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Meios de cultura

(Protocolo aula prática n.º 1)

Introdução
O sucesso na tecnologia e aplicação dos métodos de cultura in vitro
devem-se a uma melhor compreensão dos requerimentos nutricionais
das células e tecidos em cultura. Os dois factores que mas
frequentemente determinam o sucesso de uma cultura de tecidos
vegetais são a origem do explant e o meio nutritivo onde são
cultivados. O meio nutritivo esta composto por elementos essenciais e
por componentes opcionais.

Os nutrientes essenciais são: sais inorgânicas, os carbohidratos, as


vitaminas e pelas fito-hormonas ou reguladores de crescimento (tabela
1). Outros componentes, incluindo as fontes de azoto orgânico, ácidos
orgânicos e substâncias complexas, podem ser importantes em
determinadas culturas, mas são opcionais.

1. Sais inorgânicas. Os nutrientes inorgânicos das culturas de tecidos


são os normalmente requeridos pelas plantas. O azoto (N), Potássio
(K); Fósforo (P), Cálcio (Ca), Enxofre (S) e Magnésio (Mg) são
requeridos em quantidades milimolares (macro-nutrientes). A
concentração óptima de cada nutriente para alcançar taxas de
crescimento máximas, variam consideravelmente dependendo da
espécie, do tipo de cultura, etc. No entanto para a maioria das culturas
o meio nutritivo deverá conter entre 25 a 60 mM de azoto inorgânico.
As células vegetais podem crescer com nitrato (NO-3) como única
fonte de azoto, no entanto, frequentemente existe um efeito benéfico
com a adição no meio de cultura de amónio (NH4+), sendo para
algumas espécies um nutriente essencial. Outras fontes de azoto
reduzido podem também ser adicionadas ao meio de cultura. O nitrato
é normalmente usado em concentrações entre 25-40 mM. A
quantidade de amónio pode variar entre 2-20 mM. Possivelmente a
concentração óptima de amónio encontra-se entre 2-8 mM. As células
vegetais podem viver num meio onde a única fonte de azoto seja o
amónio, produzindo citrato, succinato, malato ou outro ácido do ciclo
TCA. Também é possível fazer crescer células vegetais com outras
fontes de azoto como são: ureia, glutamina, ou caseína hidrolisada.

O potássio, geralmente suplementado como nitrato de potássio ou


cloreto de potássio é requerido em concentrações de 20 ou mais mM.
As concentrações óptimas de P, Mg, Ca e S variam entre 1-3 mM
sempre e quando os outros requerimentos sejam satisfatórios para as
células em cultura. (DIZER APROX LA MOLARIDAD ...)

Os elementos que são requeridos em concentrações micromolares são


o Ferro (Fe), Manganês (Mn), Zinco (Zn), Boro (Bo), Cobre (Cu),
Molibdénio (Mo), pelo que são denominados micronutrientes. O Fe e o
Zn são normalmente incorporados como quelatos (EDTA, Etilen-
Diamin-Tretacetic-Acid). Também é importante a incorporação de
Cobalto (Co) e de Iodo (I) no meio.

As plantas toleram bem grandes quantidades de cloro (Cl) e de Sódio


(Na) no meio, e possuem aparente- mente efeitos na taxa de
crescimento das culturas.

2. Carbohidratos. A fonte standard de carbono é a sacarose. A glucose


e a fructose podem igualmente ser usadas. A glucose pode reemplazar
com êxito a sacarose em meios específico. Outros carbohidratos que
tem sido igualmente testados incluem a lactose, maltose, galactose, e
amido, no entanto, estes compostos são geralmente muito inferiores a
sacarose ou a glucose como fonte de energia. O sorbitol é usado em
cultura de células de macieira e noutras plantas da família das
Rosaceas. A sacarose é usada em concentrações entre 2-3%.

3. Vitaminas. As plantas no seu ambiente natural sintetizam as


vitaminas que são necessárias para o crescimento e desenvolvimento.
No entanto, quando as células ou tecidos de plantas são colocados em
cultura, algumas vitaminas tornam-se limitativas. Existe um
requerimento absoluto de tiamina. As bases biológicas para este
requerimento não tem sido ainda estabelecida. O crescimento das
culturas de tecidos vegetais é incrementado quando se adiciona ao
meio de cultura ácido nicotínico e priridoxina. Alguns meios também
contem pantotenato de cálcio e biotina, mas estas e outras vitaminas
(acido p-amino-benzoico, riboflavina, ácido ascórbico) que podem ser
adicionadas, não se consideram factores de crescimento limitativos.

4. Fitohormonas As citocininas e as auxinas são as duas classes de


compostos especialmente importantes na cultura de tecidos vegetais.
Algumas fitohormonas naturais (sintetizadas pelas próprias plantas)
são: o ácido indol-3-acético (IAA) e a zeatina (Z). Outras são
reguladores de crescimento sintéticos como é o caso do 2,4-D (2, 4
dichlorophenoxyacetic-acid) e o BAP (Benzylamino-purina?). Uma
auxina e nalguns casos uma (Ver tabela 1)

5 Azoto orgânico Entre os compostos usados como fonte de azoto


orgânico nos meios de cultura destacam-se a glutamina, asparagina e
adenina. A incorporação de azoto orgânico pode não ser necessária, no
entanto, é frequentemente benéfico a sua incorporação, como é o caso
da adição de L-glutamina. Na prática é corrente a adição de 0.02-0.1
% de caseína hidrolisada. As células vegetais podem tolerar
concentrações de mais de 8 mM de L-glutamina. Quando são
incorporados amino-ácidos isoladamente deve ter-se em consideração
o seu possível efeito inhibidor. Exemplos de amino-ácidos utilizados
são a glicina (2 mg l-1), asparagina (100 mg l-1), L-tirosina (100 mg l-
1), L-arginina e cisteina (10 mg l-1).

6. Ácidos orgânicos. As plantas não são capazes de utilizar ácidos


orgânicos como única fonte de carbono. São escassos os trabalhos de
investigação que se tem realizado para estabeler se os ácidos
orgâncios podem ser factores limitativos ao crescimento das células
em cultura. A adição de ácidos do ciclo tricarboxílico como malato,
citrato, succionato ou fumarato permite o crescimento de células
vegetais em amónio como única fonte de azoto. As células vegetais
toleram concentrações superiores a 10 mM destes compostos.

7. Substâncias complexas Uma grande variedade de extractos tem


sido usados. Entre eles hidrolisados de proteínas, extractos de
leveduras de malta, assim como preparados vegetais como
endosperma de milho, leite de coco, sumo de laranja e de tomate. Com
excepção dos hidrolisados de proteínas e do leite de coco, as outras
substâncias só são usadas como último recurso e frequentemente são
substituídas por nutrientes mais específicos. As substâncias
complexas, usadas em concentrações muito elevadas, podem afectar
de forma negativa o crescimento das culturas in vitro. É aconselhável
fazer um teste preliminar com concentrações que podem variar entre
0.1 a 1 g l-1, para avaliar o efeito no crescimento vegetal. O leite de
coco é frequentemente usado a 2-15 % (v/v).

8. Mio-inositol A maior parte dos meios de cultura contêm mio-inositol.


Este não é um requerimento absoluto, no entanto quantidades de
aproximadamente 100 mg l-1 incrementam

9 Carvão activado

Escolha do meio de
cultura
Uma grande variedade de meios de cultura tem sido testados (os de
uso mais corrente encontram-se no Anexo 1). Um meio de cultura é
identificado pela composição em sais minerais. As vitaminas,
hormonas e outros suplementos orgânicos variam amplamente com
respeito a sua composição e concentração. A escolha do meio de
cultura depende da espécie em questão e do propósito da cultura
(cultura de meristemas, organogénese, embriogénese somática, etc.).
O meio de Murashige e Skoog, 1962 (MS) é um meio universalmente
usado especialmente para morfogénese (Tabela I), cultura de
meristemas e regeneração de plantas. Este meio caracteriza-se pela
sua elevada concentração em sais minerais. O meio de Gamborg (B5)
contém quantidades mais baixas de sais minerais, o que parece ser
preferido pelas células de determinadas espécies (Tabela I)

Tabela I. Concentração molar dos nutrientes inorgânicos dos meios de Murashige e


Skoog (1962) e Gamborg (data).

Macronutriente (mM) MS B5
N (NO3) 40 25
N (NH4) 20 2.0
K 20 25
Mg 1.5 1.0
P 1.25 1.1
Ca 3 1.0
S 1.5 1.0

Micronutriente (uM)
Na - 61.1
Cl 6.0 2.0
I 5.0 4.5
B 100 50
Mn 30 7.0
Zn 1.1 1.0
Mo 0.1 0.15
Cu 0.1 0.1
Co
Fe

Característica dos meios de


cultura
Se bem os meios líquidos apresentam vantagens económicas
incontestáveis (sem ágar, sub-culturas mais rápidas por parte dos
técnicos, que não tem que posicionar as plantas como acontece num
meio sólido) eles são menos usados pelos laboratórios industriais
porque necessitam um sistema de agitação constante, nem sempre
fácil de instalar. A escolha entre um meio líquido e um meio sólido é
arbitrária e depende especialmente das possibilidades do utilizador,
mais que de considerações específicas. No entanto, nalguns casos é
benéfico a alternância de meios sólidos e líquido durante as diferentes
fases de desenvolvimento de uma cultura. A absorção de nutrientes é
variável de umj meios a outro, condicionando sem dúvida um
metabolismo diferente mas de um modo geral, os gradientes de
oxigénio jogam um papel determinante sobre a orientação do processo
da organogénese. Os meios solidificados com substâncias como: ágar,
agargel, fitagel, agarose, gelrite, etc. tanto a qualidade como a
quantidade são importantes e influenciam as culturas. A dureza do gel
obtido (ágar entre 6 a 10 g l-1) depende da concentração usada e do
tipo de substância seleccionada. O Difco-Bacto Agra (um dos mais
usados, pelas suas características) pode ser substituído com êxito por
outro ágar menos puro (mais barato) em laboratórios industriais. Um
gel duro, por excesso de ágar é frequentemente nefasto para o
crescimento dos tecidos. Por outra parte os meios de baixa
concentração em ágar perdem água facilmente por evaporação, sendo
por outro lado difícil manter neles os explants correctamente
posicionados. A escolha da quantidade de ágar resulta de um
compromisso entre um meio duro que minimize as perdas de água e
um meio mole que permite uma melhor difusão dos nutrientes. Para
uma mesma quantidade de ágar, os geles são mais ou menos
consistentes dependendo da acidez do meio. O pH é um factor
importante. O pH do meio (geralmente entre 5-6) é ajustado com KOH
ou NaOH logo da preparação do mesmo e prévia adição do ágar. O pH
do meio modifica-se durante a autoclavagem do mesmo (geralmente
acidifica) e durante o decurso da cultura. Os meios de pH baixo (4.5)
são geralmente usados em plantas que vivem normalmente em meios
ácidos como é o caso das Ericaceas.

Preparação de meios

Procedimento
Existem na prática duas formas de preparar meios de cultura: a)
preparar um litro de meio de cultura pesando e adicionando
sucessivamente cada um dos compostos; b) preparar um litro de
cultura a partir de soluções mães (stock) previamente preparadas e
armazenadas.

Preparação de uma solução stock de


macronutrientes
No existe uma regra geral para a preparação das soluções-stock, cada
laboratório pode desenvolver um protocolo próprio segundo as suas
necessidades. Assim a concentração das soluções stock de
macronutrientes podem ser 20, 50, 100 vezes concentradas. Os
micronutrientes dada as baixas quantidades em que são usados
devem ser preparados em soluções stock de concentrações superiores
a 500 vezes.

Tabela II. Soluções stock para o meio de MS

Macronutrientes Micronutrientes Vitaminas


stock Conc. stock Conc. stock Conc.
x10 final x100 final x500 final
Composto Composto Composto
(mg l- (mg l- (mg (mg l- (mg l- (mg l-
1 1 -1 1 1
) ) l ) ) ) 1)
Tiamina
NH4 NO3 16500 1650 Mn SO4.7H2O 2230 22.3 0.02 0.1
-HCl
Ac.
KNO3 19000 1900 H3BO3 620 6.2 0.10 0.5
Nicotínico
Piridoxina-
Ca Cl2 .2H2O 4400 440 CuSO4. 5H2O 2.5 0.025 0.10 0.5
HCl
KH2PO4 1700 170 CoCl2.6H2O 2.5 0.025 Glicina 0.40 2.0
Mio-
MgSO4.7H2O 3700 370 NaMoO4.2H2O 25 0.25 20 100
inositol
KI 83 0.83
ZnSO4 .7H2O 860 8.6
Adicionar 10 ml do stock Adicionar 1 ml por cada Adicionar 5 ml por litro
por cada litro de meio litro de meio para obter a de meio para obter a
para obter a concentração concentração final concentração final
final desejada desejada desejada

Preparação de uma solução stock de quelato de Ferro


(x10)
Para preprar uma solução stock de quelato de ferro 10 vezes
concentrada proceder da seguinte forma:

1. Dissolva 2.78 g de sulfato ferroso heptahidratado em 350 ml de


água destilada ou dibestilada.
2. Dissolva num outro recipiente 3.73 g de Na2-EDTA (Ácido-
etileno-diaminotetracético, sal di-sódica). Leve aquecimento é
recomendável.
3. Quando os dois componentes se tenham dissolvido
completamente, combinar ambas as soluções e levar o volume
final a 1 litro usando água destilada ou bidestilada. A solução
obtida deverá ser levemente amarela e transparente. A
concentração dos componentes usados na preparaçãp, baseia-se
na formulação de base do meio de Murashige e Skoog.

Armazenamento das soluções-


stock
As soluções stock deverão ser armazenadas em frascos de vidro ou
recipientes de plástico opacos (para evitar a alteração dos compostos
pela luz) e guardaos no frigorífico (0-4ºC). As vantagens dos plásticos
actuais (polistirene, polisulfone, por ex.) reside principalmente na
posibilidade de obter formas e dimensões bem adaptadas as
necessidades dos laboratórios e na sua ausência de contaminantes
iónicos.
As soluções stock de vitaminas deverão ser armazenadas no
congelador e descongeladas á temperatura ambiente

Preparação das soluções stock dos reguladores de


crescimento
As auxinas são geralmente usadas nas culturas de tecidos a
concentrações entre 0.01 - 10.0 mg l-1. Quando adicionadas nas
concentrações apropriadas regulam o alongamento e divisão celular, a
formação de raízes adventícias, inibição do aparecimento de rebentos
adventícios e axilares, iniciação de callus e crescimento e indução de
embriões.
As citocicinas são geralmente usadas a concentrações entre 0.1-10.0
mg l-1. Quando são adicionadas em quantidades adequadas regulam a
divisão celular, estimulam a proliferação de rebentos axilares e
adventícios, regulam a diferenciação celular, inibem a formação de
raízes, activam a síntese de RNAS e estimulam a actividade proteica e
enzimática.
Modo de Preparação. Para obter uma concentração final de 1.0 mg l-1
do regulador no meio de cultura pode proceder da seguinte forma:
Prepare uma solução stock de 1mg ml-1 do regulador que deseja
adicionar da seguinte maneira: (100 mg do regulador de crescimento
desejado a 100 ml de água numa proveta graduada. Adicione 2 - 5 ml
do solvente para dissolução do produto (gerlamente pó). Uma vez que
esteja completamente dissolvido complete o volume. Agite a solução
durante a preparação. Armazene segundo recomendado na tabela?.
Adicione 1.0 ml da solução stock a 1 litro de meio para obter uma
concentração final de 1.0 mg l-1 do regulador no meio de cultura.
A seguinte fórmula pode ser usada para efectuar cálculos de
concentrações e volumes desejados.
Quantidade do regulador desejado X volume do meio = Volume da
solução-stock requerida
Concentração da solução stock

Tabela III

B C A
Concentraçã Quantidade
Concentração da solução final (mg
o da solução a usar em
l-1)
stock ml
250 500 1 litro 2 litros 10 litros

0.01 mg l-1 0.1 0.004 0.002 0.001 0.0005 0.0001


0.5 0.02 0.01 0.005 0.0025 0.0005
1.0 0.04 0.02 0.01 0.005 0.001
10.0 0.4 0.2 0.1 0.05 0.01

0.1 mg l-1 0.1 0.04 0.02 0.01 0.005 0.001


0.5 0.2 0.1 0.05 0.025 0.005
1.0 0.4 0.2 0.1 0.05 0.01
10.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.1

1.0 mg l-1 0.1 0.4 0.2 0.1 0.05 0.001


0.5 2.0 1.0 0.5 0.25 0.05
1.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.1
10.0 40.0 20.0 10.0 5.0 1.0

10.0 mg l-1 0.1 4.0 2.0 1.0 0.5 0.1


0.5 20.0 10.0 5.0 2.5 0.5
1.0 40.0 20.0 10.0 5.0 1.0
10.0 400.0 200.0 100.0 50.0 10.0

Esterilização dos meios de


cultura
A esterilização dos meios de cultura é realizada por autoclavagem (em
geral 121ºC, 1 bar) dependendo o tempo mínimo de esterilização do
volume de meio no recipiente a esterilizar. A tabela II pode servir de
guia para determinar o tempo mínimo de esterilização para meios de
cultura.

Tabela IV. Tempo mínimo de esterilização em autoclave (121ºC, 1 bar)


para meios de cultura

Volume de Volume de
Tempo mínimo Tempo mínimo
meio meio
de de
por por
autoclavagem autoclavagem
recipiente recipiente
(min) (min)
(ml) (ml)
25 20 500 35

50 25 1000 40

100 28 2000 48

250 31 4000 63

Agentes
gelificantes
A tabela IV pode ajudar na selecção do tipo de agente gelificante
segundo o propósito da cultura in vitro a realizar.

Tabela V. Tipos de agente gelificantes, características e usos


recomendados.

Temp. Conteúdo iónico


Quantidad de pH (análise típco ICP)
e por litro gelif. a Cinzas Ca Mg
Descrição (g) ºC 1.5% % K P
7.0-
1. Ágar 6-12 32-35 2-5 0.30 0.10 0.01 0.01
7.5
2. Ágar 6.5-
6-12 32-39 3-7 0.17 0.09 0.08 _
Bacteriológico 7.5
7.2-
3. Ágar tipo A 6-12 26-28 5-6 0.01 0.01 0.1 0.17
7.7
7.5-
4. Ágar Tipo E 5-10 26-28 3-4 0.02 0.02 0.07 0.13
8.0
5. Ágar Tipo 7.0-
5-11 34-36 3-6 0.09 0.14 0.07 0.01
M 7.5
6. Ágar Alta 6.5-
4-8 34-37 3-4 0.03 0.07 0.09
Gelif. 7.0
7. Ágar 6.5-
6-12 30-35 2.0 0.02 0.01 0.01 0.01
Purificado 7.0
8. Ágar 7.0-
6-10 25-27 2.2 0.15 0.08 _ _
Lavado 7.5
7.0-
9. Agarose 6-10 26-30 <1 _ _ _ _
8.0
10 Ácido
Algínico
_ _ _ _ 0.17 0.01 2.3 _

7.2-
11. Agargel 3.5-5.0 26-28 4.5 0.25 0.06 0.04 0.08
7.7
6.5-
12. Phytagel 1.5-2.5 27-31 9.5 0.85 0.35 1.70 0.15
7.0