MÉTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que

hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En
muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en
un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de
lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original
sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una
colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias
visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota
utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para
esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la práctica
correspondiente, que se suele realizar en la 3ª tanda).

Mientras tanto, y para luego repasar esa práctica, puedes realizar un experimento on-line
sobre crecimiento bacteriano

Precauciones:

para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de

cada dilución;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un indiviudo (y esto
es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el
recuento se refiere no a “células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia”
(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre todo en
bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el número real de
individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos
al ser sembrados en la placa.

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace

pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de
nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el
tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un
medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células
retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables
en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún

metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno
(QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el
respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la

práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos
consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida
a través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz,
al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto
Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites,
proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de

Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia
(una medida de la luz transmitida a través de la supensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la
masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la

partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a
longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida
para >107céls/ml.

b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado

en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la
luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el
espectrofotómetro.

MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS INSTRUMENTALES

La medición del crecimiento por métodos turbidimétricos resulta ser más rápido y útil, para
obtener una estimación del número de células o biomasa. Una suspensión celular aparece
turbia porque lascélulas dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células haya
más luz se dispersay más turbia aparece la suspensión. La turbidez puede medirse con un
fotómetro o unespectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la luz a través de una suspensión
celular y detectan lacantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos
instrumentos es que el fotómetroemplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul)
para generar luz incidente de una amplitudde onda relativamente ancha, mientras que el
espectrofotómetro emplea un prisma o red dedifracción para generar luz incidente de banda
estrecha. Sin embargo, ambos aparatos midensolamente luz no dispersada expresando los
resultados en unidades fotométricas (por ejemplo,Unidades Klett) o unidades de densidad
óptica (DO) para espectrofotómetro.Para organismos unicelulares, las unidades fotométricas
DO son proporcionales (dentro de ciertoslímites) a la masa celular y también al número de
células. Por tanto las medidas de turbidez puedenutilizarse como un sustituto para otros
métodos de contaje. Sin embargo y antes de utilizar laturbidez como método de contaje, hay
que realizar una curva estándar que relacione medidasdirectas (microscópicas o por recuento
en placa) con las unidades indirectas de turbidez (DO)(Francois

et al.

, 2007). Tales curvas contienen datos para número de células y masa celular,permitiendo la
estimación de ambos parámetros a partir de una sola medida de
la turbidez. A elevadas concentraciones de células, la luz dispersada de la unidad detectora pu
ede ser rescatada por otra (apareciendo a la fotocélula como si nunca se hubiese dispersado).
Cuando estoocurre, la correspondencia uno a uno entre número de células y turbidez pierde
linealidad. Sinembargo, dentro de ciertos límites, las medidas de turbidez pueden ser
razonablemente precisas yademás tienen la virtud de ser rápidas y fáciles de tomar.
Adicionalmente, las medidas de turbidez

Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicacionesteóricas y prácticasEnrique Alfonso

Cabeza Herrera, Ph.D.

Código

FMP V. 01

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Universidad de Pamplona

Facultad de Ciencias Básicas

Departamento de Microbiología

© 2013

pueden tomarse sin distorsionar mucho las muestras. Por estas razones, las medidas de
turbidez seemplean ampliamente para seguir el crecimiento de los cultivos microbianos; se
puede medir repetidamente la misma muestra y construir gráficos semilogarítmicos para
calcular tiempos degeneración. La población bacteriana puede determinarse midiendo la
turbidez del cultivo a diferentesintervalos de tiempo y confrontando estos resultados con
medidas directas de la población a losmismos intervalos de tiempo por ejemplo mediante
recuento directo en placa.El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como
porcentaje de transmisión (cantidad de luztransmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.),
valor derivado del porcentaje de transmisión,correspondiente al log del cociente entre la
intensidad de luz incidente sobre la suspensión (Io) y lade la luz transmitida por la suspensión
(I). A = log Io/I.Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo
líquido adecuado,generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay
un período de latencia. Unavez que empieza el crecimiento, se observa un incremento
exponencial en la densidad celular, quecorresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta
fase es la más significativa en el ciclo decrecimiento de los microorganismos y se caracteriza
porque los parámetros cinéticos del crecimiento(µ, k) se mantienen constantes. A medida que
el crecimiento avanza, la concentración de losnutrientes esenciales disminuye, y se acumulan
los productos finales del metabolismo, hasta que elcrecimiento llega a detenerse, de modo
que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las célulaslentamente se mueren, lisándose
en algunos casos, en una última fase de muerte celular

Método del Numero mas probable (NMP)

Es un método estadístico que se fundamenta en la teoría de la probabilidad.

En el Se preparan múltiples series de diluciones decrecientes, con cada dilución se inoculan

varios tubos que contienen el medio de cultivo adecuado.

Este método se utiliza para contarmicroorganismos difíciles de cultivar en medio solido, 0 Para
determinar el numero de Celulas que pueden creceren un medio liquido determinado, como el
análisis para determinarla contarninacion del agua potable.