c




 c c   
   

 !!"#
En Microbiología, se entiende por esterilidad la ausencia total de microorganismos vivos, es decir,
la destrucción o eliminación de toda forma de vida de un medio o material, incluida las endosporas
bacterianas. La muerte de los microorganismos sometidos al efecto del calor húmedo, sigue un
orden logarítmico, teóricamente los supervivientes pueden reducirse a un número inferior a la
unidad, mientras que ciertas fracciones resisten durante todo el periodo de exposición térmica, de
esto se desprende que aunque en teoría la esterilidad total no se alcanzará jamás, los
microorganismos sobrevivientes estarán de tal manera afectados que para fines prácticos dejarán
de existir, es decir, no podrían causar daño. Un microorganismo está vivo desde el punto de vista
microbiológico cuando es capaz de multiplicarse, por consiguiente, un microorganismo muere
cuando pierde de forma irreversible la capacidad de reproducirse.
La esterilización comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que se
emplean parap destruir, inactivar o retener gérmenes en general y patógenos en particular. La
condición fundamental que deben observar los materiales previos a la desinfección y a la
esterilización es la limpieza, que consecuentemente producirá la eliminación de la suciedad y la
disminución de la carga microbiana inicial. El lavado se hará utilizando agentes neutros de
limpieza, cepillo de cerdas blandas, agua a temperatura entre 40-50ºC, perfectamente con el
elemento sumergido. Es Muy importante realizar el secado de material inmediatamente después
del enjuagado para evitar la contaminación posterior y deterioro del material. El secado manual se
hace utilizando paños de tela muy absorbente o de fibra celulosa, limpios únicamente destinados
para este fin, pudiendo también utilizarse aire caliente.
Antes de iniciar el empacado del material que se desea esterilizar, es necesario en primer lugar,
limpiar el área de trabajo con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. Se emplean
distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol,
formaldehído, benzal, entre otros) para desinfectar superficies. El material a esterilizar se deberá
de empacar correctamente con papel estraza a fin de impedir el ingreso de microorganismos al
interior, sellar en forma completa para evitar contaminación, soportar la tracción y manipulación
habitual sin sufrir deterioro y hacer permeable al método de esterilización seleccionado.pEl método
más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones
porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede
aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo. El material que se va a esterilizar debe
prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: El material de
vidrio, como tubos, matraces, frascos, tubos de cultivo, tubos de ensayo, entre otros, se cierran con
algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos.
Además, cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. En el caso
de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la
contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine
la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven
individualmente en papel estraza para ser posteriormente esterilizadas.
Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur o estufa
de aire caliente, en tanto que el material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para
su uso, por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se
esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. Las soluciones y medios de cultivo líquidos se
envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios métodos
para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de un determinado método viene
condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar.
Calor seco:
a

: El flameado se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, entre
otros. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero los utensilios que
se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede
aplicar a objetos termolábiles.
Esteriliz
 p
p
p
 : Este tipo de esterilización se lleva a cabo en estufas de aire caliente
y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se
contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para
esterilizar material de vidrio como pipetas, matraces, tubos, cajas Petri u otros materiales
termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas
(160-180ºC durante 2 horas), estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos
(como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían
hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión
atmosférica y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas.
Pero incluso en muestras en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología
puede implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la fuerte
evaporación sufrida.
Calor húmedo
El calor húmedo también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como ya se
ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este tratamiento las
enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares. Además, el vapor
de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor de calor al interior de
la célula microbiana. El calor húmedo se puede aplicar utilizando los métodos de ebullición, vapor
fluente y vapor saturado a presión.
  : El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a
destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden
sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño María o baño de agua
hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la
esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras,
escalpelos, entre otros) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.


p   p  

 p p  
 p 


: Esta técnica se emplea con frecuencia
para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC
sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, entre otros. Se utiliza la
autoclave a presión atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se
realiza el proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los
intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante 30-45
minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas
termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del
calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos.


p

p
p
 : El calor húmedo es más rápido, penetrante y efectivo que el calor seco,
la esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmósfera
extra de presión sobre la presión atmosférica normal, elevándose con ello el punto de ebullición
del agua de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo
los termófilos extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria
para la destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y
que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde
por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno
que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica de esterilización requiere el
uso de la autoclave.
La autoclave permite elevar la presión una o dos atmósferas sobre la presión atmosférica,
elevándose con ello la temperatura de ebullición del agua que se encuentra en su interior. Consta
de un recipiente metálico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo
interior se introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada.
áespués de cerrar cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la
temperatura en su interior. La salida continua del chorro de vapor a través de la válvula indica que
el aire contenido en el interior de la autoclave ha sido eliminado. La eliminación de este aire es
importante ya que la difusión del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se
alcanzará la temperatura esperada a la presión elegida y no se conseguirá la esterilización. La
válvula se cierra cuando sólo sale vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse
la presión hasta una atmósfera sobre la presión normal, elevándose como consecuencia la
temperatura hasta 121ºC. Transcurridos 15-20 minutos, en estas condiciones, el material se ha
esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima de los 100ºC y no la presión la que
destruye los microorganismos. Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos, es necesario
mantener el material en la autoclave durante períodos de tiempo más prolongados, pues se tarda
más en alcanzar los 121ºC en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo
necesario, se apaga la autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador
marque menos de 80ºC, que será cuando la presión haya descendido hasta presión atmosférica.
Se abre ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a presión en el interior y ya se
puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejándolo enfriar a temperatura ambiente. La
autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, soluciones, jeringas, entre
otros, que puedan soportar altas temperaturas y una atmósfera de sobrepresión.
Para la esterilización de materiales líquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,
soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, entre otros, o también para gases, se utiliza la
filtración. En la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que
la filtración los retira de una forma mecánica, en lugar de destruirlos. La filtración es el paso de un
líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeños como para
retener células microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los
denominados filtros de membrana y están integrados por pequeñas piezas de material sintético,
generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaños de 0,22 y
0,45 µm, diseñados para retener bacterias. La acción combinada de los poros, la trama del filtro y
la naturaleza química del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los
fluidos que se van a filtrar pasan a través de la membrana con la ayuda del vacío generado, por
ejemplo, con una bomba de vacío. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtración con
los que éstos se usan deben ser esterilizados por otros métodos, generalmente vapor saturado a
presión en el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo,
los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

$%&"'(
Identificar el material utilizado en el laboratorio de Microbiología, conocer la importancia de la
esterilización y familiarizarse con el manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados
para llevarla a cabo además, poner de manifiesto la necesidad de trabajar en estricta esterilidad en
microbiología debido a la gran facilidad con que se puede contaminar el material de trabajo y
coordinar la operativa de trabajo en el laboratorio y las normas de seguridad.

) "*+,-&"-.
â Campana de flujo laminar
â Horno Pasteur o estufa de aire caliente
â Incubadora con termómetro
â Refrigerador
â Balanza analítica
â Baño María
â Autoclave u olla de presión
â Mecheros Fisher
â Cronómetro
â Espátulas
â Asas de siembra
â Varillas de vidrio para siembra (Espátula de árigalsky)
â Pipetas graduadas de 1 ml, de 5 ml y de 10 ml
â Probeta de 100 ml
â Cajas Petri de vidrio
â Cajas Petri de plástico
â Tubos de cultivo
â Pipetas Pasteur
â Gasa
â Papel estraza
â Algodón
â Papel metálico 
â Guantes de asbesto
â Guantes de latex estériles
â Cubreboca
â Marcadores indelebles
â Cinta masking con indicador de esterilidad
â Piseta con agua destilada
â Xilol
â Extran (2%, 5%, 20%)
â Alkox (3% y 16%)
â Alcohol de 96º

 -,&
El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación de sus constituyentes
químicos, desnaturalizando las proteínas y fragmentando sus membranas celulares, todo ello
mediante temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a
temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno
responsables de la estructura terciaria de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y
pierdan por tanto su funcionalidad.pp

&./0-
El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología,
enfatizando en los aspectos de desinfección de superficies de trabajo, preparación y esterilización
de materiales necesarios para la manipulación de microorganismos.

",*"&1-+&,*-!-&,-&"-.-&(&"."1-
â Lavar el material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente. Enjuagar con
abundante agua de grifo y posteriormente con agua destilada.
â Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado, o bien introducirlo
por 30 minutos en la estufa de aire caliente.
â Empacar el material correctamente como sigue:
j Cajas de Petri: Tomar una hoja tamaño oficio de papel estraza, colocar una caja en
la parte central y envolverla según indique el (la) profesor (a). Se toman los
extremos del papel y se unen, se hace un nuevo doblez recargando ligeramente
en la caja para marcarlo, los extremos se doblan en forma triangular y se doblan
hacia atrás, colocando un pequeño trozo de cinta indicadora de esterilidad.
j Pipetas: Introducir una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta,
procurando que quede lo suficientemente apretada. Envolverlas con tiras de papel
estraza de 3 cm de ancho, comenzando por la punta y en forma de espiral girar
hacia arriba hasta el final de la pipeta o viceversa. Se cierra con un trozo de cinta
indicadora de esterilidad.
 j Tubos de ensayo: Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapón
de algodón. Coloca algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del
mismo procurando que quede bien apretado, depositarlos en vasos de precipitado
grandes, tapar el vaso con papel metálico.
j Matraces: Tapar el cuello del matraz con algodón cubierto con gasa, lo
suficientemente apretado para evitar que se destape y se coloca un gorrito de
papel metálico o bien, papel estraza atado con cinta indicadora de esterilidad.
j Varillas acodadas: no es necesario empacarlas para su esterilización, ya que al
momento de utilizarlas se cuenta con un vaso de precipitado con agua destilada
para enjuagarlas y otro vaso con alcohol de 96º para esterilizarlas.
X (&"."1-!"#*!-.(&!
â El material a esterilizar (pipetas, cajas Petri, tubos de cultivo, entre otros), debe estar
completamente limpio, enjuagado con agua destilada y empacado correctamente.
â Tanto las pipetas como las placas Petri se empacan con papel estraza, siguiendo las
instrucciones del profesor.
â El material a esterilizar se deberá cargar con la estufa de aire caliente sin conectar, es
decir, a temperatura ambiente, teniendo en cuenta las siguientes recomendaciones: Cada
unidad deberá quedar separada de las vecinas, los materiales a esterilizar no deberán
estar en contacto con las paredes, piso y techo del horno, la carga del esterilizador será
homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad total del horno o estufa.
â Colocar el material dentro de la estufa y encenderla; verificar que los instrumentos de
control de ciclo, tiempo (2 horas) y temperatura (160ºC) se encuentren en la posición
correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medición alcancen la temperatura
seleccionada para el ciclo.
â Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzará a contar el tiempo de
esterilización. Cumplido el tiempo de exposición se apagará la estufa. La descarga de la
estufa se efectuará una vez que el material se haya enfriado.
â áurante el ciclo de esterilización no deberá abrirse la puerta de la estufa porque ello
implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso reiniciarlo.
 (&"."1-!"#*!-.23,&
â Contar con el material a esterilizar lavado, secado y empacado para su esterilización.
â Colocar el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca; colocar el
material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presión, evitando que el material
toque las paredes.
â Cerrar la autoclave u olla de presión, dejando abierta la válvula de salida de vapor que
ayudará a expulsar el aire contenido dentro y que éste es desplazado por el vapor que se
produce. Si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el manómetro aumentará a
15 libras, pero la temperatura no habrá alcanzado los 12lºC.
â Cerrar la válvula cuando el vapor sea continuo y vigilar el termómetro. Cuando la olla
alcance los 121ºC, iniciar a contar el tiempo (15-20 minutos) para que se efectúe la
esterilización Transcurrido este tiempo se corta la fuente de calor.
â áejar enfriar hasta que el manómetro marque cero y abrir la válvula de salida de vapor,
para expulsar el vapor restante. Si se abre la válvula entes de que el manómetro marque
cero, la rápida pérdida de presión hace hervir el material líquido como medios de cultivo,
agua, entre otros o bien, saltar los tapones.
â Abrir la autoclave u olla de presión y retirar el material estéril.

 -'-&,-&"-.+- "."1-
â Solución detergente de Extran alcalino para limpiar material: Preparar la solución de Extran
al 2% en agua si existe una suciedad normal, al 5% si la suciedad es muy acentuada y al
20% si la suciedad es muy persistente. Colocar el material sucio en un recipiente y dejar
reposar entre 2 y 24 horas. Si se quiere acelerar la reacción es conveniente hervir la
solución. áespués del tiempo requerido, sacar del baño, enjuagar con agua de grifo y
después con agua destilada. Secar al aire o en estufa de aire caliente.
â Solución detergente de alkox para limpiar material: Se disuelve en agua en un 3% a un l6%
según el nivel de suciedad que se debe eliminar. Sumergir el material en la solución
durante un periodo de 1 hora a 24 horas. Si se calienta de 45 a 90ºC es más eficaz.
Enjuagar con agua de grifo y finalmente con agua destilada. Secar al aire o estufa.
â Mezcla para el lavado de material de desecho: Preparar una solución con agua de grifo,
alcohol de 96 y xilol en una proporción de 1:1:1. Colocar los portaobjetos, cubreobjetos,
pipetas, tubos de ensayo, tubos de cultivo y cajas de Petri en la mezcla durante 24 horas.
Proceder a secar el material en estufa de aire caliente para después esterilizarlo.