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LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

INTRODUCCION
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica relativamente simple
por la cual un molde de DNA es amplificado muchos miles y millones de veces rápida
y confiablemente, generando suficiente material para el subsecuente análisis
experimental. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un método in vitro
para sintetizar y amplificar enzimáticamente secuencias definidas de DNA.
Los componentes de la PCR son: la muestra de DNA molde, una DNA polimerasa
termoestable, dos primers fiorward y reverse, desoxinucleotidos trifosfatados
(dNTPs), buffer de reacción y magnesio. Los componentes de la reacción son
mezclados y la reacción se lleva a cabo en un termociclador el cual es un instrumento
automatizado que lleva a cabo la reacción a través de una serie de diferentes
temperaturas con variaciones de tiempo.
Los pasos básicos de cada ciclo son:
- desnaturalización del DNA molde por calentamiento a 95 °C por 1 min. En el
proceso de la desnaturalización las dos cadenas de DNA se desenrrollan y se
separan una de otra produciendo el molde necesario de DNA de cadena
simple para la polimerasa termoestable.
- Annealing (alineación) En esta etapa del ciclo se reduce la temperatura a
aproximadamente 40-60 °C. A esta temperatura los primers oligonucleotidos
pueden formar asociaciones estables con las cadenas de DNA molde
separado y sirven como primers para la síntesis de DNA por una polimerasa
termoestable. Este paso dura aproximadamente 1 min.
- Extensión, la síntesis de una nueva cadena de DNA comienza cuando la
temperatura de reacción se incrementa a la óptima para la polimerasa
termoestable. Para muchas polimerasas termoestables esta temperatura es
aproximadamente 72 °C. La extensión de primers por la polimerasa
termoestable requiere aproximadamente de 1-2 min. Este paso completa un
ciclo y el siguiente ciclo comienza con el retorno a 95 °C para la
desnaturalización.
- OBJETIVOS: Amplificar por PCR el gen RNA ribosomal 16S de bacterias y verificar
el producto de la amplificación mediante electroforesis en agarosa.
- METODOS Y MATERIALES:
 Materiales:
o platinum supermix
o primers
o DNA molde (50ng/ul)
o Agarosa
o Loading buffer.
o Tubos de PCR
o Termociclador

Agarosa
termociclador

Tubo de
ependor
Metodos:
Preparar la mezcla de reacción para PCR como se indica a continuación:
*Platimun super mix 2x 25ul
1 ul (por cada primer)
*Primers
1ul
*DNA molde
*Agua desionizada 22ul

La mezcla de los componentes de la reacción de PCR debe realizarse en tubos

eppendorfs de 200ul y a bajas temperaturas (0-4 °C).
Realizar la programación del termociclador, después de un paso inicial de
Activación a 95 °C por 1 min. programar las siguientes temperaturas para 30 ciclos:
•paso de desnaturalización 95 °C 1min *Faso
de alineación 50 °C 1min.
*Paso de extensión 72 °C 1 min 30 seg

Finalmente 1 ciclo a 72 °C por 5 minutos. Luego de la amplificación las muestras

fueron mantenidas en el termociclador a 4C (post incubación).
Análisis de los productos de PCR.
Analizar 10-15ul de cada producto de PCR atreves de una electroforesis en geles
de agarosa al 1%.
Las muestras de PCR pueden ser guardadas al menos una semana a "4 °C y al
menos un mes "20 °C.
1. Añadir 2ul de Añadir 20ul de
primer supermix

2. Añadir 16 ul de colocarlo en el
agua pura termociclador y
activarlo
CONCLUSIONES

La PCR es una técnica simple muy útil para la amplificación de ADN en un tiempo corto,
por su especificidad se logra amplificar solo la secuencia que deseamos y por su
sensibilidad genera una cierta cantidad de copias por ciclo.
Es muy importante para el desarrollo de medicamentos específicos para un
determinado gen, gracias al diagnóstico molecular temprano que logra los pacientes
tendrán más posibilidades de empezar un tratamiento, por ejemplo en el cáncer
(marcadores tumorales).

CUESTIONARIO
. ¿Cuáles son los principales pasos que implica la reacción en cadena de la
polimerasa y en que consiste cada uno?
Desnaturalización: En el proceso de la desnaturalización las dos cadenas de DNA se
desenrrollan y se separan una de otra produciendo el molde necesario de DNA de
cadena simple para la polimerasa termoestable.
Anilamiento: Los primers oligonucleotidos pueden formar asociaciones estables con las
cadenas de DNA molde separado y sirven como primers para la síntesis de DNA por una
polimerasa termoestable.
Elongación: La síntesis de una nueva cadena de DNA comienza cuando la temperatura
de reacción se incrementa a la óptima para la polimerasa termoestable.
. ¿Cuáles son los principales factores que afectan la reacción en cadena de la
polimerasa?
ADN, nucleótidos, primers y temperatura
. ¿Qué criterios hay que tener en cuenta para el diseño de primers?
Elegir minimo 12 nucleotidos, que almenos 50 sean guanina y citocina
. Los primer utilizados en la practica son:
F: AGAGTTTGATCATGGCTCAG

R: GTTACCTTGTTACGACTT

Imprima la secuencia del gen RNAr16S y resalte la secuencia de los primer F y R,

cual seria el tamaño del amplicon?
. El ARNr 16S presenta características que la hacen la macromolécula más
utilizada actualmente para identificar microorganismos (Clarridge, 2004). Las
principales características son: