INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO POR CONJUGACIÓN EN

Escherichia coli

GRUPO: 5QV2

SECCIÓN: 1 EQUIPO: 4

INTEGRANTES:

CHAVEZ RICO PABLO

CRUZ ZAHUANTITLA ANGEL GABRIEL

DE LA FUENTE CASTAÑEDA CLAUDIA ABRIL

FECHA DE ENTREGA: 18/10/2016

INTRODUCCIÓN:
La conjugación es el proceso por el cual el DNA se transfiere de una bacteria
donadora a una receptora por un mecanismo que involucra el contacto entre las
células.
Célula receptora (F-): Es aquella en la que el plásmido F está ausente.
El plásmido F es el factor responsable de la fertilidad en las células donadoras (F+)
y puede encontrarse en uno de tres posibles estados (figura 1):

Figura 1. Tipos de células con factor F.

Cruza F+ x F-: El factor F contiene un origen de replicación y cierto número de

genes requeridos para la conjugación (figura 2), ya que algunos de estos genes
codifican los pili sexuales (tabla 1), que son prolongaciones delgadas de la
membrana celular. Toda célula que contiene el factor F produce los pili sexuales,
que hacen contacto con un receptor de una bacteria y une las dos células.
Entonces, el DNA se transfiere desde la célula F + a la célula F-. La conjugación
sólo se produce entre una célula que posee el factor F y una bacteria que carece
de él. La transferencia se inicia cuando una de las cadenas del DNA del factor F
forma una muesca en el sitio de origen (oriT). Un extremo del DNA roto se separa
del círculo y pasa a la bacteria receptora. La replicación se produce en la cadena
rota, alrededor del plásmido circular y en reemplazo de la cadena transferida.
Dado que el plásmido de la célula F + siempre se rompe en el sitio oriT, este sitio
siempre ingresa en la bacteria receptora en primer lugar, seguido por el resto del
plásmido. Así, la transferencia de material genético tiene una dirección definida.
Una vez dentro de la bacteria receptora la cadena simple se replica y produce una
copia del plásmido F circular y bicatenario. Si el factor F completo se transfiere a la
célula receptora F-, está célula se transforma en una célula F+.

Figura 2. Regiones del plásmido F: la replicación se inicia en el sitio oriV, el sitio oriT indica el
origen de la transferencia de información genética. Las secuencias de inserción IS3 e IS2
controlan la inserción del cromosoma bacteriano y la escisión de éste.

Tabla 1. Función de los diferentes genes tra en la conjugación bacteriana.

Gen Función
traA, traB, traC, traE, traF, traG, Codifican para Biosíntesis y ensamblaje del pili F.
traH, traJ, traK, traL, traU, traV
traD Codifica para una proteína que interviene en la
conjugación.
traG, traN Estabilización de la agregación.
traM Señala el punto de corte en la cadena.
traY Corta la cadena que será transferida.
traS (membrana interna), Exclusión de la superficie.
traT (membrana externa) Limitan la capacidad de una F+ para actuar como receptora.

Cruza Hfr x F-: En las cepas Hfr (alta frecuencia de recombinación) el factor F
está integrado al cromosoma bacteriano. Las células Hfr se comportan como
células F+, forman pili sexuales y se conjugan con las células F -. En la conjugación
entre células Hfr y F-, el factor F integrado se rompe y el extremo de la cadena rota
se mueve hacia la bacteria F -. En las células Hfr, el factor F se une al cromosoma
bacteriano, de modo que el cromosoma lo sigue hasta la célula receptora. La
cantidad de cromosoma bacteriano que se transfiere depende del tiempo en el que
ambas células permanecen en la conjugación. Una vez dentro de la célula
receptora la cadena del DNA donante puede producirse un entrecruzamiento entre
la cadena y el cromosoma original de la célula F -. La célula F- casi nunca se
convierte en F+ o Hfr porque el factor F se rompe en la mitad durante el comienzo
de la transferencia de la cadena, dejando una parte de F al comienzo y otra parte
al final de la cadena que va a transferirse. Para convertirse en F+ o Hfr la célula
receptora deberecibir un factor F completo, que supone la transferencia completa
del cromosoma bacteriano. Esto sucede rara vez, porque la mayoría de las
bacterias que se conjugan se separan antes de que la transferencia del
cromosoma se haya completado.

Cruza F´ x F-: Las células que contienen un plásmido F y algunos genes

bacterianos se denominan F´. Por ejemplo, si un factor F se integra a un
cromosoma adyacente a los genes lac, el factor F puede tomar los genes lac
cuando se escinde y convertirse en F´ lac+. Durante la conjugación entre una
célula F ’lac+ y una célula F-, el plásmido F se transfiere a la célula F-, lo que
implica que cualquiera de los genes del plásmido F, incluso los provenientes del
cromosoma bacteriano, pueden transferirse a las células F“ receptoras. Este
proceso se denomina sexducción. Produce diploides parciales o merocigotas, que
son células que poseen dos copias de algunos genes, una en el cromosoma
bacteriano y otra en el plásmido F recién introducido.

Tabla 2. Resultados de las diferentes cruzas en la conjugación.

Donadora Receptora Transconjugante

F+ F- F+

Hfr F- F-

F’ F- F’ o F’’

Bacteriófago M13:
• Es un virus compuesto por una molécula de ADN monocatenario circular.
• La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un
receptor presente en la punta de los pilli del hospedador Escherichia coli.
• Las bacterias infectadas continúan vivas (ciclo no lítico); aunque su
velocidad de crecimiento decrece.
 Figura 3. Esquema del bacteriófago M13.

OBJETIVOS:
 Cuantificar la transferencia de material genético por medio de la conjugación
en bacterias Gram –
 Establecer las diferencias entre las transconjugantes que se obtienen a partir
de células donadoras Hfr y F´ y con receptoras Rec+ y Rec-.

RESULTADOS:
Tabla 3. Resultados de la cuenta viable de las diferentes cepas utilizadas.
Cepa Equipo Dilución No. De colonias Titulo (UFC/ml)
 3 10-4 10-5 2480, 1265, 1165 3.3×108
JC4046 2423
4 10-4 10-5 518, 549 47, 49 5.28×107
5 10-4 10-5 2898, 320, 128 2.13×108
1340
6 10-4 10-5 961, 930 130, 109 9.68×107
1 10-4 10-5 Inc, Inc 385, 390 3.5×108
CSH62 2 10-4 10-5 183, 298 54, 61 2.71×107
5 10-4 10-5 3520, 717, 495 3.29×108
2510
6 10-4 10-5 Inc, Inc 279, 290 2.89×108
1 10-4 10-5 1108, 212, 220 1.2×108
RC712 1103
2 10-4 10-5 840, 808 116, 106 8.5×107
4 10-4 10-5 832, 801 85, 89 8.21×107
6 10-4 10-5 Inc, Inc 259, 282 2.7×108
KL323 3 10-4 10-5 121, 150 31, 36 1.53×107
5 10-4 10-5 1928, 194, 165 2016×108
2470
6 10-4 10-5 737, 724 97, 85 7.46×107

Inc= incontables.
ND= No determinado

EJEMPLO DE CÁLCULO PARA CUENTA VIABLE

UFC 1 1
mL (
=( Núm de colonias )∗
alícuota)(
∗
dilución )
96+ 97+37+ 9
∗1
2.22
∗1
UFC 0.1
=
mL 10−4
UFC 4 7
=1.07∗10∗10 =1.07 x 10
mL
 Tabla 4. RESULTADOS DE LOS TÍTULOS BACTERIANOS PARA LAS CRUZAS
REALIZADAS EN LOS MEDIOS G8, G9 Y G10.
CEPA EQUIPO MEDIO DILUCIÓ NÚMERO DE TÍTULO
N COLONIAS (UFC/mL)
915,934 1.21x105
-0
JC4046 (F’) X G8 10 1962,1774
RC712 (F-) 5 10-1 365,385
(Rec+)
0,0
G9 10-3 0,0
0
10 0,0
10-1 0,0

G10 100
10-1
6 G8 10-1 I, I 4.82 x105
10-2 472,510
10-3 41,38 1.68 x103
100 0
G9 10-1 152,197
0,4
100
G10 10-1 0
0
JC4046 X KL23 3 G8 10-1 I,I 9.65x105
(F’ x F - Rec -) 10-2 I,I 0
10-3 88,105 0
100
G9 0,0

100
G10 0,0
-1
4 G8 10 I,I
10-2 I,I
10-3 140,138 1.4 x106
100
G9 0 0

100
G10 0 0

Tabla 5. RESULTADOS DE LOS TÍTULOS BACTERIANOS PARA LAS CRUZAS

REALIZADAS EN LOS MEDIOS G8, G9 Y G10.
 CEPA EQUIPO MEDIO DILUCIÓ NÚMERO DE TÍTULO
N COLONIAS (UFC/mL)
CSH62 X 1 G8 100 312,280 2.73 x103
RC712 10-1 3,6 2.96 x103
100 5.31 x 104
Hfr x F- Rec+ G9 10-1 306,280
10-2 50,18
10-1 1,0
10-2
G10 580,524
25,40
2 G8 100 44,40 4.2 x10 2
10-1 0,0 1.04 x104
100 6.53 x104
G9 10-1 924,1280
10-2 58,46
10-1 1,1
10-2
G10 549,770
56,63
CSH62 X KL23 3 G8 100 0,0 0

Hfr x F - Rec- G9 100 0,0 0

G10 100 0,0 0

10-1 0,0
4 G8 100 0,0 0

G9 100 0,0 0

G10 100 0,0 0

10-1 0,0
Tabla 6. Frecuencia de recombinación para los distintos marcadores a seguir en las
diferentes cruzas.
Cruza MARCA MEDIO TÍTULO DE TÍTULO DE FRECUENCIA
DOR TRANSCONJUGANTES DONADORAS DE
RECOMBINACIÓN
Hfr x F- His G8 2.73 X 10
3
1 .51 X 10−5
Rec+ Trp G9 2.96 X 106 1.8 X 107 1.6 X 10−2
Pro G10 5.3 X 10
6
2.9 X 10
−2

F`x F- His G8 9.65X105 5.08×109 1.89X10-4

Rec-
F`x F- His G8 4.82 x105 1.07 x108 4.47 x10-3
Rec+ Trp G9 1.68 x103 1.07 x108 1.56 x10-5

EJEMPLO DE CÁLCULO PARA FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN:

(Título de las donadoras)(Factor de dilución)= (5.08×108)(10) = 5.08×109

T í tulo de transconjugantes 9.65 x 105

FM= = 1.89 X 10−4
T í tulo de donadoras en la mezcla de conjugaci ó n 5.08 ×10 9

Tabla 7. Resultados de la prueba de gota en las diferentes

cepas donadoras, receptoras y cruzas utilizadas.
Equipo Cepa Resultado
1 CSH62 (Hfr) +
RC712 (Rec+) +
-
Hfr x F +
2 CSH62 (Hfr) -
RC712 (Rec+) -
-
Hfr x F -
3 JC4046 (F´) +
KL323 (Rec-) -
F´ x F- -
4 JC4046 (F´) -
KL323 (Rec-) -
-
F´ x F +
5 JC4046 -
RC712 (Rec +) -
-
F´ x F +
6 JC4046 +
RC712 (Rec +) +
F´ x F- -
DISCUSIÓN
Para realizar la cuenta viable se diluyo cada cepa a 10 -4 y 10-5 para obtener cajas
con una buena proporción de colonias aisladas que pudiéramos cuantificar, estas
diluciones se sembraron por dispersión en cajas de agar luria por duplicado, un
medio rico para que las bacterias se desarrollasen, después de la incubación se
observó el crecimiento, se contó el número de colonias observado y se calculó el
título de donadoras y receptoras, cada equipo desarrollo los cálculos de las cepas
que sembraron. Los resultados obtenidos en la cuenta viable se muestran en la
tabla 3, esta nos ayuda a ver el crecimiento normal de cada cepa de E. coli y
calcular la frecuencia de recombinación de cada una de las transconjugantes
obtenidas en el proceso de conjugación que se llevó a cabo. Como se trabajó en
las mismas condiciones y con las mismas cepas se esperaba que los resultados
fueran muy parecidos entre sí, en el título de donadoras y receptoras, lo cual no
sucedió. En la cepa donadora JC4046 F’ se observó que hay un aumento de 20
veces en el quipo 3 con respecto al equipo 4 y uno de 10 veces mayor con
respecto al 5; esto no muestra concordancia ya que la mala distribución del
espatulado, o un error en las diluciones pudo haber provocado este título mayor,
las diluciones de 10-4 presentan colonias incontables, que de una manera no
determinada provocan el aumento en las diluciones subsecuentes. Estos
aumentos de títulos ocurren nuevamente en el equipo 3 en la cepa donadora Hfr y
en el quipo 2 con la receptora RC712 F - Rec+. Estos resultados de cuenta viable,
no se pueden considerar confiables, porque hay variaciones entre cada equipo en
las cepas donadoras y la receptora RC712, en el caso de la receptora KL323 los
títulos tienen resultados muy similares y la variación no es mayor a 10 veces, por
lo tanto se pueden considerar los más confiables y que esta cepa fue cuantificada
de manera adecuada.
La selección de revertantes, fue realizada para comprobar que el genotipo de cada
cepa correspondiera al especificado. Cada medio utilizado era selectivos de
acuerdo al marcador a seguir para cada cepa receptora, el medio G8 sigue al
marcador Histidina, el G9 a la Prolina y el G10 al Triptófano y ya que además
estos medios contienen Estreptomicina y nuestras cepas donadoras son sensibles
a esta, ninguna donadora ni receptora podría desarrollarse en esos medios, si
esto ocurre posiblemente la cepa habría sufrido una mutación espontánea en
algunos de los marcadores cromosomales pudiendo sintetizar un aminoácido que
antes no pudiera y con ello crecer en uno de nuestros medios selectivos,
dependiendo en que cepa y medio creciera dependería el número de revertantes
que se observarían, para detectar esta mutación no se diluyó la muestra y se
sembró de la cepa original en los medios por dispersión en duplicado, después de
la incubación, en el caso de esta sección no se observó ninguna revertante (tabla
4) en los medios G8, G9 y G10 por lo que se omitió el proceso de cálculo de
frecuencia de reversión.
Para realizar la conjugación, cada quipo desarrollo una cruza señaladas en la
tabla 5, se agregó 0.5 ml de la donadora a 4.5 ml de la receptora, para que fuera
observable el número de transconjugantes en cada caja, se incubó una hora a
37°C esto para que se llevara a cabo el proceso de conjugación, donde el contacto
entre las células es esencial para la transferencia cromosómica (W. Klug. M.
Cummings y C. Spencer, 2006). En este tiempo permitimos que las donadoras que
poseen el plásmido F + produzcan su pili que funciona por retracción para atraer a
la célula receptora y de esta forma mantener las superficies celulares del donador
y receptor juntas, siendo en este momento cuando la transferencia de DNA puede
suceder (Curtiss, Marvin y Hohn. 1969). Se evitó el movimiento para lograr que las
bacterias se mantuvieran el mayor tiempo posible unidas y pasados los 60 minutos
la conjugación se detuvo al resuspender las células en el vortex, para observar a
las transconjugantes se realizaron diferentes diluciones, esto porque en algunos
casos para observar bien el gradiente formado es necesario una mayor dilución,
que en algunas cruzas donde sólo se observaran crecimiento en una o dos cajas,
el número de transconjugantes será menor y por lo tanto no se necesita diluir, para
poder cuantificarlas. Posteriormente se sembraron por dispersión en los medios
selectivos nuevamente por duplicado, para contar las colonias y calcular los
títulos. En la primera cruza de F’ × F- Rec+ se observa un crecimiento en gradiente,
lo cual sólo se explica con la formación de la donadora F’ a una Hfr temporal, ya
que sólo se esperaría el paso del marcador cromosomal de his+ y el crecimiento
de esta en el medio G8 que es selectivo para his+ pero se observa crecimiento en
gradiente en los otros medios, esto porque la F’ pasa a ser una Hfr temporal y al
ser la receptora una Rec+ se recombina el material genético del plásmido con el
cromosoma de la bacteria y se pueden expresar otros marcadores cromosomales,
dependiendo de la cantidad que hayan pasado de una célula a otra. En el caso del
equipo 5, el marcador de pro+ no paso y por eso se observa que en este medio no
hubo crecimiento, este fenómeno de Hfr temporal tiene una frecuencia de 10 -7 así
que es probable que haya sucedido en esta cruza. En la siguiente cruza de F’ × F -
Rec- la receptora no posee la proteínas Rec de recombinación lo cual no permite
que la haya, la bacteria donadora posee en su plásmido un marcador cromosomal
de his+, antes mencionado que permite que la transconjugante solamente se
desarrolle en el medio G8 que no posee his, al crecer solo en este medio indica
que la transconjugante adquirió el plásmido, ya que antes de adquirirlo era
auxótrofa a histidina, cuando lo adquiere es capaz de sintetizar histidina lo cual la
convierte a una célula prototrofa, en los demás medios no podía crecer ya que no
adquiría los demás marcadores de triptófano (G9) y prolina (G10). La cruza Hfr ×
F- Rec+ se observó el gradiente característico de esta donadora, el origen de la
transferencia viene determinado por el punto de integración en el cromosoma del
factor F, y la dirección de transferencia por la orientación del factor F cuando se
integra (W. Klug. M. Cummings y C. Spencer, 2006). Los títulos van disminuyendo
del medio G10 al medio G8, esto por lo antes mencionado, por el mapa genético
de E. coli y el gradiente señalado para la cepa, el primer marcador en pasar en la
transferencia es el de prolina, el medio G10 es selectivo para pro+ tiene un orden
de transferencia más temprano por lo tanto tiene un mayor crecimiento en G10, en
G9 solo se desarrollaran aquellas que hayan adquirido el marcador trp+, este se
transfiere en menos tiempo que la histidina y por lo tanto su recombinación será
mayor, por eso es que en G9 se observa mayor crecimiento que en G8. Aquellos
marcadores cromosomales próximos al origen de transferencia se transferirán
primero, al no durar el suficiente tiempo el proceso de conjugación no todos los
marcadores pasaran ni en la misma proporción por eso es que la célula
permanecerá siendo F-. En la última cruza, Hfr x F - Rec- la receptora no posee las
proteínas Rec de recombinación lo que disminuye la capacidad de la receptora de
incorporar el material genético transferido por la donadora Hfr ya que no hay quien
proteja a la cadena sencilla de DNA de las nucleasas y proteínas de exclusión, ni
la escolte al sitio de recombinación homóloga sustitutiva, por lo tanto al entrar el
DNA, este es degradado por la nucleasas, por lo que no es incorporado al
cromosoma de la donadora, y, por lo tanto, no es expresado, por lo que no se
observó crecimiento en ninguno de los medios de selección en la prueba de
transconjugantes, y si se hubiera observado, sería con menor frecuencia que la
receptora, esto podría deberse a que la presencia de la proteína Rec BCD,
también de recombinación que puede presentare en menor proporción en la
célula, a pesar de ser una donadora Rec -, esta también es capaz de llevar a cabo
la recombinación homóloga sustitutiva, sin embargo, estas proteínas como se
observó en los resultados, no estuvieron presentes, por lo que la cepa F - solo
poseía proteínas Rec A. Se realizó la prueba de gota por vaciado de las cepas
donadoras receptoras y tranconjugantes, utilizando el fago M13, siendo este un
fago filamentoso con DNA que infectan solamente células donadoras, pues
penetran tras la fijación de pelos o fimbrias sexuales y además tienen la propiedad
de liberarse de la célula sin causar la muerte de la célula hospedadora (M.
Madigan. J. Martinko y J. Parker, 2004) por lo tanto, las células Hfr y F’ y las
trasconjugantes que como resultado tuvieran alguna de estas donadoras, debieron
haber dado positivo a esta prueba y conforme a los resultados obtenidos, el
equipo 1 para la donadora CSH62 (Hfr), el equipo 3 para la donadora (F’), la
donadora JC4046 (F’) y por último, la transconjugante de la cruza de F’ x F- del
equipo 4 y 5 dieron positivo a esta prueba y correspondía los resultados
esperados.
Para terminar se realizó el cálculo de la frecuencia de recombinación para cada
uno de los marcadores y se obtiene que para la cruza Hfr x F - Rec+ el marcador
con mayor frecuencia de recombinación fue el triptófano de 1.6x10 -2, mientras que
Histidina fue el menor con 1.51x10 -5 siendo el de triptófano 30 veces mayor que el
de Histidina; para la cruza F`x F - Rec+ fue Histidina el marcador que tuvo una
mayor frecuencia de recombinación de 4.47x10 -3.
CONCLUSIONES
 Se cuantificó la transferencia de material genético por medio de
conjugación en bacterias Gram (-) mediante el cálculo de la frecuencia de
recombinación.
 Las transconjugantes obtenidas de la cruza Hfr X Rec+ son F-/Pro+,Trp+,
His+.
 Las transconjugantes de la receptora Rec+ fue capaz de incorporar el
material genético transferido a su cromosoma, mientras que Rec- no lo
hizo.
 Las transconjugantes obtenidas de la cruza F’ X F- Rec- son F’,His+,
independientemente de que posean las proteínas Rec, ya que el plásmido
se transfiere de manera completa y no es necesaria la incorporación al
cromosoma para que se expresen los genes transferidos.
 De la cruza F’ X F- Rec+, la F’ forma una célula Hfr dando como resultado
un crecimiento en gradiente, siendo importante la proteína Rec+.
 Las cepas donadoras de Escherichia coli infectada por el fago M13, puede
continuar creciendo mientras libera partículas víricas. Las receptoras F- no
son infectadas.
 En la cruza Hfr x F- Rec+ el marcador con mayor frecuencia de
recombinación fue Histidina, al igual que en la cruza F`x F - Rec+.
BIBLIOGRAFÍA:
• Fernández, J. “Genética”. Ed. Ariel. España. pp 132-137.
• Klug, S. W. Cummings, R. M. y Spencer, A.C. “Conceptos de genética.
Octava edición”. Ed. Pearson Educación. México. pp 155-164.
• http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/09GeneticaBacteriana_23096.p
df Visitado: 15/10/16 a las 17:52 hrs.
• http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/27_micro.htm
Visitado: 15/10/16 a las 18:15 hrs.
• Madigan, M. T. Martinko, J. M. y Parker, J. “Brock. Biologia de los
Microorganismos. 10 ͣ edición”. Ed. Prentice-Hall. Madrid. pp. 517-518