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MÉTODO ANALÍTICO DE LA PROTEASA (PC)

COPIA NO CONTROLADA

A . Propósito: Este procedimiento es usado para determinar la actividad proteásica

expresada como unidades PC en preparaciones derivadas de Bacillus subtilis var. y
Bacillus licheniformis var. El análisis esta basado en una hidrólisis proteolítica de
caseína a 37° C y a un pH de 7.0. La caseína no hidrolizada es removida por filtración
y la caseína solubilizada se determina espectrofotométricamente.

B. Equipo:
1. Potenciómetro
2. Baño de agua a temperatura constante (37.0° ± 0.1° C)
3. Balanza analítica
4. Espectrofotómetro a una longitud de onda de 275nm
5. Matraces aforados
6. Pipetas aforadas
7. Embudo de pistilo largo
8. Tubos de cultivo desechables
9. Tubos de 25 ml con rosca
10. Cronómetro
11. Papel filtro Whatman #1
12. Micropipetas

C. Medidas de seguridad:
1. Siga las prácticas estándares de seguridad del laboratorio.
2. Ácido acético – Manéjelo en la campana de seguridad.
3. Ácido tricloroacético – Use guantes para evitar quemaduras.

D. Reactivos y preparación de reactivos (los volúmenes pueden ser ajustados

dependiendo de los requerimientos):
1. Sustrato (prepárelo diariamente):
a. Coloque un vaso de precipitado de 2000 a 4000 ml en una placa caliente con
agitador.
b. Añada agua (suficiente para cubrir 2/3 del vaso) y póngala a hervir.
c. Disuelva y diluya 1,51 g de HCl 1N HCL en aproximadamente 125 ml de agua
destilada
Estas sugerencias y datos están basados en información que consideramos confiable. Son ofrecidas de buena fe, pero
sin garantía debido a que las condiciones y métodos de uso de nuestros productos están más allá de nuestro control. Las
sugerencias de uso de nuestros productos no deben ser entendidas como recomendaciones que incurran en la violación
de cualquier patente o regulación gubernamental.
 en un vaso de 250 o 400 ml.
d. Agregue 1.75 g (peso seco) de caseína grado Hammarsten (considerando las
determinaciones de humedad para cada lote del reactivo) en la solución anterior
y revuelva con la barra agitadora.
e. Cubra la solución con papel aluminio.
f. Coloque la caseína en el baño de agua hirviendo y agite constantemente por 30
minutos. Asegúrese de que el nivel del agua no alcance el borde del vaso (pese
el vaso con caseína junto con otro vaso lleno de agua para minimizar el
movimiento causado por la ebullición).
g. Remueva el vaso de precipitado del agua hirviendo y enfríe a temperatura
ambiente en un baño de agua fría mientras agita con suavidad en forma
constante.
h. Titule el pH del sustrato de caseína a 7.0 con el HCl 0.2N y añádalo lentamente
para evitar la destrucción de la matriz proteica (use aproximadamente 35 ml de
ácido).
i. Diluya la solución de caseína con agua destilada hasta 250 ml en un matraz
aforado.

2. Búfer Tris (prepare diariamente):

a. Sobre un agitador magnético ponga un vaso de precipitado de 2000 ml o
más grande y coloque una barra agitadora.
b. Añada aproximadamente entre 1600 y 1700 mL de agua destilada al vaso.
c. Añada 24.2 g de Tris.
d. Agite hasta disolver.
e. Ajuste el pH de la solución búfer a 7.0 usando HCl 1N (use
aproximadamente 180 ml).
f. Diluya el búfer con agua destilada hasta 2000 mL en un matraz aforado.
g. Repita si es necesario.

3. Solución finalizadora (reactivo madre de PC-TCA):

a. Disuelva 18.0 g de ácido tricloroacético y 19.0 g de acetato de sodio (3H20)
en agua.
b. Añada 20 g (20 ml) de ácido acético glacial.
c. Diluya a un 1 litro en agua destilada.
d. La solución finalizadora es estable a temperatura ambiente.

F. Procedimiento:
1. Preparación de la enzima:
a. Pese exactamente una muestra de la enzima y disuélvala en la solución búfer.
La concentración de la solución final debe corresponder a una absorbancia de
aproximadamente 0.3800.
b. Cálculo de la preparación de la enzima:

Concentración final = 0.3800 x PC factor*

Blanco PC x 2

Estas sugerencias y datos están basados en información que consideramos confiable. Son ofrecidas de buena fe, pero
sin garantía debido a que las condiciones y métodos de uso de nuestros productos están más allá de nuestro control. Las
sugerencias de uso de nuestros productos no deben ser entendidas como recomendaciones que incurran en la violación
de cualquier patente o regulación gubernamental.
 Ejemplo: concentración final de la enzima = 0.0000558
Blanco = 227,000 PC
Factor* = 66.7

0.0000558 = 0.3800 x 66.7*

227,000 x 2

*Previamente determinado por la curva de la tirosina

2. Evaluación de la enzima:
a. Transfiera 10 ml del sustrato de caseína a 3 tubos con rosca etiquetados
(1A, 1B y 1C... para cada muestra).
b. Coloque los tubos en el baño a 37° C por un mínimo de 5 minutos.
c. Prepare las soluciones de enzima que medirá. Las soluciones serán estables
por sólo 30 minutos.
d. Añada 2.0 ml de la solución de enzima a cada uno de los dos primeros
tubos (1A y 1B...etc.), mezcle usando el vórtex y regréselos inmediatamente al
baño de agua. Deje tiempo suficiente entre las inyecciones (un minuto es lo
recomendable).
e. Incube los tubos en el baño a 37° C por exactamente 30 minutos.
f. A los 30 minutos añada 10 ml de ácido tricloroacético a cada tubo y
regréselos al baño de agua.
g. Mezcle los tubos con el vórtex y regréselos al baño de agua.
h. Para usar como blanco el tercer tubo (1C...etc.) añada la solución
finalizadora de ácido tricloroacético y a continuación agregue 2 ml de la
enzima original,
i. Deje los tubos en el baño a 37° C por 30 minutos más.
j. Saque los tubos del baño de agua y enfríelos a temperatura ambiente.
k. Filtre el contenido de cada tubo dos veces usando el mismo papel filtro
Whatman #1.
l. Use aire para iniciar el espectrofotómetro en cero, registre e imprima la
absorbancia del filtrado claro de los tres tubos.

3. Preparación de la curva estándar:

a. Disuelva 0.100 g de tirosina en 60 ml de HCl 0.10N y diluya con agua
destilada en un matraz aforado de 1 L. Esta solución madre contiene
aproximadamente 100 µg de tirosina por ml.
b. Prepare tres diluciones más de la solución previamente preparada que
contengan cada una 25.0, 40.0 y 75 µg de tirosina por ml.
c. Determine la absorbancia de las soluciones de tirosina a 25, 40, y 75
microgramos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 275 nm en
una cuveta de 1 cm.
d. Grafique la absorbancia contra la concentración de tirosina.
e. Calcule la pendiente a partir de los datos generados.
f. Determine el valor para 60 µg/ml a partir de la gráfica y divídalo por 40
para obtener la absorbancia para 1.50 µg/ml.
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 g. El valor debe ser cercano a 0.0114.
h. Cálculo del factor:

Factor = _________22___________
A de 1.50 µg/ml tir x 30
A = Absorbancia
22 = Volumen
30 = Tiempo

G. Cálculos:
Una unidad de actividad es la cantidad de enzima que bajo las condiciones de la
prueba, produce en un minuto, un producto de la hidrólisis cuya absorbancia a
275 mµ es la misma que la de una solución de tirosina que contiene 1.5 µg de
tirosina por 1 ml.

PC/g = ___________A x Factor*__ _

Concentración de la enzima (g/ml) x 2

A = Absorbancia de la prueba menos la absorbancia del blanco

*Para facilidad de la operación, el factor se calcula incorporando volúmenes constantes y

la pendiente es obtenida de la curva de tirosina. Refiérase a la curva de tirosina.

Ejemplo: A = 0.3800
Factor = 66.7
Concentración de la enzima = 0.00005580 g/ml
PC = 0.3800 x 66.7 / 0.00005580 x 2* = PC
*alícuota de 2.0 ml

H. Prueba de la exactitud de los parámetros:

1. Rango: pueden usarse las lecturas de absorbancia después de la corrección con
el blanco si están entre 0.200 y 0.500.
2. Los duplicados no deben variar por más del 3%.

I. Referencias:

1. Food Chemical Codex, Fourth Edition, July1, 1996. p. 811-812.

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