HIGIENE Y SANEAMIENTO

TRABAJO PRÁCTICO Nº2

“Evaluación de Desinfectantes Químicos”

Alumnas: Saldivar Cintia, Gisela Flores. Grupo 10

Objetivo: Evaluación de desinfectantes químicos por medio de los siguientes métodos:

 Coeficiente de fenol
 Prueba de capacidad de Kelsey-Sykes
 Ensayo de dilución – neutralización según AFNOR

PROCEDIMIENTOS:

Coeficiente de Fenol

En 5 tubos de ensayo estériles colocar:

Tubo 1 2 3 4 5
Fenol 2 2 2 2 1
Agua
4 5 6 7 4
destilada
Retirar (mL) 1 2 3 4 0
Concentración 1:60 1:70 1:80 1:90 1:100

Dejar estabilizar las diluciones a temperatura ambiente durante 5 minutos. Sembrar minuto a
minuto con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas en caldo TSB de Staphylococcus aureus ATCC 6538.
A continuación transferir una ansada calibrada a tubos con 10 ml de caldo TSB estéril, según el
protocolo adjunto:

Homogeneizar e incubar a 37°C.

Leer los resultados a las 48 y 72 horas registrando los tubos que muestren turbidez debida al
desarrollo microbiano.
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En otros 5 tubos de ensayo estériles colocar:

Tubo 1 2 3 4 5
p-cloroxilenol 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Agua
4,8 5,8 6,8 7,8 8,8
destilada
Retirar (mL) 0 1 2 3 4
Concentración 1:2500 1:3000 1:3500 1:4000 1:4500

Dejar estabilizar las diluciones a temperatura ambiente durante 5 minutos. Sembrar minuto a
minuto con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas en caldo TSB de Staphylococcus aureus ATCC 6538.
A continuación transferir una ansada calibrada a tubos con 10 ml de caldo TSB estéril con su
correspondiente antagonista de la actividad residual, según el protocolo indicado en la página
anterior.
Homogeneizar e incubar a 37°C.
Leer los resultados a las 48 y 72 horas registrando los tubos que muestren turbidez debida al
desarrollo microbiano.

Resultados:
Muestra utilizada para el ensayo: p-cloroxilenol.
El resultado del ensayo no dio lo esperado, ya que hubo crecimiento del microorganismo en todos
los tubos a sus respectivos tiempos. Se considera al ensayo inválido y se debería repetir.
Se esperaba ver en la serie de tubos de 10 minutos para ambos desinfectantes, la máxima
dilución en la cual NO se evidenciaba crecimiento microbiológico, pero Sí, en los tubos a los 5
minutos, y con esos valores se calcularía el coeficiente de fenol.
Por ejemplo, si los resultados hubiesen sido:

Fenol 5% 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100

5' - - + + +
10' - - - + +
15' - - - - +

p-cloroxilenol 1/2500 1/3000 1/3500 1/4000 1/4500

5' - - + + +
10' - - - + +
15' - - - - +

Se podría calcular el coeficiente de fenol de la siguiente manera:

C. F. = Dilución del desinfectante que produce la muerte microbiana en 10’ pero no en 5”.
Dilución del fenol que produce la muerte microbiana en 10’ pero no en 5’.
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C. F. = 3500/80 = 43,75

Lo cual indicaría que el p-cloroxilenol de ensayo es 43,75 veces más activo que el fenol.

Prueba de capacidad de Kelsey-Sykes

Desinfectantes a ensayar:
Condiciones Limpias:
Hipoclorito de sodio 0,00125 g% - 0,0025 g% - 0,005 g%

Condiciones Sucias:
Hipoclorito de sodio 0,5 g% - 1 g% - 2 g%

Microorganismos de ensayo:
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Preparar una suspensión del microorganismo de ensayo a partir de una estría “overnight” del
mismo, en un tubo de ensayo conteniendo 2 ml de agua destilada. Obtener un inóculo con una
densidad microbiana equivalente a la del tubo n° 9 de la escala de Mac Farlan (concentración: 2,7
x 109/ml).
Preparar el inóculo de trabajo colocando en un tubo de ensayo estéril:
a) condiciones limpias: 1 ml de la suspensión anteriormente preparada + 9 ml de agua destilada
estéril.
b) condiciones sucias en presencia de albúmina al 40%: 1 ml de la suspensión anteriormente
preparada + 8 ml de albúmina al 50% + 1 ml de agua destilada estéril.

Colocar en tubo de ensayo 3 ml de cada una de las tres diluciones del desinfectante a ensayar
rotulándose A – B – C (de menor a mayor concentración para condiciones limpias), y D – E – F
(de menor a mayor concentración para las condiciones sucias).

De acuerdo al esquema siguiente,

INOCULAR: agregar 1 ml del inóculo de trabajo al tubo con desinfectante que corresponda de
acuerdo a la letra indicada.
SEMBRAR: retirar 1 ml del tubo con el desinfectante que corresponda de acuerdo a la letra
indicada, y colocar 5 gotas en una caja de Petri conteniendo TSA con tiosulfato de sodio 0,05% y
desechar el volumen sobrante.
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Permitir que las gotas se absorban en el medio de cultivo, invertir e incubar a 37°C durante 48
horas. Determinar la concentración efectiva como aquella que luego del segundo agregado de
inóculo no permite el desarrollo de más de cinco colonias en el total de las 5 gotas sembradas.
Comparar los resultados obtenidos en condiciones limpias y sucias.

Resultados
El resultado no dio lo esperado, ya que en todas las placas se pondero más de 5 colonias en las 5
gotas. Se considera al ensayo inválido y se debería repetir. Se debería haber ponderado un
máximo de 5 colonias en las 5 gotas, determinándose la concentración efectiva.

3) Ensayo de dilución – neutralización según AFNOR

Desinfectante a ensayar:
Cloruro de benzalconio 0,0016 g% - 0,0032 g% - 0,0064 g%

Microorganismos de ensayo:
Staphylococcus aureus ATCC 6538

Preparar una suspensión del microorganismo de ensayo a partir de una estría “overnight” del
mismo en un tubo de ensayo con agua destilada estéril. Obtener un inóculo con una densidad
microbiana equivalente a la del tubo n° 9 de la escala de Mac Farlan (concentración: 2,7 x 109/ml).
Preparar el inóculo de trabajo efectuando una dilución 1:10 del inóculo anterior en agua destilada.
Realizar diluciones sucesivas hasta 10-5 (1ml + 9ml de agua destilada), y realizar una dilución 1:10
en un tubo conteniendo 9ml de neutralizante (Tween 80 al 3%). Sembrar en profundidad 1 ml en
dos cajas de Petri a las que se les agregará el medio de TSA previamente fundido y enfriado
(valor N).
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En un tubo de ensayo colocar 5 ml del desinfectante en una concentración doble de la que se va

a ensayar + 4 ml de agua destilada estéril + 1 ml del inóculo de trabajo. Dejar 5 minutos y luego
tomar 1 ml y colocar en un tubo de ensayo con 9 ml de neutralizante (Tween 80 al 3%). Dejar 5
minutos de tiempo de contacto y sembrar en profundidad 1 ml en dos cajas de Petri a las que se
les agregará el medio de TSA previamente fundido y enfriado (valor n).
Incubar las cajas de Petri a 37°C durante 48 horas.
Determinar la concentración de desinfectante para el microorganismo de ensayo que dé un
resultado de n≤N/10.

Resultados

Microorganismo utilizado: Escherichia coli ATCC 25922.

Solución desinfectante Muestra: Cloruro de benzalconio 0,0064%

ENSAYO ESPECIFICACIÓN RESULTADO VALOR DICTAMEN

n 1 = 20 UFC/placa n= 35
Neutralización n 2 = 50 UFC/placa N= 213 NO
n ≤ N/10
según N1 = 175 UFC/placa CUMPLE
ANFOR N2 = 252 UFC/placa

El desinfectante a la concentración del ensayo 0,0064% no cumple ya que no cumple la

relación: n ≤ N/10 (35 > 21)