Você está na página 1de 35

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE GRADUAÇÃO


INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
COORDENAÇÃO DO CURSO DE BACHARELADO EM
QUÍMICA

CONSTITUINTES QUÍMICOS E INVESTIGAÇÃO DO


POTENCIAL CITOTÓXICO DAS CASCAS DE Brosimum
parinarioides (MORACEAE)

LIVIANE DO NASCIMENTO SOARES


21000138

Prof. Dr. EMMANOEL VILAÇA COSTA

INGRITY SUELEN COSTA SÁ

Manaus – AM
Setembro/2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE BACHARELADO EM QUÍMICA

LIVIANE DO NASCIMENTO SOARES

CONSTITUINTES QUÍMICOS E INVESTIGAÇÃO DO


POTENCIAL CITOTÓXICO DAS CASCAS DE Brosimum
parinarioides (MORACEAE)

Relatório de Estágio Supervisionado


apresentado à coordenação do Curso de
Graduação em Química da Universidade
Federal do Amazonas, como requisito
parcial para obtenção do título de Bacharel
em Química.

Orientador: Prof. Dr. EMMANOEL VILAÇA COSTA

Manaus – AM
Setembro/2016

2
LAEQ – Laboratório de Abertura de Amostras e Ensaios Químicos

O Laboratório de Abertura de Amostras e Ensaios Químicos (LAEQ) encontra-se


localizado no setor norte da UFAM, onde o mesmo possui cerca de 103 m2, e abriga um
espectrofotômetro UV-visível (marca Thermo Scientific; modelo Evolution 220) com controle
através de microcomputador e software INSIGHT com sonda de fibra ótica, equipamentos de
bancada como leitura de placa de ELISA, medidor de ponto de fusão, câmaras de UV-Vis
para leitura de placas de cromatografia de camada delgada (CCD), estufa de circulação de ar,
rotaevaporadores, sistemas de Clevenger, balanças analíticas, e outros equipamentos
necessários à prospecção de amostras, cujos equipamentos foram adquiridos por projetos de
pesquisa que integram a Central Analítica (CA) da UFAM do qual faz parte, sendo a mesma
uma das divisões do Centro de Apoio Multidisciplinar (CAM), criado em agosto de 1996 e
aprovado pelo conselho universitário como órgão suplementar da UFAM, em 23 de maio de
1997.
O CAM foi concebido para ser um espaço de estudos multidisciplinares e de
funcionalidade multiusuária e de funcionamento multiusuário.
Dentro desta filosofia, a CA, vem realizando análises físico-químicas através de
métodos cromatográficos e espectrométricos, visando oferecer apoio às atividades de
pesquisa, ensino e extensão da UFAM e prestação de serviços à comunidade.
A Central analítica atuou por mais de uma década, instalado em 02 laboratórios,
ocupando uma área aproximadamente de 136 m2, no bloco G setor sul do campus
universitário, onde desde 2013 foi transferida para o novo prédio, situado no setor norte, onde
dispõe de uma área seis vezes maior, distribuída em três andares.
O novo prédio da CA foi constituído com recursos financeiros do projeto CT-INFRA
2007, onde a maior parte dos equipamentos iniciais da CA são destinados às análises no
infravermelho, ultravioleta-visível, absorção atômica e sistema de cromatografia líquida
acoplado à espectrometria de massas.
Ressalta-se que os mesmos estão à disposição para quaisquer análises e ensaios
químicos de bancada em apoio a todos outros laboratórios da CA, tendo como finalidades de
pesquisa e prestação de serviços.

3
RESUMO

Brosimum parinarioides Huber é uma espécie pertencente à família Moraceae, com


indivíduos de grande porte pertencente muito comum nas matas da Amazônia, principalmente
no Amapá, Pará e Amazonas. Estudos fitoquímicos relatam a caracterização preliminar das
classes de substâncias, mas não o isolamento ou identificação por técnicas espectroscópicas e
espectrométricas. O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico do extrato bruto das
cascas de B. parinarioides. O extrato bruto foi preparado pelo método de maceração (extração
a frio) utilizando como solvente o hexano, rendendo o extrato hexânico (EHCBP). O
fracionamento do EHCBP levou à obtenção de quatro frações codificadas como EHCBP-06.1,
EHCBP-06.2, EHCBP-07.1 e EHCBP-07.2. Ambas tiveram sua estrutura química inferida
com base nas análises por RMN de 1H, dados da biblioteca do CG–EM e dados reportados na
literatura. A análise dos espectros de RMN de 1H e do CG-EM das frações evidenciaram a
presença de triterpenos pentacíclicos como o urs-12-eno e o norolean-12-eno, o esteroide β-
sitosterol e o esteroide acetilado lanosterol. Os resultados iniciais obtidos neste trabalho são
inéditos e indicam que B. parinarioides é uma fonte promissora de substâncias terpênicas.
Vale ressaltar que o estudo desta espécie é escasso, sendo assim, faz-se jus a continuação da
investigação e posterior determinação de seus constituintes químicos.

Palavras Chaves: Brosimum parinarioides; Cascas; Triterpenos.

4
LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Estrutura química do bergapteno e do psoraleno.................................................. 10


FIGURA 2: Estrutura química do 3-β-acetoxi-olean-12-eno-28-al e do β-sitosterol............... 11
FIGURA 3: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-06.1 ............................ 20
FIGURA 4: Cromatograma da fração EHCBP-06.1 ................................................................ 21
FIGURA 5: Espectro de massas de EHCBP-06.1: a) MS do pico 8; b) MS do urs-12-enoa; c)
MS do pico 6 e d) MS do norolean-12-enoa ............................................................................. 22
FIGURA 6: Fragmentações da substância do a) pico 8 e b) pico 6.......................................... 23
FIGURA 7: Estrutura do a) Urs-12-eno e b) Norolean-12-eno ............................................... 23
FIGURA 8: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-06.2 ............................ 24
FIGURA 9: Cromatograma da fração EHCBP-06.2 ................................................................ 25
FIGURA 10: Espectro de massas de EHCBP-06.2: a) MS do pico 1e b) MS do β-sitosterola 25
FIGURA 11: Proposta de Fragmentação de EHCBP-06.2 ....................................................... 26
FIGURA 12: Estrutura do β-Sitosterol ..................................................................................... 26
FIGURA 13: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-07.1 .......................... 27
FIGURA 14: Cromatograma da fração EHCBP-07.1 .............................................................. 28
FIGURA 15: Espectro de massas de EHCBP-07.1: a) MS do pico 1, b) MS do pico 2 e c) MS
do pico 3. .................................................................................................................................. 28
FIGURA 16: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-07.2 .......................... 29
FIGURA 17: Cromatograma da fração EHCBP-07.2 .............................................................. 30
FIGURA 18: Espectro de massas de EHCBP-07.2: a) MS do pico 7, b) MS do lanosterola, c)
MS do pico 9, d) MS do urs-12-enoa, e) MS do pico 3 e f) MS do lanosterola ........................ 31
FIGURA 19: Proposta de fragmentação para os picos 7 e 3 .................................................... 32
FIGURA 20: Estrutura do a) Urs-12-eno e b) Acetato de Lanosterol ..................................... 32

5
LISTA DE FLUXOGRAMAS

FLUXOGRAMA 1: Esquema de obtenção dos extratos .......................................................... 15


FLUXOGRAMA 2: Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico (EHCBP) .............. 16
FLUXOGRAMA 3: Isolamento das substâncias presentes na fração GF06 ............................ 17
FLUXOGRAMA 4: Isolamento das substâncias presentes na fração GF07 ............................ 18

6
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 8
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 9
2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................................. 9
2.2. Objetivos Específicos .................................................................................................................. 9
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................................... 10
3.1. ASPECTOS GERAIS DA FAMÍLIA MORACEAE ................................................................ 10
3.2. O GÊNERO Brosimum Sw. ...................................................................................................... 10
3.3. A ESPÉCIE Brosimum parinarioides ....................................................................................... 11
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 12
4.1. SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA ............................................................................... 12
4.2. REVELADORES ...................................................................................................................... 12
4.3. EQUIPAMENTOS .................................................................................................................... 13
4.4. OUTROS EQUIPAMENTOS ................................................................................................... 13
4.5. MATERIAL BOTÂNICO......................................................................................................... 14
4.5.1. Coleta e Identificação do Material Botânico ......................................................................... 14
4.5.2. Secagem e Moagem .............................................................................................................. 14
4.5.3. Obtenção dos Extratos ........................................................................................................... 14
4.6. ESTUDO FITOQUÍMICO ........................................................................................................ 15
4.6.1. Fracionamento Cromatográfico do Extrato Hexânico........................................................... 15
4.6.2. Estudo Cromatográfico do Grupo de Frações GF06 ............................................................. 16
4.6.3. Estudo Cromatográfico do Grupo de Frações GF07 ............................................................. 17
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 19
5.1. IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DOS CONSTITUINTES DO EXTRATO HEXÂNICO
DE B. parinarioides .............................................................................................................................. 19
5.1.1. Identificação Estrutural de EHCBP-06.1 .............................................................................. 19
5.1.2. Identificação Estrutural de EHCBP-06.2 .............................................................................. 23
5.1.3. Identificação Estrutural de EHCBP-07.1 .............................................................................. 26
5.1.4. Identificação Estrutural de EHCBP-07.2 .............................................................................. 29
6. CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 33
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 34

7
1. INTRODUÇÃO

O mercado dos produtos naturais está em constante expansão devido ao grande


interesse por parte dos consumidores em utilizar tais produtos para prevenção de doenças e
melhoria na qualidade de vida, no ponto de vista nutricional. Historicamente, as espécies
vegetais desempenham um importante papel, principalmente, na saúde humana.
O elevado custo de alguns medicamentos torna restrito o seu uso por parte da
população. De acordo com os dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), de 65% a
80% da população mundial (estimada em 6 bilhões de pessoas) não tem acesso ao
atendimento primário de saúde, e recorre à medicina popular, especialmente às plantas
medicinais. O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos (AKERELE, 1993).
Na Amazônia, podemos destacar inúmeras espécies com potencial presença de
fitoterápicos, como por exemplo, a espécie Brosimum parinarioides Huber que tem como o
látex um produto com elevado valor medicinal. O leite branco, que escorre da casca ao ser
cortada, é considerado na região como valioso remédio para asma, bronquite, tuberculose,
traumatismo, em particular no tórax, contra fraqueza em geral e doenças intestinais
(CAVALCANTE, 1996; MATTA, 2003).
Poucos estudos são reportados na literatura no que diz respeito ao isolamento e a
identificação dos constituintes químicos desta espécie, prováveis responsáveis pelos efeitos
biológicos descritos pela população local, o que justifica o estudo fitoquímico desta
direcionado para as cascas.

8
2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Contribuir para o conhecimento fitoquímico da espécie Brosimum parinarioides


(Moraceae) de ampla ocorrência na Amazônia, porém, pouco conhecida quimicamente.

2.2. Objetivos Específicos

 Realizar o estudo fitoquímico das cascas de B. parinarioides;


 Identificar e caracterizar os constituintes químicos do extrato hexânico das cascas
de B. parinarioides;
 Analisar o perfil químico dos constituintes do extrato hexânico das cascas de B.
parinarioides através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas;
 Realizar o ensaio citotóxico dos constituintes isolados do extrato hexânico das
cascas de B. parinarioides.

9
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. ASPECTOS GERAIS DA FAMÍLIA MORACEAE

A família Moraceae é composta por cerca de 1050 espécies distribuídas em 37


gêneros. Sendo representada por 44 espécies presentes na Reserva Florestal Adolpho Ducke
(RIBEIRO et al., 1999). Seus indivíduos são predominantemente arbóreos ou arbustivos. E
quase todos sem exceção têm látex e folhas inteiras, dispostas alternadamente.
Os gêneros Ficus, Brosimum, Dorstenia e Cecropia possuem grande destaque no
Brasil (DALL’STELLA, 2008). Suas espécies são comercialmente exploradas pela indústria
de madeira, papel, borracha, na alimentação e na produção indireta da seda, e também
possuem grande importância na produção de moléculas biologicamente ativas como a espécie
Brosimum gaudichaudii Trecul. de onde foram isolados os compostos, psoraleno e o
bergapteno, duas furanocumarinas, substâncias responsáveis pela ação contra o vitiligo
(FIGURA 1) (POZETTI, 1969; MCKEON, 1981; VARANDA, 2002).

FIGURA 1: Estrutura química do bergapteno e do psoraleno

3.2. O GÊNERO Brosimum Sw.

O gênero Brosimum Sw., compreende cerca de 13 espécies que ocorrem na América


tropical. Porém, apenas duas espécies vêm sendo mais estudadas fitoquimicamente, B.
gaudichaudii e Brosimum rubescens Taub.(TORRES et al., 1997).
Da espécie B. rubescens foram isolados diversas substâncias tais como os triterpenos
3-β-acetoxi-olean-12-eno-28-al e β-sitosterol (FIGURA 2) (HAYASIDA et al., 2008) e ainda
um alto teor da cumarina xantilantina (HAYASIDA et al., 2011) que apresenta um potencial
biológico, sendo reportada pelas atividades antiplaquetária, antifúngica e herbicida, e alguns
derivados que possuem atividade em linhagens de células leucêmicas.

10
FIGURA 2: Estrutura química do 3-β-acetoxi-olean-12-eno-28-al e do β-sitosterol

Da espécie B. gaudichaudii foram isolados duas furanocumarinas, psoraleno e


bergapteno (FIGURA 1) e ainda outras cumarinas como, xantiletina, luvangetina (VIEIRA et
al, 1999).

3.3. A ESPÉCIE Brosimum parinarioides

A espécie B. parinarioides é nativa da região da região amazônica possuindo ampla


ocorrência no Amapá, Amazonas e Pará, com referência também para a Guiana Francesa.
Tem como nome popular o amapá, amapá-doce, amapá-roxo, amaparana, murerana e
amapazeiro (MADY, 2000; BORRÁS, 2003). É uma árvore de grande porte podendo atingir
até 40 m de altura. Suas folhas são de tamanhos variáveis com no máximo 22 cm de
comprimento e 10 cm de largura, duras e com base mais ou menos arredondada (REVILLA,
2002; CORREA, 1978). Apresenta entrecasca avermelhada e sua madeira interna amarela
bem clara. O tronco é cilíndrico e bem ereto. Ao ser cortado, libera um aroma muito agradável
e solta um leite (látex) branco e grudento. O amapá doce é somente encontrado em terra firme
pois não resiste à cheia do rio (SOUZA et al., 2003). Seus frutos têm base mais larga, roxa, e
quando maduro escura, apresenta polpa doce e comestível (REVILLA, 2002).

11
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1. SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA

Cromatografia em coluna (CC): Os fracionamentos cromatográficos foram


realizados em coluna de vidro, utilizando como fase estacionária sílica gel 60 com partículas
entre 70-230 mesh ASTM, da Sigma-Aldrich. A proporção de sílica foi cerca de 20 vezes a
massa do produto bruto a ser purificado (MATOS, 1997).

Cromatografia em camada delgada (CCD): As análises em camada delgada foram


realizadas em cromatofolhas da marca Fluka, sílica gel 60 com indicador de fluorescência
PF254.

Cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP): As análises em escala


preparativa foram desenvolvidas em cromatoplacas de tamanho 20 x 20 cm com espessura de
1,0 mm. As placas foram preparadas usando cerca de 21 g de sílica gel 60 da Macherey-Nagel
e 50 mL de água destilada. Após evaporação da água à temperada ambiente foram ativadas
em estufa a 110 ºC. A visualização das faixas foi efetuada com auxílio de luz ultravioleta (254
e 365 nm). A recuperação das amostras foi realizada utilizando como solventes: hexano
(C6H14), acetato de etila (CH3COC2H5) e/ou misturas destes.

Reveladores: A revelação das faixas foi feita em solução alcoólica de vanilina


sulfúrica e aquecimento em chapa aquecedora.

Solventes: Para cromatografia foram utilizados solventes das marcas Tedia, Nuclear,
Qhemis e Vetec.

4.2. REVELADORES

Solução de Anisaldeído: A solução de anisaldeído foi preparada pela adição de 5


mL de anisaldeído (C8H8O2) em 90 mL de álcool etílico, 5 mL de ácido sulfúrico concentrado
e 1 mL de ácido acético glacial.

12
4.3. EQUIPAMENTOS

Ressonância Magnética Nuclear (RMN): Os espectros de ressonância magnética


nuclear (RMN) foram obtidos no Departamento de Química da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) utilizando um aparelho Bruker Avance DRX-500 operando a 11,75 Tesla
(500 MHz para RMN de 1H e 125 MHz para RMN de 13C). As amostras foram solubilizadas
em clorofórmio deuterado (CDCl3). Os deslocamentos químicos foram expressos em ppm (δ)
e as multiplicidades dos sinais indicadas segundo a convenção: s (simpleto), sl (simpleto
largo), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo dupleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto), dtd
(duplo triplo dupleto) e td (triplo dupleto ou tripleto de dupleto). As constantes de
acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz).

Cromatografia Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-EM): Os


cromatogramas foram obtidos na Unidade de Saúde do Amazonas (ESA) da Universidade
Estadual do Amazonas (UEA) utilizando um cromatógrafo à gás de alta resolução acoplado a
um espectrômetro de massas, aparelho Hewlwtt-Packard HP 5973 Mass Selective Detector,
controlados por computador através do software Standard ChemStation G1701AA versão
A03 (1996). Coluna: DB5, com 25 m x 0,2 mm x 0,11 μm de espessura de filme. Temperatura
do injetor: 270 ºC, com divisor de fluxo (1/20); gás de arraste: He. Temperatura inicial do
forno 80 ºC, por 0,5 minutos, em seguida aquecimento a 8 ºC/minuto até 290 ºC, e
temperatura final de 290 ºC por 5 minutos. Os espectros de massa foram obtidos por impacto
de elétrons a 70 eV.

4.4. OUTROS EQUIPAMENTOS

Evaporador rotatório: Fisatom em banho-maria com temperatura controlada;


Bomba de vácuo: Tecnal;
Moinho: Modelo Marconi com quatro facas;
Estufa incubadora: Med Clave e De Leo;
Balança analítica: Modelos ARC 120 e AR 2140 da marca Adventurer OHAUS.

13
4.5. MATERIAL BOTÂNICO

4.5.1. Coleta e Identificação do Material Botânico

As cascas de B. parinarioides foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho Ducke


[coordenadas 02° 54' 26'' e 03° 00' 22'' S, 59° 52' 40'' e 59° 58' 40'' W], próximo à cidade de
Manaus, Amazonas, Brasil. Indivíduos presentes no local 4, Nº. 1136 no marco M513, ângulo
360 e distância 10, Nº. 1131 no marco M512, ângulo 28 e distância 15. Os dados de
localização e a exsicata da espécie foram depositados no Herbário do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA).

4.5.2. Secagem e Moagem

Após coletado, as cascas de B. parinarioides foram secadas em estufa de ar


circulante à 45 °C, sendo em seguida trituradas em um moinho de quatro facas.

4.5.3. Obtenção dos Extratos

As cascas de B. parinarioides após secas, moídas e pesadas foram submetidas à


extração pelo método de maceração (temperatura ambiente) com hexano, havendo renovação
de solvente em intervalo de 72 horas. O resíduo remanescente foi guardado. O extrato obtido
foi concentrado em um evaporador rotativo à pressão reduzida, à temperatura de 40-50 °C, e
em seguida secado em um dessecador, resultando nos extratos hexânico (FLUXOGRAMA 1).
O rendimento do extrato obtido foi calculado e em seguida foi armazenado em freezer para
posterior estudo.

14
Cascas de Brosimum parinarioides
(650,0 g)

- Extração com hexano


- 7 extrações em intervalo de 72 horas
- Filtração e concentração do solvente

Extrato Hexânico (EHCBP)


Torta
12,32 g

FLUXOGRAMA 1: Esquema de obtenção dos extratos

4.6. ESTUDO FITOQUÍMICO

4.6.1. Fracionamento Cromatográfico do Extrato Hexânico

Uma parte do extrato hexânico EHCBP (5,0 g) foi inicialmente submetida ao


fracionamento cromatográfico por meio de uma coluna cromatográfica (CC: Φ x h de 4,5 x 50
cm) de sílica gel com 0,063-0,200 mm (70-230 mesh) eluída com hexano, diclorometano,
acetato de etila e metanol, em mistura de polaridades crescente resultando em 303 frações (20
mL cada) conforme o FLUXOGRAMA 2. As frações obtidas foram analisadas por CCDA e
as que apresentaram o mesmo Rf foram reunidas obtendo 15 grupos de frações GF01-GF15
(TABELA 1).

15
EHCBP
(5,0 g)

Coluna sílica (70-230 mesh)


(Φ x h: 4,5 x 50 cm)

Hexano Hexano:CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2:AcOEt AcOEt AcOEt:MeOH


Fr. 1-3 Fr. Fr. 68-74 Fr. Fr. 141-144 Fr
9:1 4-5 9:1 75-81 9,5:0,5 145-148
8:2 6-9 8:2 82-89 8,5:1,5 149-152
7:3 10-17 7:3 90-108 7:3 153-156
6:4 18-29 6:4 109-116 5:5 157-160
5:5 30-36 5:5 117-124 100 161-164
4:6 37-44 4:6 125-128
3:7 45-52 3:7 129-132
2:8 53-58 2:8 133-138
1:9 59-67 1:9 139-140

FLUXOGRAMA 2: Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico (EHCBP)

TABELA 1: Relação entre grupos de frações/substâncias isoladas do extrato hexânico das cascas de Brosimum
parinarioides
Grupo
Grupo de Massa Substâncias Massa Substâncias
Frações de Frações
Frações (mg) Isoladas (mg) Isoladas
Frações
01 1–15 25,6 09 66–77 237,3
02 3–25 55,2 10 78–88 265,5
03 26–31 125,5 11 89 193,2
04 32–37 196,6 12 90–108 135,3
05 38–49 215,7 13 109–115 751,8
EHCBP-06.1 14
06 50–54 67,7 116–123 297,3
EHCBP-06.2
EHCBP-07.1 15
07 55–64 587,1 124–164 195,0
EHCBP-07.2
08 65 12,3

4.6.2. Estudo Cromatográfico do Grupo de Frações GF06

O grupo de frações GF06 (67,7 mg) foi submetido à CCDP utilizando como eluente
uma mistura binária de CHCl3:AcOEt [95:05] com duas eluições, resultando em duas (2)
frações (FLUXOGRAMA 3). A frações codificadas como EHCBP-06.1 (2,6 mg) e EHCBP-
06.2 (30,4 mg) apresentaram-se como sólidos brancos amorfos. A análise por CCD da fração

16
EHCBP-06.1 evidenciou um spot intenso de coloração azul, enquanto a análise por CCD da
fração EHCBP-06.2 evidenciou um spot de coloração verde quando reveladas com solução de
anisaldeído. Posteriormente foram submetidas às análises espectroscópicas e espectrométrica.

GF06
(67,7 mg)

- CCDP
- CHCl3:AcOEt [95:05]
- Duas Eluições

EHCBP-06.1 EHCBP-06.2
(2,5 mg) (30,4 mg)

FLUXOGRAMA 3: Isolamento das substâncias presentes na fração GF06

4.6.3. Estudo Cromatográfico do Grupo de Frações GF07

O grupo de frações GF07 (587,1 mg) foi submetido à CCDP utilizando como eluente
uma mistura binária de CHCl3:AcOEt [95:05] com duas eluições, resultando em duas (2)
frações (FLUXOGRAMA 4). A frações codificadas como EHCBP-07.1 (187,6 mg) e
EHCBP-07.2 (7,2 mg) apresentaram-se como sólidos brancos amorfos. A análise por CCD da
fração EHCBP-07.1 evidenciou um único spot intenso de coloração azul, enquanto a análise
por CCD da fração EHCBP-07.2 evidenciou um spot intenso de coloração azul quando
reveladas com solução de anisaldeído. Posteriormente foram submetidas às análises
espectroscópicas e espectrométrica.

17
GF07
(587,1 mg)

- CCDP
- CHCl3:AcOEt [95:05]
- Duas Eluições

EHCBP-07.1 EHCBP-07.2
(187,1 mg) (7,2 mg)

FLUXOGRAMA 4: Isolamento das substâncias presentes na fração GF07

18
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Do estudo fitoquímico das cascas de B. parinarioides utilizando os métodos


cromatográficos usuais (CC, CCD, CCDP) foi possível a obtenção de quatro (4) frações que
ao serem reveladas com solução de anisaldeído apresentaram coloração característica de
compostos terpenoides. As frações foram identificadas utilizando as técnicas de RMN de 1H e
CG-EM, bem como por comparação com os dados descritos na literatura.

5.1. IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DOS CONSTITUINTES DO EXTRATO


HEXÂNICO DE B. parinarioides

5.1.1. Identificação Estrutural de EHCBP-06.1

A fração EHCBP-06.1 (2,6 mg) apresentou-se como um sólido amorfo branco, que
ao ser revelado com vanilina sulfúrica exibiu um spot de coloração azul intenso, característico
de terpenos e, um spot de coloração escura acima do spot anterior, que pode ser atribuído à
presença de impureza.
Pela análise do espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) (FIGURA 1) observou-
se características de mistura de triterpenos.
A análise do espectro possibilitou a visualização da região de hidrogênios alílicos na
região entre δ 4,20-3,20 característicos de triterpenos pentacíclicos com instauração no C-12
(MATHÉ & CULIOLI, 2004) (FIGURA 3).

19
7.2602

4.1702
4.1635
4.1562
4.1485
4.1291
4.1148
4.1006
4.0641
4.0506
4.0371
3.9557
3.7440
3.7301
3.7160
3.7020
3.4912
2.5112
2.5066
2.4916
2.4579
2.4429
2.4342
2.4194
2.4005
2.3912
2.3763
2.3611
2.2998
2.2848
2.2696
2.1704
0.8939
0.8803
0.8661
0.0692
0.0000
10.0 5.0 0.0
ppm (f1)
FIGURA 3: Espectro de RMN de H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-06.1
1

Através da análise por CG-EM foi possível verificar a presença de triterpenos


visualizados no espectro de RMN de 1H. A análise do perfil (Figura 2) mostrou a presença de
nove (9) componentes na mistura, sendo dois (2) componentes majoritários, o componente
com tempo de retenção de 47,715 minutos e área de 47,42% (pico 8) e o componente com
tempo de retenção de 34,583 minutos e área de 27,21 % (pico 6) (FIGURA 4).

20
FIGURA 4: Cromatograma da fração EHCBP-06.1

Assim, pela análise dos espectros de massas obtidos para EHCBP-06.1 e a consulta
às bibliotecas de espectros disponíveis no equipamento (NIST, Wiley 229.LIB), visualizou-se
uma mistura de triterpenos, com picos majoritários de IS 84% para o pico 8 e IS 86 % para o
pico 6 (FIGURA 5).

21
a)

b)

c)

d)

FIGURA 5: Espectro de massas de EHCBP-06.1: a) MS do pico 8; b) MS do urs-12-enoa; c)


MS do pico 6 e d) MS do norolean-12-enoa
a
NIST, Wiley 229.LIB

Os espectros de massas para o picos 8 e 6 evidenciaram o mesmos padrões de


fragmentações com picos mais abundantes em m/z 218 e m/z 205, que são compatíveis com
fragmentações características dos triterpenos pentacíclicos com uma instauração na posição
C-12 (MATHÉ & CULIOLI, 2004). Para o pico 8, o composto apresentou o íon precursor m/z
410 equivalente à massa calculada para o triterpeno urs-12-eno (410,72 Da) e, para o pico 6, o
composto apresentou o íon precursor m/z 396 equivalente à massa calculada para o triterpeno
norolean-12-eno (396,69 Da) (FIGURA 6). Tal fragmentação ocorre via uma reação Retro-
Diels-Alder no anel C (FIGURA 6), padrão para as séries ursano e oleanano (MATHÉ &
CULIOLI, 2004).
a)

b)

FIGURA 6: Fragmentações da substância do a) pico 8 e b) pico 6

Os dados fornecidos pelas análises de RMN de 1H e CG-EM, bem como comparação


com os dados da literatura (MATHÉ & CULIOLI, 2004), permitiu inferir a presença de dois
triterpenos na mistura da fração EHCBP-06.1, o urs-12-eno e o norolean-12-eno (FIGURA
7).

a) b)

FIGURA 7: Estrutura do a) Urs-12-eno e b) Norolean-12-eno

5.1.2. Identificação Estrutural de EHCBP-06.2

A substância EHCBP-06.2 (30,4 mg) apresentou-se como um sólido branco amorfo,


que ao ser revelado com vanilina sulfúrica exibiu um spot de coloração verde.
Pela análise do espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) (FIGURA 8) observou-
se características de perfil de triterpeno.

23
A partir da análise do espectro de RMN de 1H foi possível a visualização da região
de hidrogênios alílicos na região entre δ 5,50-5,00 e um grande número de sinais intensos na
região de δ 0,72-2,86, atribuídos aos hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos que
caracterizam o esqueleto esteroidal (FIGURA 6) (NASCIMENTO, 2014).

7.2598

5.3763
5.3734
5.3714
5.3656
5.3627
5.3503
5.3420
5.3406
5.3372
5.1326
5.1248
5.1114

2.1701
2.0656
2.0535
2.0416
1.6786
1.6073
1.5974
1.5586
1.3015
1.2542
0.8939
0.8907
0.8804
0.8701
0.8670
0.8469
0.8429
0.8295
0.8082
0.6792
0.0000
10.0 5.0 0.0
ppm (f1)
FIGURA 8: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-06.2

24
Através da análise por CG-EM foi possível verificar a presença de triterpenos
visualizados no espectro de RMN de 1H. A análise do perfil mostrou a presença de um (1)
componente majoritário na mistura, com tempo de retenção de 47,721 minutos e área de
100% (FIGURA 9).

FIGURA 9: Cromatograma da fração EHCBP-06.2

Por meio do espectro de massas do pico 1 foi possível visualizar um padrão de


fragmentações com picos mais abundantes em m/z 396, m/z 381 e m/z 255 (FIGURA 10), que
são compatíveis com fragmentações características do esteroide β-sitosterol (NASCIMENTO,
2014). A Figura 11 traz uma proposta de fragmentação de EHCBP-06.2.

a)

b)

FIGURA 10: Espectro de massas de EHCBP-06.2: a) MS do pico 1e b) MS do β-sitosterola


a
NIST, Wiley 229.LIB

25
FIGURA 11: Proposta de Fragmentação de EHCBP-06.2

Os dados fornecidos pelas análises de RMN de 1H e CG-EM, bem como comparação


com os dados da literatura NASCIMENTO (2014), permitiu inferir a presença do esteroide na
fração EHCBP-06.2, o β-sitosterol (FIGURA 12).

FIGURA 12: Estrutura do β-Sitosterol

5.1.3. Identificação Estrutural de EHCBP-07.1

A substância EHCBP-07.1 (187,1 mg) apresentou-se como um sólido branco


amorfo, que ao ser revelado com vanilina sulfúrica exibiu um spot de coloração azul intenso e
um spot de coloração escura acima do spot anterior, que pode ser atribuído à presença de
impureza.
Pela análise do espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) (FIGURA 13) observou-
se características de mistura de triterpenos, assim como nas demais frações.
O espectro de RMN de 1H apresentou os sinais similares aos visualizados nas demais
frações. Tais dados quando correlacionados com o espectro de CG-EM mostrou divergências

26
nas massas de fragmentação, não sendo possível correlaciona-lo com as substâncias indicadas
na biblioteca do CG-EM.

7.2611

5.2500
5.2430
5.1884
5.1812
5.1742
5.1258
5.1184
5.0984
4.5320
4.5234
4.5184
4.5105
4.5087
4.5022
4.4908
4.4864

2.0520
2.0470
1.6837
1.6051
1.1306
1.0667
1.0107
0.9790
0.9688
0.9641
0.9332
0.8753
0.8663
0.8555
0.8508
0.0000
10.0 5.0 0.0
ppm (f1)
FIGURA 13: Espectro de RMN de H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-07.1
1

Embora a biblioteca do CG-EM não tenha sugerido substâncias com confiabilidade


de correlação com a amostra, foi possível visualizar o perfil característico de triterpenos no
espectro. A análise do perfil (FIGURA 14) evidenciou a presença de três (3) componentes na
mistura, o componente com tempo de retenção de 47,662 minutos e área de 48,85% (pico 2),
o componente com tempo de retenção de 47,073 minutos e área de 41,50% (pico 1) e o
componente com tempo de retenção de 48,345 minutos e área de 9,65 % (pico 3). A FIGURA
15 apresenta os espectros de massas dos componentes da fração EHCBP-07.1.

27
FIGURA 14: Cromatograma da fração EHCBP-07.1

a)

b)

c)

FIGURA 15: Espectro de massas de EHCBP-07.1: a) MS do pico 1, b) MS do pico 2 e c) MS


do pico 3.
28
5.1.4. Identificação Estrutural de EHCBP-07.2

A substância EHCBP-07.2 (7,2 mg) apresentou-se como um sólido branco amorfo,


que ao ser revelado com vanilina sulfúrica exibiu um spot de coloração azul intenso e um spot
de coloração escura acima do spot anterior, que pode ser atribuído à presença de impureza.
Pela análise do espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) (FIGURA 16) observou-
se características de mistura de triterpenos.
Através da análise do espectro foi possível a visualização da região de hidrogênios
alílicos nas regiões entre δ 5,50-5,00, característico de esteroides (NASCIMENTO, 2014) e
entre δ 4,20-3,20 característicos de triterpenos pentacíclicos (MATHÉ & CULIOLI, 2004).
Um grande número de sinais intensos na região de δ 0,72-2,86 podem ser atribuídos aos
hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos que caracterizam o esqueleto esteroidal
(FIGURA 16) (NASCIMENTO, 2014).
7.2607

5.2501
5.2426
5.1332
5.1254
5.1104
5.0977
5.0877
5.0845
4.5334
4.5249
4.5173
4.5108
4.5076
4.5026
4.4935
4.4914
4.4847
2.1696
2.0524
2.0471
2.0411
1.6834
1.6786
1.6057
1.2541
0.9743
0.9327
0.8733
0.8676
0.8503
0.8031
0.7993
0.0000

10.0 5.0 0.0


ppm (f1)
FIGURA 16: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCℓ3) de EHCBP-07.2

Através da análise por CG-EM foi possível verificar a presença de triterpenos


visualizados no espectro de RMN de 1H. A análise do perfil (FIGURA 17) mostrou a presença

29
de dez (10) componentes na mistura, sendo três (3) componentes majoritários, o componente
com tempo de retenção de 47,085 minutos e área de 47,15% (pico 7), o componente com
tempo de retenção de 47,666 minutos e área de 27,29% (pico 9) e o componente com tempo
de retenção de 46,054 minutos e área de 19,66 % (pico 3).

FIGURA 17: Cromatograma da fração EHCBP-07.2

Por meio da análise do espectro de massas para os picos 7 e 3 foi possível a


verificação dos mesmos padrões de fragmentações, com picos mais abundantes em m/z 393 e
m/z 453 (FIGURA 18: a) e e)), que são compatíveis com fragmentações características do
esteroide acetilado lanosterol (NASCIMENTO, 2014). A Figura 19 traz uma proposta de
fragmentação dos picos 7 e 3 da fração EHCBP-07.2.
Através do espectro de massas para o pico 9 observou-se o padrão de fragmentação,
com picos mais abundantes em m/z 218 e m/z 303 (FIGURA 18: c)), que são compatíveis com
fragmentações características do triterpeno pentacíclico insaturado urs-12-eno (MATHÉ &
CULIOLI, 2004).

30
a)

b)

c)

d)

e)

f)

FIGURA 18: Espectro de massas de EHCBP-07.2: a) MS do pico 7, b) MS do lanosterola, c)


MS do pico 9, d) MS do urs-12-enoa, e) MS do pico 3 e f) MS do lanosterola
a
NIST, Wiley 229.LIB

31
FIGURA 19: Proposta de fragmentação para os picos 7 e 3

Os dados fornecidos pelas análises de RMN de 1H e CG-EM, bem como comparação


com os dados da literatura NASCIMENTO (2014) e MATHÉ & CULIOLI (2004), permitiu
inferir a presença de dois triterpenos na mistura da fração EHCBP-07.2, o urs-12-eno e o
norolean-12-eno (FIGURA 20).

a) b)

FIGURA 20: Estrutura do a) Urs-12-eno e b) Acetato de Lanosterol

32
6. CONCLUSÃO

O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico (EHCBP) de B. parinarioides


levou à obtenção de quatro frações codificadas como EHCBP-06.1, EHCBP-06.2, EHCBP-
07.1 e EHCBP-07.2. Ambas tiveram sua estrutura química inferida com base nas análises por
RMN de 1H, dados da biblioteca do CG–EM e dados reportados na literatura.
A análise dos espectros de RMN de 1H e de CG-EM das frações evidenciaram a
presença de triterpenos pentacíclicos como o urs-12-eno e o norolean-12-eno, o esterol β-
sitosterol e o esterol acetilado lanosterol.
Os ensaios citotóxicos previstos nos objetivos específicos não puderam ser realizados
a tempo, o que acrescenta aos resultados obtidos a realização de estudos futuros mais
aprofundados sobre a composição química e atividades destes compostos, assim como
purificação dos mesmos.
O estágio proporcionou o aprendizado e aprimoramento do conhecimento de
diferentes técnicas e métodos de análises, além de possibilitar a realização de atividades do
laboratório. O ambiente de trabalho contribuiu bastante para o aprendizado, proporcionando-
me grande crescimento científico e profissional na graduação.
A central analítica disponibiliza de uma ótima infraestrutura, possibilitando ao aluno
conviver em diversas áreas de atuação adequadamente, tendo contato com diferentes técnicas
na área de química, assim como participar ativamente das análises do laboratório e com
treinamentos em aparelhos modernos.
Em suma, a disciplina Estágio Supervisionado mostrou-se satisfatória, tendo
acrescentado conhecimento e experiência voltados para formação acadêmica na área de
química.

33
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AKERELE O. Summary of WHO guidelines for the assessment of herbal medicines.


Herbal Gram, v. 28, p. 13-19, 1993.

BORRÁS, M. R. L. Plantas da Amazônia: medicinais ou mágicas – Plantas


comercializadas no Mercado Municipal Adolpho Lisboa. Governo do Estado do
Amazonas: Ed. Valer, 2003, 737 p.

CAVALCANTE, P. B. Frutos comestíveis da Amazônia. 6ª Ed.- Belém: CNPQ /


Museu Paraense Emílio Goeldi. (Coleção Adolpho Ducke), 1996.

CORREA, P. M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de
Janeiro, Imprensa nacional, 1978.

DALL’STELLA, D. S. G. Estudo Fitoquímico Aplicado da Fração Solúvel do


Extrato Etanólico Bruto da Dorstenia multiformis Miquel (MORACEAE).
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Paraná, Brasil, 2008.

HAYASIDA, W.; SOUZA, A. S. de; LIMA, M. da P.; NASCIMENTO, C. C. do;


FERREIRA, A. G. Proposta de aproveitamento em resíduos de pau-rainha (Brosimum
rubescens) descartados pelo setor madeireiro. Acta Amazonica, v. 38, n. 4, p. 749-752,
2008.

HAYASIDA, W.; LIMA, M. da P.; NASCIMENTO, C. C. do; FERREIRA, A. G.


Resíduos madeireiros do alburno de pau-rainha (Brosimum rubescens): Investigação de
metabólitos secundários e alguns aspectos tecnológicos. Acta Amazonica, v. 41, n. 2, p.
285-288, 2011.

MADY, F. T. M. Conhecendo a madeira. 1ª ed. Manaus: SEBRAE/AM. Programa de


Desenvolvimento Empresarial e Tecnológico, 2000.

MATHE, C.; CULIOLI, G. Characterization of archaeological frankincense by gas


chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1023, p. 277-
285, 2004.

MATTA, A. Flora Médica Brasiliense. 3ª. Edição revista. Manaus: Editora Valer,
2003, 356 p.

MATOS, F.J.A. Introdução a fitoquímica experimental. 2ª Ed. Fortaleza: Edições UFC,


1997.

MATTA, A. Flora Médica Brasiliense. 3ª. Edição revista. Manaus: Editora Valer,
34
2003, 356 p.

MCKEON, J. J. 1981. PUVA for psoriasis. American Pharmacy 9. 530-532. Mithofer,


Axel; Boland, Wilhelm. Plant Defense Against Herbivores: Chemical Aspects. Review of
Plant Biology. 2012. 63:431–50

NASCIMENTO, M. N. G. Estudo químico de Erythroxylum suberosum (erythroxylaceae)


frente às catepsinas K, L E V. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
regional Catalão, Departamento de Química, 2014.

POZETTI, G. L. Chemical study of Brosimum gaudichaudii Trecul. 1. Isolation and


identification of bergapten, and psoralene from the roots of Brosimum gaudichaudii
Trecul. Revista da Faculdade de Farmácia e Odontologia de Araraquara, v. 3, p.
215-223, 1969.

REVILLA, J. Plantas da Amazônia- Oportunidades Econômicas e Sustentáveis.


Manaus- AM: Ed.INPA e SEBRAE, 2002, 532 pp.

SOUZA, M. N.; DA SILVA, A. F. C; MARTINS, F. de S. M; FERREIRA, G. dos S.;


FERREIRA, C. F. A.; RAMOS, F. M.; PEREIRA, R. de O. Plantas Medicinais
etnobotânica na Varzéa do Mamirauá. Manaus: Ed S.F.R. Rocha, F.M. Scarda, 2003,
218 p.

TORRES, S. L.; MONTEIRO, J. C. M.; ARRUDA, M. S.; MULLER, A. H.;


ARRUDA, A. C. Two flavans from Brosimum acutifolium. Phytochemistry, v. 44, p.
347-349, 1997.

VIEIRA, I. C.; MATHIAS, L.; MONTEIRO, V. F. F.; BRAZ-FILHO, R.;


RODRIGUES-FILHO, E. E. A New Coumarin fromBrosimum
gaudichaudii Trecul. Natural Product Research, v. 13, n. 1, p. 47-52, 1999.

35