução atômica e a revolução da in- científica como um todo estão, no momento,
formática. A revolução da biotecnologia ainda ociosas frente ao seu potencial, quadro que só
está em seus primórdios e através dela podere- será revertido mediante uma política de valori-
mos dar um grande passo para resolvermos os zação dos recursos humanos e de fomento con-
problemas de saúde e alimentação da popula- tinuado e consistente à atividade de pesquisa
ção brasileira. Se saúde e educação são deveres científica e tecnológica.

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