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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO – UFRPE

UNIDADE ACADÊMICA DE GARANHUNS – UAG


ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Disciplina: Bioquímica Geral


Professora: Tatiana Souza Porto
Aluna: Nayá Paiva Pereira de Almeida Leitão
AULA PRÁTICA 02: ATIVIDADE DA UREASE EXTRAÍDA DE SOJA

1. INTRODUÇÃO

As enzimas são proteínas que têm a função de catalizar reações. A função de uma enzima é
dependente da conformação de sua estrutura proteica; caso haja desnaturação, ela será reduzida
aos aminoácidos que a constitui e, como consequência da perda de suas estruturas
tridimensionais, não agirá mais como catalizador. Como catalizadoras, elas aceleram a
velocidade de reações sem participar como produto ou reagente. São responsáveis por acelerar
praticamente todas as reações do metabolismo celular, mas também podem ser usadas na
indústria (em alimentos, produção de detergentes, etc.) podem ser de origem animal, vegetal ou
microbiana.1,2,5
As ureases são enzimas que dependem de níquel e que agem como catalizadoras na reação
de hidrólise da uréia, convertendo-a em amônia e em carbonato de amônia (que posteriormente
é convertido em amônia e dióxido de carbono). Como a uréia é estável no meio aquoso, a reação
de hidrólise pela urease é acelerada de 10 14 a 1032 vezes. Estão presentes em plantas, fungos,
bactérias e não são produzidas por animais.3
(H2N)2C=O + H2O → CO2 + 2NH3
(Reação de hidrólise da uréia: Uréia → Dióxido de carbono + amônia)

2. OBJETIVOS

O experimento teve como objetivos demonstrar a natureza protéica da enzima urease,


determinar qualitativamente a sua atividade enzimática, mostrar a desnaturação protéica,
exemplificar a inibição enzimática e demonstrar a especificidade da ação enzimática.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Para a realização da aula prática, as seguintes soluções e reagente tiveram que ser feitos:
soluções de reativo de biureto e de vermelho de fenol, e extração de urease de soja.
Para que uma solução de reativo de biureto fosse preparada, 1,5 g de sulfato de cobre
pentaidratado e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio foram diluídos em 500 mL de água
destilada. À essa solução foram adicionados 300 mL de hidróxido de sódio a 10 g% (p/v) com
agitação constante e esse volume foi completado para 1 L com água destilada em seguida.
A solução de vermelho de fenol foi preparada a partir da dissolução de 0,1 g de
vermelho de fenol em 250 mL de água destilada alcalinizada com 2,82 mL e NaOH a uma
concentração de 0,1 molL-1.
A extração de urease de soja foi feita depois de 15 g de farinha de soja ter sido pesada e
colocada em um erlenmeyer de 250 mL. Depois foram adicionados 100 mL de glicerol a 75%
em água. O erlenmeyer foi tapado com uma rolha, suspenso, agitado com a mão por cerca de 15
minutos e depois colocado na geladeira por cerca de um dia. A seguir, o extrato glicerinado foi
filtrado com uma gaze que foi levemente espremida com um bastão. Quando mantida sob
refrigeração, a solução de urease obtida é estável por cerca de seis anos.
Foram feitos cinco experimentos para que a análise de atividade de urease fosse feita:
i) A reação de biureto foi realizada com o auxílio de dois tubos de ensaio,
devidamente marcados como A e B. No tubo A foram colocadas 2 gotas da solução
de urease e 2 mL de água destilada. A solução foi agitada e, em seguida, foram
adicionados 2 mL de do reativo de biureto; houve a mistura dos compostos em
seguida. No tubo B, foram colocados 2 mL de água destilada e 2 mL do reativo de
biureto para que fossem misturados.
ii) O teste de atividade enzimática foi feito também com o auxílio de 2 tubos,
chamados de tubo A e tubo B. No tubo A foram adicionados 3 mL de tampão
fosfato 1mmolL-1 (pH 7) contendo 1% de ureia e 2 gotas de urease. No tubo B
foram colocados 3 mL de tampão fosfato 1mmolL -1 (pH 7), sem ureia, e duas gotas
de urease. 1 gota de solução vermelho de fenol foi adicionada nos dois tubos. Os
tubos foram agitados e deixados observados durante 5 minutos para a observação
em uma possível mudança de cor, apesar de a reação ocorrer mais facilmente a
37ºC.
iii) Um teste foi feito com o efeito do calor na solução enzimática. Foram separados
dois tubos para esse teste; no tubo A foram colocados 2 mL de água destilada e 2
gotas de urease. A mistura foi agitada e o tubo foi colocado em um bécker que
continha água fervendo e ela foi deixada lá por cinco minutos. No tubo B foram
colocados 3 mL de tampão fosfato 1 mmolL -1, pH 7,0, contendo 1% de uréia. Neste
tubo foram adicionados 1 mL da solução de urease fervida no tubo A e 1 gota de
vermelho de fenol. A mistura foi agitada e o produto foi observado 5 minutos
depois que a última agitação foi feita.
iv) O efeito de sais de mercúrio nas enzimas também foi observado. Em um tubo de
ensaio foram misturados 2 mL de água destilada e 2 gotas de solução de urease.
Depois foi adicionada 1 gota de cloreto de mercúrio a 0,01%. A mistura foi agitada
novamente e 3 mL de tampão fosfato 1 mmolL -1, pH 7,0, contendo 1% de uréia e 1
gota de solução de vermelho de fenol foram adicionados e agitados. O produto
desta mistura foi observado 5 minutos depois que a última agitação foi feita.
v) A especificidade da enzima foi testada com o auxílio de dois tubos, marcados como
A e B. No tubo A foram colocados 3 mL de tampão fosfato 1 mmolL -1, pH 7,0,
contendo 1% de uréia e 2 gotas de urease. No tubo B foram colocados 3 mL de
tampão fosfato 1 mmolL-1, pH 7,0, contendo tiouréia e 2 gotas de urease. Em ambos
os tubos, 1 gota de da solução de vermelho de fenol foi adicionado, as misturas
foram agitadas e as observações dos resultados foram feitas cinco minutos depois.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Figura 1. Tubos de ensaio contendo as soluções resultantes dos processos i, ii e iii

i) Reação do biureto
O biureto foi utilizado para que houvesse a caracterização de proteínas na amostra a ser
estudada. Ele detecta ligações peptídicas, que estão presentes nas proteínas, através da mudança
na coloração da amostra. No tubo A, contendo a urease, foi observada uma mudança de cor para
lilás; enquanto no tubo B a cor da solução continuou azulada pela falta de presença de proteínas
na solução.

ii) Teste de atividade de enzima

Neste teste foi utilizado o indicador vermelho de fenol, que passa de cor amarela, quando
em meio ácido ou neutro, para a cor vermelha, quando em meio alcalino. Este indicador é
utilizado na determinação de variação de pH. Para que essa variação fosse moderada, foi-se
utilizada uma solução tampão.

No tubo A pôde-se observar a mudança de cor na mistura contida nele, de amarelada para
alaranjada. Isso ocorreu devido à indicação da mudança de pH no sistema pela reação de
hidrólise que foi catalizada pela urease. Já no tubo B, a cor da mistura contida nele continuou
amarelada, pois não houve reação pela falta de uréia.

iii) Desnaturação de enzima pelo calor

Uma enzima pode ser desnaturada pela ação do calor. Com isso, as ligações peptídicas que
formam sua estrutura se rompem, fazendo com que ela se converta em sua unidade primária
(aminoácido).

A solução preparada mostrou uma coloração amarelada; o que significa que a enzima foi
completamente desnaturada, tendo como consequência o rompimento das ligações peptídicas
que constituíam sua estrutura. Quando ela foi comparada com a amostra preparada no
experimento (ii) que apresentou mudança na coloração e que foi preparada da mesma maneira,
exceto pela falta de aquecimento, foi confirmada a desnaturação da urease no tubo aquecido,
pois a coloração do tubo nesta etapa ficou alaranjada.

Figura 2. Tubos de ensaio contendo as soluções resultantes dos processos iv e v

iv) Inibição de enzima por sais de mercúrio

A solução obtida no tubo mostrou uma cor alaranjada, mostrando que não houve reação. O
sal de mercúrio tem a propriedade de desnaturar proteínas por conter um metal pesado em sua
composição, explicando a ausência de reação e, consequentemente, a falta de mudança de cor. 4
Esta solução foi, então, comparada a uma solução feita de forma similar, mas sem ter o cloreto
de mercúrio adicionado. O resultado foi uma solução cor-de-rosa, indicando a atividade
enzimática na solução.

v) Especificidade da enzima

A solução contida no tubo A mostrou que houve atividade enzimática pela mudança de cor
apresentada, já que o material ficou cor-de-rosa. Esse resultado foi esperado por haver uréia na
mistura e, como consequência da reação, houve a liberação de amônia, deixando o meio
alcalino. Já o conteúdo do tubo B não apresentou mudança de cor; sua coloração continuou
alaranjada, mostrando que não houve reação por causa da ausência de ureia na solução e
mostrando também que a urease reage especificamente com a uréia, não com outros compostos
como a tiouréia.

5. CONCLUSÃO

As enzimas têm função de catalizar reações químicas sem interferir nelas e são
fundamentais para o funcionamento do metabolismo e na produção em processos na indústria. A
partir dos experimentos realizados nesta aula prática, pôde-se observar que mudanças nas
condições do meio podem atrapalhar as reações, causando a desnaturação dessas enzimas.

Conclui-se, então, que para o uso deste material biológico, deve-se manter o controle das
condições dos processos, para que os resultados das reações sejam previstos e haja o mínimo de
perdas resultantes das reações feitas em pequena ou grande escala.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lehninger. Princípios de Bioquímica. 4 ed., São Paulo, SAVIER, 2006.
2. Enzimas. Pontífica Universidade Católica de Goiás – PUC Goiás. Disponível em
<http://professor.ucg.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/16673/material/Enzimas_B
IO.pdf> Último acesso em 01 Nov. 2014.
3. Urease – Aspectos Estruturais. Laboratório de Proteínas Tóxicas, Departamento de
Biofísica e Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul -
UFRGS, Rio Grande do Sul, Brasil. Disponível em <http://www.ufrgs.br/laprotox/o-
que-fazemos/linhas-de-pesquisa/ureases-aspectos-estruturais> Último acesso em 01
Nov. 2014

4. DE OLIVEIRA, G. et. al. Proteínas: Reações de Coloração e Precipitação.


Universidade Estadual de São Paulo – UNESP, 2010;
5. COELHO, M. A. Z.; AMARAL, P. F. F. Aplicações enzimáticas. Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
Disponível em <http://www.eq.ufrj.br/biose/nukleo/aulas/Enzimol%20Aplic/eqb706_aula_09.pdf>
Último acesso em 01 Nov. 2014.