GENÉTICA - 1º MEDICINA

Práctica 1 y 2

DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA
ANEMIA FALCIFORME

Profesor: José R. Blesa

2  DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME  Laboratorio
Objetivos
 Comprender cómo la electroforesis separa
moléculas de ADN.
 Estudiar las causas y la herencia de la anemia
falciforme.
 Simular un procedimiento de test genético
para determinar los genotipos de varios
miembros de una familia para el rasgo de la
anemia falciforme.
 Discutir las fortalezas y debilidades del test
genético de ADN.
Introducción
La anemia falciforme es una patología sanguínea
hereditaria que afecta a los glóbulos rojos. Las
moléculas de hemoglobina de cada glóbulo rojo
transportan oxígeno desde los pulmones al resto
de los órganos y tejidos del cuerpo y traen de
vuelta dióxido de carbono a los pulmones. En la
anemia falciforme, la hemoglobina es
defectuosa. Después de que las moléculas de
hemoglobina entreguen su oxígeno, algunas de
ellas pueden agruparse en estructuras largas
tipo bastón. Estas estructuras hacen que los
glóbulos rojos se endurezcan y adquieren forma
de hoz (falciforme). A diferencia de los glóbulos
rojos normales, que generalmente son lisos y
tienen forma de “donuts”, los glóbulos rojos
falciformes no pueden deslizarse a través de los
pequeños vasos sanguíneos. Al contrario, se
apilan y causan obstrucciones que deprivan a los
órganos y tejidos de la sangre transportadora de
oxígeno. Este proceso origina episodios
periódicos de dolor y finalmente puede dañar
los tejidos y órganos vitales y derivar en otros
serios problemas médicos.
A diferencia de los glóbulos rojos normales, que
viven unos 120 días en la corriente sanguínea,
los glóbulos rojos falciformes mueren después
de sólo unos 10 a 20 días. Como no pueden
reponerse con rapidez, la sangre tiene
insuficiencia permanente de glóbulos rojos
generando la enfermedad conocida como
anemia. La anemia falciforme está causada por
un error en el gen que le dice al organismo cómo
fabricar hemoglobina. Un cambio en este gen de
una única base nucleotídica da lugar a un
cambio de un aminoácido en la hemoglobina. El
gen defectuoso le dice al organismo que fabrique
la hemoglobina anormal que da como resultado
glóbulos rojos deformes. Bajo determinadas
condiciones, la estructura de la hemoglobina
anormal cambia y se hace más alargada, lo que
deforma los glóbulos rojos y les imposibilita
captar oxígeno. Para que un individuo
manifieste la enfermedad, se necesitan dos
copias defectuosas del gen. Los niños que
heredan sólo el gen defectuoso de uno de sus
padres no manifestaran la enfermedad, pero son
portadores del rasgo de célula falciforme. Estos
individuos, aunque no tienen síntomas, pueden
pasar el gen defectuoso de la hemoglobina a sus
hijos. Si cada padre porta una copia del gen
defectuoso (S) y otra del gen normal (A), con
cada hijo de esta pareja, hay un 25% de
posibilidades de que de que el niño herede las
dos copias defectuosas y desarrolle la
enfermedad, un 25% de posibilidades de
heredar dos genes normales y no desarrollar la
enfermedad, y un 50% de posibilidades de ser
un portador sano, como sus padres.
Se cree que este defecto en el gen de la
hemoglobina se produjo hace muchos miles de
años, en personas de varias partes de África, la
cuenca del Mediterráneo, el Oriente Medio y la
India, como mecanismo de defensa frente a la
malaria. Los estudios muestran que en zonas
geográficas donde la malaria era realmente un
problema, los niños que portaban glóbulos rojos
falciformes tenían una ventaja de supervivencia
frente a los niños que tenían los glóbulos rojos
normales.
Para detectar la mutación que causa la anemia
facilforme, el ADN de un paciente se digiere con
la enzima de restricción MstII. Esta enzima
reconoce una secuencia específica en el ADN en
sitios cercanos al gen de la hemoglobina.
Cuando un gen normal BA y un gen defectuoso
BS son cortados con MstII, se generan dos
fragmentos de tamaños diferentes. Estos
fragmentos de ADN se separan mediante una
electroforesis y después se someten a “Sourthern
Blotting”, donde un marcador específico o sonda
diseñado para unirse específicamente a los
fragmentos es utilizado para identificarlos.
Laboratorio  DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME  3
A continuación se muestra la secuencia de
nucleótidos del codón 5-7 en el gen de la
hemoglobina (célula normal y falciforme), junto
con los correspondientes aminoácidos. También
se muestran los diferentes fragmentos en
tamaño producidos con la enzima MstII a partir
del gen normal y el de células falciformes.
El siguiente autorradiograma muestra los
fragmentos de ADN resultantes de la digestión
de un ADN normal, genotipo A/A; un
individuo con el rasgo de célula falciforme,
genotipo A/S; y un individuo con anemia
falciforme, genotipo S/S.
Caso
Una pareja joven está esperando su segundo
hijo. Saben que el rasgo de anemia falciforme
está presente en ambas familias. Aunque ni
ellos, ni su hija Ann de 5 años, tienen ningún
síntoma de la enfermedad, quieren saber si el
niño que están esperando podría estar afectado.
 
Para ello deciden someterse a un test genético
para saber si ellos son portadores y para conocer
el estado del niño no nacido.
Se os facilitan muestras de ADN de los
miembros de la familia. Vuestra tarea es llevar a
cabo la electroforesis de las muestras para
determinar el genotipo de cada individuo.
En esta práctica se someterá a electroforesis
ADN no humano para mostrar los fragmentos
obtenidos por digestión del gen BA y BS con la
endonucleasa MstII. El resultado del gel
representará los fragmentos de ADN hibridados
que se mostrarían en un autorradiograma al
final del procedimiento de Southern Blotting, y
que servirá para determinar el genotipo de cada
miembro de la familia de este caso.
METODOLOGÍA - Electroforesis
Durante la electroforesis, fragmentos
moleculares migran a través de agarosa, una
sustancia gelatinosa derivada de algas marinas,
cuando se exponen a una corriente eléctrica. Los
geles de agarosa sirven como un “puente
eléctrico” ente dos electrodos sumergidos en una
solución conductora.
Los fragmentos largos tienen una mayor
dificultad para atravesar los poros de la agarosa
que los fragmentos más pequeños, por lo tanto
tardan más en recorrer el gel.
En este experimento se utilizará la electroforesis
para separar muestras de colorantes. La
documentación adjunta sobre el
“procedimiento” y las “actividades del
estudiante” ayudarán a clarificar este proceso.
4    DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME  actividades

Molde o soporte del gel

Peine
Materiales

Por cada grupo

 Muestras de ADN (las proporcionará el
profesor en el momento de cargar la
electroforesis):
 Madre
 Padre
 Hija
 No nacido
Fundición del gel
 Micropipeta 20 l
 Puntas de micropipetas
 Guantes
Materiales comunes
 Cubeta de electroforesis
 Soporte para preparar el gel de agarosa
 Peines
 Agarosa
 Tampón TBE 1X
 Microondas
 Balanza
 Vaso de precipitados

Precauciones

o Seguir estrictamente las instrucciones

para el manejo de las micropipetas, ya
sean conocidas de una práctica anterior
o las explique en el momento el
profesor.

o La fuente de alimentación utilizada

para la electroforesis produce un
voltaje suficiente para causar una seria
Carga de muestras
descarga eléctrica si se maneja
inapropiadamente.

o Asegurarse de que todos los

componentes eléctricos están secos
antes de la carrera.

Electroforesis

 
actividades  DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME  5 
 

Procedimiento

1. El profesor preparará la agarosa disolviéndola en TBE 1X por calor, hasta casi

ebullición, en el microondas. Antes de verterla sobre el soporte del gel con el
peine apropiado se deja enfriar por debajo de 50ºC. Una vez en el soporte se
espera a que solidifique por enfriamiento durante 15-20 minutos.

2. Colocarse los guantes. Las muestras de ADN las proporcionará el profesor en

el momento de cargar la electroforesis. El equipo de electroforesis es común a
todos.

3. Se retira el peine del gel solidificado y se procede a cargar 10 l de cada

muestra en sus correspondientes pocillos.

4. Conectar la fuente y empezar la carrera electroforética, 100V. Observar las

burbujas que aparecen en los electrodos de platino.

5. Dejar migrar el gel durante 20-30 minutos.

6. Cuando los colorantes llegan a 2 cm de los extremos del gel, desconectar la

fuente de alimentación. Levantar la tapa de la cubeta de electroforesis y
desconectarla de la toma de red.

7. Retirar el gel de la cubeta con su soporte y verter el gel en una cubeta de

plástico para teñirlo.

8. Teñir el gel sumergiéndolo en el colorante Neo/BLUE durante 5-10 minutos.

Desteñir el gel con agua caliente durante 10-15 minutos o hasta que decolore
lo suficiente y las bandas sean claramente visibles.

9. Retirar el gel y observar los resultados en el transiluminador. Cumplimentar

la hoja de “actividades”.

10. Limpiar el banco de trabajo. Desechar las puntas de micropipeta.

11. Lavarse las manos antes de salir del laboratorio.

12. Entregar el dossier cumplimentado al profesor.