Estructura y función
Lacasas, son típicamente enzimas
extracelulares monoméricas que contienen
cuatro átomos de cobre unidos a 3 sitios
redox (T1, T2 y T3). El denominado "cobre
azul" en el sitio T1, debido a su color azul
verdoso en su estado de reposo oxidado, es
responsable de la oxidación del sustrato
reductor. El grupo trinuclear (contiene un
Cu T2 y dos Cu T3) y es el lugar donde el
oxígeno molecular se reduce a agua.
Las lacasas catalizan la oxidación del
sustrato de un electrón acoplada a la
reducción de cuatro electrones de O2. Se
supone que las lacasas funcionan como una
batería, almacenando electrones de las
cuatro reacciones de oxidación individuales
de cuatro moléculas de sustrato, con el fin
de reducir el oxígeno molecular a dos
moléculas de agua.
Normalmente, estas enzimas se presentan
como glicoproteínas con una masa
molecular media de 60-70 kDa, y
contenidos de carbohidratos de 10-20% que
pueden contribuir a la alta estabilidad de las
mismas. El resto carbohidrato unido
covalentemente de la enzima se forma
típicamente por manosa, N-
acetilglucosamina y galactosa. La cadena de
aminoácidos contiene aproximadamente
520-550 aminoácidos incluyendo un
péptido de secreción N-terminal.
(Engineering and Applications of fungal
laccases for organic synthesis)
Fuentes de obtención
Laccase se distribuyen extensamente a
través de los diversos reinos de la vida
(Monera, hongos, Protista, plantae y
Animalia). Laccases se descubrieron por
primera vez en los exudados del árbol de
laca japonesa (Rhus vernicifera) .38 Desde
entonces, la actividad de la lacasa se ha
detectado en muchas otras especies
vegetales como Pinus taeda (pino), Acer
pseudoplatanus (arce), Nicotiana tabacum
(tabacco), Populus trichocarpa (Álamo) y
Lolium perenne (centeno). Los estudios
sobre la diversidad y expresión de la lacasa
vegetal son limitados, pero se han hecho
esfuerzos para comprender el papel
biológico de estas enzimas en las plantas.
Los datos recogidos sobre el papel de las
lacasas en las plantas no son concluyentes
con respecto a su supuesto papel en la
síntesis de lignina, la herida
Cicatrización y oxidación del hierro.39
También se han detectado y estudiado
Laccases en el reino animal. La evidencia
científica sugiere que la actividad de la
lacasa se requiere en la esclerización y
pigmentación, cicatrización de heridas y
respuesta patógena de los exoesqueletos o
cutículas, cápsulas de huevo, etc. de
insectos y otros invertebrados. Algunos
ejemplos de insectos en los que se han
detectado lacas son Drosophila virilis,
Calliphora vomitoria, Tribolium
castaneum, Beybyx mori, Spodoptera
littoralis, Lucilia cuprina, Anopheles
gambiae y Manduca Sexta (tabaco
hornworm). También se ha detectado
actividad similar a la lacasa en camarones
rosados de aguas profundas (Parapenaeus
longirostris).
Aunque las plantas y los invertebrados
representan un vasto potencial para
descubrir las lacasas con gran potencial, los
estudios sobre estas enzimas se han
centrado principalmente en las relaciones
evolutivas, la diversidad y la función en su
entorno natural, y no con el objetivo de
ningún desarrollo biotecnológico en
particular.
Aparte de las especies de hongos
productoras de lacasa (basidiomicetos) ya
mencionadas anteriormente, las hongos
inferiores tales como Zygomycetes.
Se ha informado que los quitridicomicetos
producen cantidades relativamente grandes
de lacasa.
La literatura sobre la producción de laccas
en ascomicetos es abundante. Estas enzimas
se han purificado y caracterizado a partir de
ascomicetos patógenos, incluyendo
Gaeumannomyces graminis, Magnaporthe
grisea, Ophiostoma novo-ulmi y excelentes características bioquímicas bajo
Melanocarpus albomyces. Otros
ascomicetos productores de lacasa bien
estudiados incluyen las especies no
patógenas de los géneros Aspergillus,
Curvularia, Penicillium, Trichoderma y
Bothryosphaeria. Laccases se han estudiado
en líquenes y ascomycetes liquenizados de
los géneros Solorina, Peltigera, Lobaria,
Collema, Nephroma, Psuedocyphellaria y
Sticta. Los estudios han demostrado que las
laccasas purificadas y caracterizadas a
partir de líquenes presentan la típica lacasa
fúngica bioquímica
Comportamiento (perfil de pH y
temperatura, pesos moleculares y
estabilidades térmicas).
Además, las lacasas amarillas o blancas
(carentes del color azul característico
Del tipo 1 Cu) se han detectado en algunos
liquenes. Los papeles de la lacasa en la
biología del liquen no han sido
completamente descifrados, sin embargo
los expertos sospechan que están
relacionados con la descomposición de
compuestos orgánicos en el humus durante
la formación primaria del suelo. Aunque
estos organismos pueden producir lacasas
con atractivas propiedades bioquímicas, su
potencial ha sido escasamente explotado
para posibles aplicaciones industriales.
Después de las lacasas fúngicas, las
especies bacterianas son la segunda
alternativa más popular para obtener
laccases. El Bacillus es el género de lacasa
más comúnmente reportado, sin embargo,
se ha reportado actividad de lacasa en
Psuedomonas, Xanthomonas,
Azospirillum, Aquifex, etc. Las laccasas
bacterianas tienen varias ventajas sobre las
lacasas fúngicas, ya que generalmente están
aisladas de extremófilos, presentando
condiciones extremas. Se ha descubierto
que estas enzimas son activas en
condiciones alcalinas en contraste con la
lacasa fúngica, presentan alta resistencia a
altas concentraciones de sales, temperaturas
y alta estabilidad al almacenamiento
(Upgrading laccase production and
biochemical properties: Strategies and
challenges).
Sustratos utilizados pelas lacases.
Las lacases, tienen la habilidad de oxidar
una amplia gama de sustratos, incluyendo
polifenoles, fenoles metoxi-sustituidos,
anilinas, diaminas y otros. En particular,
cualquier sustrato que tenga una estructura
de p - difenol podría potencialmente ser
oxidado por lacasa (Kudanga et al., 2011).
En presencia de oxígeno, el sustrato se
oxida mediante una reacción de
transferencia de un electrón, mientras que el
agua se reduce (Figura 3). Como resultado,
se generan radicales inestables pero
reactivos que reaccionan de forma no
enzimática adicionalmente para inducir
reticulación de monómeros, degradación de Parámetros cinéticos
polímeros o escisión de anillos aromáticos La determinación de los parámetros
cinéticos en la actividad enzimática donde
la velocidad de acción de una enzima es
función de la cantidad de sustrato presente,
de enzima así como las características de la
misma. El Km es un coeficiente del sistema,
el cual permite conocer la afinidad que
presenta la enzima por el sustrato, y sus
valores son inversamente relacionados a la
Condiciones de trabajo
afinidad por el sustrato y generalmente son
Una óptima actuación por parte de las muy bajos. La Vmáx estima el número de
enzimas va a depender de las condiciones de centros activos de la enzima, es decir, la
trabajo utilizadas, tales como, temperatura, velocidad alcanzada cuando esta se une al
pH, concentración de sustrato y tiempo.
sustrato.
Así, las lacasas presentan estabilidad en su
actividad en un rango de temperatura entre Los valores de Km y Vmáx para las lacasas
50-70 °C. Estudio hecho por Liers et. Al presentan diferencias, atribuídas
(2007) evidenciaron la mayor actividad
principalmente a las alteraciones
enzimática de lacasas entre 55 y 60 °C. Otro
estudio mostró una actuación estable de encontradas en las condiciones de trabajo
estas enzimas en rangos de temperaturas de utilizadas, tales como, preparación de los
65 – 75°C (Characterization and kinetic medios de cultivo, pH y sustrato utilizado.
properties of the purified Trematosphaeria De esta forma, Robles et al. (2002)
mangrovei laccase enzyme) reportaron un valor de Km de 0,77 mM para
una lacasa obtenida de Chalara (syn.
Thielaviopsis) paradoxa CH 32, usando
ABTS como sustrato y pH de 4,5. Por otro
lado, lacasas aisladas de Ceriporiopsis
subvermispora usando guaiacol como
sustrato y pH 3,5 presentaron un valor para
Km de 1,6 mM y Atalla et al. (2013)
determinaron una Km de 1,42 mM y una
Vmáx de 184,84 U/mg proteína, para
lacasas purificadas de Trematosphaeria
mangrovei (Characterization and kinetic
properties of the purified
Trematosphaeria mangrovei laccase
enzyme).