LAB09-RECUENTODEMICROORGANISMOSENPLACAYNMP - Jessica, Gómez, Fernández

UNIVERSIDAD NACIONAL
MAYOR DE SAN MARCOS

Facultad de Ingeniería Geológica,
Minera, Metalúrgica y Geográfica
Escuela profesional de Ingeniería Ambiental
LABORATORIO N°9
RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN
PLACA Y NMP
INTEGRANTES:
Fernández Fuentes, Kevin 17160302
Gómez Chunga, Frank 17160127
Muñoz Mendoza, Jessica 17160318
DOCENTE:
Mg. Sánchez Rojas, Tito Libio
INSTRUCTORA:
Bach. Alonso Ochoa, Diana Vanessa
FECHAS DE LABORATORIO: 15,17/Oct/2018
FECHA DE ENTREGA: 15/Oct/2018
Ciudad universitaria, Lima- Perú
2018
TABLA DE CONTENIDO
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN _____________________________________________________________ 1
OBJETIVOS _________________________________________________________________ 2
FUNDAMENTO TEÓRICO ______________________________________________________ 3
DETALLES EXPERIMENTALES _________________________________________________ 6
CÁLCULOS Y RESULTADOS __________________________________________________ 11
DISCUSIÓN ________________________________________________________________ 16
CONCLUSIONES ____________________________________________________________ 17
RECOMENDACIONES _______________________________________________________ 17
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA ________________________________________________ 18
RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN
Pág. 01 PLACA Y NÚMERO MÁS PROBABLE
INTRODUCCIÓN
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en
un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta
técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el
medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno,
permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en
diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o
mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar
presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido
manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor
parte de los alimentos, pero para algunos productos, también es importante
determinar la presencia de bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o
psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes
condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian
las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles,
que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación
o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse
también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados,
desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo. El método
permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero
sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante
apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
 Identificar y realizar adecuadamente los métodos para el recuento de

microorganismos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus

implicaciones en la calidad del alimento.
 Establecer las condiciones microbiológicas de calidad sanitaria e

inocuidad que deben cumplir los alimentos y bebidas en estado
natural, elaborados o procesados, para ser considerados aptos para el
consumo humano.
 Identificar cuál de los métodos para el recuento de microorganismos
debe aplicarse para cada caso.
FUNDAMENTO TEÓRICO
A.- FLORA AERÓBIA MESOFILAS:
Bacteria que descompone la materia orgánica a temperaturas que oscilan entre 30 y

40 °C. El agua es utilizada como medio de eliminación de excretas y otros desechos;
puede también contener microorganismos patógenos de asiento no intestinales
(flora de la piel por ejemplo); estos son los llamadas bacterias mesofilicas.
Características:
 Se multiplican en aerobiosis.
 Temperatura de incubación entre los 20 y los 37°C
 Pueden ser patógenas o saprófitas
 Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas

contaminadas o tratamientos no satisfactorios desde el punto de vista
sanitario.
En los productos perecederos pueden indicar también condiciones inadecuadas de

tiempo/temperatura durante su almacenamiento.
La presencia de un número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien

a temperatura corporal o próxima a ella, significa que pueden haberse dado
condiciones favorables a la multiplicación de los microorganismos patógenos de
origen humano o animal.
Todas las Bacterias patógenas conocidas vehiculadas por los alimentos son mesófilas
y en algunos casos contribuyen con su presencia a los recuentos en placa
encontrados. (1)
B.- BACTERIAS COLIFORMES:
Los coliformes son peligrosos para el hombre, pero también destruyen materia
orgánica en procesos de tratamiento biológico en aguas residuales. Debido a que la
mayoría de los organismos patógenos que se encuentran en aguas residuales son
difíciles de aislar, los coliformes son más numerosos en este tipo de agua residuales,
y fácil de aislar a la vez, es utilizado como “organismo indicador de la
contaminación”; esto es, la presencia de organismos coliformes en un agua se toma
como indicador de la posible presencia de organismos patógenos. (Ramos,
Sepúlveda & Villalobos 2002, p.142)
Las bacterias Coliformes normalmente es encontrado en las heces de animales

homeotermos (mamíferos, aves) (2). Producen ácido láctico y ácido acético, bióxido
de carbono e hidrógeno a partir de la lactosa. En base a la formación de estos gases,
se puede determinar la presencia de bacterias Coliformes. La presencia de estas
indica además la existencia de bacterias patógenas. Forman este grupo las bacterias
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, que son microrganismos gram - negativos
anaerobios facultativos y que se encuentran generalmente en el intestino del hombre
y de los animales, en el suelo, en el heno, en el polvo, etc. (García 2000.p.15)
C. - ENTEROBACTERIAS:
La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de bacterias

gramnegativas. Reciben su nombre por la localización habitual como saprofitos en el
tubo digestivo, aunque se trata de gérmenes ubicuos, encontrándose de forma
universal en el suelo, el agua y la vegetación, así como formando parte de la flora
intestinal normal de muchos animales además del hombre. Escherichia coli, el
microorganismo más prevalente de esta familia, es una de las bacterias prototípicas
sometidas a estudio. En la tabla 1 se detallan los géneros y las especies de
enterobacterias con importancia clínica. En la tabla 2 se resumen las principales
características microbiológicas de la familia Enterobacteriaceae.
DETALLES EXPERIMENTALES
A.- BACTERIAS AERÓBICAS MESÓFILAS
A.1. MATERIALES:
 Ají amarillo
 Medio Plate count Agar (PCA)
 Solución salina 0.9
A.2. PROCEDIMIENTO:
1. Diluimos 1g de ají amarillo licuado en 9ml de solución salina.

2. Realizamos soluciones seriadas 10-1, 10-2 , 10-3 y 10-4 , las cuales se
realizaron en proporciones de 1:9, de carne y medio líquido
respectivamente, con ayuda de la pipeta y los tubos.
3. Escogimos 0.1 ml de cada dilución (alícuota), lo colocamos en un
medio Plate Count Agar (PCM) y lo extendimos por
diseminación.
4. Incubamos a una temperatura de 30°C , en un rango de 24-48
horas, con el contenido de pH 7.2
5. Contamos el número de colonias y realizamos el recuento de
viables en placa, el cual comparamos con la tabla de normativa de
DIGESA, con el fin de observar si se encuentra dentro de los
límites permisibles para el consumo humano.
B.- ENTEROBACTERIAS
B.1. MATERIALES:
 25g de carne molida
 225 ml de solución salina

 Agar McConkey
Fig. 1: 225ml de solución salina , tomada Fig. 2: Tres placas de Agar McConkey,
el 15/10/18 en el laboratorio de tomada el 15/10/18 en el laboratorio de
Microbiología por Muñoz Microbiología por Mitma
B.2. PROCEDIMIENTO
 Diluimos 25g de carne en 225 de solución salina y desmenuzamos los

pedazos grandes de la carne.
Fig. 3: 25g de carne en 225ml de

solución salina, tomada el 15/10/18 en el
laboratorio de Microbiología por Mitma.
 Realizamos soluciones seriadas 10-1, 10-2 , 10-3 y 10-4 , las cuales

realizamos en proporciones de 1:9 de carne y medio líquido
respectivamente, con ayuda de la pipeta y los tubos. Serán las soluciones
de concentraciones 10-3 y 10-4 las que serán sembradas por duplicado en el
agar McConkey.
Fig. 4: Soluciones seriadas, tomada el

15/10/18 en el laboratorio de
Microbiología por Mitma.

 Escogimos 0.1 ml de cada dilución (alícuota), lo colocamos en agar
McConkey y lo extendimos por diseminación.
Fig. 5: Diseminación en placa, tomada el

 Incubamos a una temperatura de 37°C , en un rango de 24-48 horas, con

el contenido de pH 7.2
 Realizamos el recuento de colonias viables en placa y comparamos la
cantidad hallada con la tabla de normativa de DIGESA, con el fin de
observar si se encuentra dentro de los límites permisibles para el
consumo humano.
Fig. 6: Muestra de una placa con

colonias de enterobacterias, tomada el
C.- COLIFORMES
B.1. MATERIALES:
 Agua residual
 Caldo Lauril sulfato de sodio (CLSS)
 Tubos Pursen
 Caldo de Brilla
B.2. PROCEDIMIENTO
1. Se sembró 5 tubos de 10ml con doble concentración, seguido de 5

tubos de 1ml y 5 de 0.1ml.
Fig. 7: Siembras en diferentes

disoluciones, tomada el 17/10/18 en el
2. Luego se incubó a 35°C por 48h y se observa su turbidez y el gas ( en

los tubos Pursen).
3. Se pasó a caldo Brilla, el cual es de color verde brillante y se volvió a
incubar a 35°C por 24horas.
Fig. 8: Se observó las burbujas en

tubos, tomada el 17/10/18 en el
laboratorio de Microbiología por
Mitma.
4. Comparamos los resultados con la tabla de DIGESA.
Fig. 9: Se observó las burbujas en

tubos, tomada el 17/10/18 en el
laboratorio de Microbiología por
Mitma.
CÁLCULOS Y RESULTADOS
A.- BACTERIAS AERÓBICAS MESÓFILAS
Fig. 10: Muestra de placas con colonias Fig. 11: Muestra de placa con
de bacterias aerobias mesófilas, tomada diseminación de 10-1 y sus colonias
el 17/10/18 en el laboratorio de formadas de bacterias aerobias
Microbiología por Mitma. mesófilas, tomada el 17/10/18 en el
Fig. 12: Muestra de placa con diseminación de 10-4 y sus colonias

formadas de bacterias aerobias mesófilas, tomada el 17/10/18 en
el laboratorio de Microbiología por Mitma.
Se observa que en la placa Petri de medio Plate Count Agar (PCM) proliferaron las
bacterias aerobias mesófitas en diferente proporciones de acuerdo a la disolución.
Encontramos:
-2 -3 -4
Placa 1 1104 812 85
Placa 2 1032 1092 72
Promedio 952 78.5
Las placas que usaremos son las que tuvieron la disolución de -4 ya que se
encuentran en el rango de 30 - 300 colonias según las recomendaciones de APHA.
Realizamos el recuento de viables en placa por siembra en superficie y usamos la

fórmula:
Promedio del número de colonias x factor de dilución x factor de alícuota = UFC/ml
8.5 x 104 x 10 = 8.5 x 105 UFC/ ml
El número de máximo permisible en especias, brindado por DIGESA es 105 UFC/

ml, nuestro resultado 9 x 105 UFC/ ml (se redondea) al ser mayor se identifica no
apto para el consumo humano.
Las muestras dieron positivo a prueba confirmatoria en el caldo Brilla, donde

pudimos notar turbidez y efervescencia, que indica la presencia del C02, un gas
producto de la fermentación láctica de los coliformes.
Fig. 13: Tubo brilla con presencia de

gas C02
 De los tubos sembrados en el caldo Brilla, se obtuvo los siguientes resultados para
coliformes totales:
DILUSIONES
10 ml (5tubos) 1 ml (5tubos) 0.1 ml (5tubos)
+ + +
 Para determinar el índice del NMP por 100 ml, utilizaremos la siguiente tabla:
 Los 15 tubos
fueron positivos a la prueba de coliformes totales en el agar Verde

Brilla y la tríada es la siguiente: 5 5 5, para encontrar el valor del índice
del NMP por 100ml buscamos esa tríada en la tabla, y en este caso es >
1600.
Todas las placas en las que se sembraron las muestras de carne molida
presentaron crecimiento de microorganismos. Observamos las diferencias
entre las placas sembradas y escogimos la placa de concentración 10-3.
Fig. 14: Muestra de placa 10-3 con colonias de

enterobacterias. Tomada el 17/10/18 en el
Fig. 15: Muestra de placa 10-3 con colonias

de enterobacterias y seleccionada para el
proceso de recuento de microorganismos.
Tomada el 17/10/18 en el laboratorio de
En la placa escogida era posible incluso observar e identificar a las bacterias capaces
de fermentar la lactosa (de color más oscuro) y aquellas que no (de color más claro y
con un halo ligeramente transparente).
10-3 10-4
Agar 1 109 15
Agar 2 60 7
Una vez hecho el recuento observamos que las placas cuya concentración fue 10-3 se
encuentran dentro del rango (30 - 300) por tanto las usamos en la fórmula.
Promedio del número de colonias x factor de dilución x factor de alícuota = UFC/ml
Promedio de colonias: 84.5

Factor de dilución: 103
Factor de alícuota: 10
Entonces: 84.5 × 103 × 10 = 84.5 × 104 ≅ 85 × 104 𝑈𝐹𝐶/𝑔
Según la norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad

sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano el límite
para la cantidad de Escherichia Coli (al que tomaremos como referencia para
enterobacterias en general) es de 50 UFC/g y por sobre 5x102 se considera riesgoso
para la salud.
DISCUSIÓN
Las elevadas concentraciones de bacterias coliformes fecales implican una carga de

excrementos de humano muy grande, superan en varios órdenes de magnitud los
LMP propuestos en la norma. Esto es lógico pues los límites corresponden a aguas
residuales tratadas, mientras que las aguas muestreadas del presente estudio no son
tratadas. El uso agrícola de estas aguas constituye una fuente de exposición,
principalmente en la producción de hortalizas, que se venden en el mercado local
El 100% de las muestras mostró presencia de coliformes según los Estándares de

Calidad Ambiental (ECA) para Agua en la categoría Riego de vegetales y la
subcategoría Agua para riego no restringido el máximo límite permisible es 1000
NMP/ 100ml y las muestras de agua que estudiamos dieron como resultado
presencia de coliformes >1600 NMP/100ml.
Las excesiva carga bacteriana encontrada en la muestra de carne molida indica una
evidente fuente de contaminación en algún momento del procesamiento de tal
producto lo que es alarmante pues esta clase de productos es de fines alimenticios.
Cada una de las placas analizadas dan muestra de una antinatural cantidad de
microorganismos atribuibles a la calidad de la carne, al tiempo en el que ha
permanecido en almacenamiento, al tratamiento realizado sobre la carne o a otros
factores.
El número de UFC’s fue de 85 × 104 , cifra que supera por mucho al límite
establecido de 5x102 UFC/g.
CONCLUSIONES
 La muestras utilizadas en cada uno de los métodos superaron los límites
establecidos por la normativa. Si bien es posible que los productos para la
muestra se hayan encontrado en un mal estado, fallas al momento de la
realización de los métodos no están fuera de discusión
 Los resultados arrojados por los métodos realizados indican una
alarmante contaminación de los alimentos y/o agua.
 A través del método de recuento en placa se obtuvo 85 × 104 UFC/g
para la muestra de carne molida.
RECOMENDACIONES
 Usar la ICMCF 1000 y el Standard Methods , guías sugeridas en el
laboratorio de microbiología.
 Al hacer el recuento, cuando observamos que en una placa se encuentran

una gran cantidad de microorganismos, dividimos imaginariamente la placa
y contamos una sección individualmente y la multiplicamos por el número
de divisiones.
 Al realizar los cálculos, se aproximan los resultados al entero más inmediato

a fin de mantener la individualidad de las bacterias.
 Para comparar los límites máximos permisibles se usa la tabla brindada por
DIGESA.
 Cuando queremos determinar el límite permisible de coliformes en el agua,

usamos el índice del NMP que usa 5 series de tubos.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
 EcuRed (2018) . Bacterias mesófilas. Recuperada el 21 de octrubre
del 2018 de https://www.ecured.cu/Bacterias_mes%C3%B3filas
(1)
 Vargas de Mayo C. CEPIS – Métodos simplificados de análisis
microbiológicos Coliforme Fecal. Determinación del número más
probable de coliforme fecal por la técnica de los tubos múltiples.
Lima, Perú. 1983. (2)
 Puerta-García A. & Mateos-Rodríguez F.. (2010). Enterobacterias.
Octubre 2018, 24, de Facultad de Medicia, UNAM. Sitio web:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Entero
bacterias_Medicine2010.pdf (3)
 ESTUDIO COMPARATIVO EN TÉCNICAS DE RECUENTO

RÁPIDO EN EL MERCADO Y PLACAS PETRIFILMTM 3MTM
PARA EL ANÁLISIS DE ALIMENTOS - ALONSO NORE LINA,
XIMENA POVEDA SANCHEZ, JEIMY ALEXANDRA -
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE
CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTÁ. DICIEMBRE DE 2008
 NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS

MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD
PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO-
PROYECTO DE ACTUALIZACIÓN DE LA RM N° 615-2003
SA/DM
 CONTAMINACIÓN POR COLIFORMES Y HELMINTOS EN LOS
RIOS TEXCOCO, CHAPINGO Y SAN BERNARDINO
TRIBUTARIOS DE LA PARTE ORIENTAL DE LA CUENCA DEL
VALLE DE MÉXICO Ricardo RIVERA-VÁZQUEZ1 , Óscar L.
PALACIOS-VÉLEZ

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FECHAS DE LABORATORIO: 15,17/Oct/2018

FECHA DE ENTREGA: 15/Oct/2018

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 Identificar y realizar adecuadamente los métodos para el recuento de

• Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus

 Establecer las condiciones microbiológicas de calidad sanitaria e

Bacteria que descompone la materia orgánica a temperaturas que oscilan entre 30 y

 Temperatura de incubación entre los 20 y los 37°C

 Pueden ser patógenas o saprófitas

 Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas

En los productos perecederos pueden indicar también condiciones inadecuadas de

La presencia de un número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien

B.- BACTERIAS COLIFORMES:

Las bacterias Coliformes normalmente es encontrado en las heces de animales

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de bacterias

 Medio Plate count Agar (PCA)

 Solución salina 0.9

1. Diluimos 1g de ají amarillo licuado en 9ml de solución salina.

 25g de carne molida

 225 ml de solución salina

 Diluimos 25g de carne en 225 de solución salina y desmenuzamos los

Fig. 3: 25g de carne en 225ml de

 Realizamos soluciones seriadas 10-1, 10-2 , 10-3 y 10-4 , las cuales

Fig. 4: Soluciones seriadas, tomada el

Fig. 5: Diseminación en placa, tomada el

 Incubamos a una temperatura de 37°C , en un rango de 24-48 horas, con

Fig. 6: Muestra de una placa con

 Caldo Lauril sulfato de sodio (CLSS)

1. Se sembró 5 tubos de 10ml con doble concentración, seguido de 5

Fig. 7: Siembras en diferentes

2. Luego se incubó a 35°C por 48h y se observa su turbidez y el gas ( en

Fig. 8: Se observó las burbujas en

4. Comparamos los resultados con la tabla de DIGESA.

Fig. 9: Se observó las burbujas en

Fig. 12: Muestra de placa con diseminación de 10-4 y sus colonias

Realizamos el recuento de viables en placa por siembra en superficie y usamos la

Promedio del número de colonias x factor de dilución x factor de alícuota = UFC/ml

8.5 x 104 x 10 = 8.5 x 105 UFC/ ml

El número de máximo permisible en especias, brindado por DIGESA es 105 UFC/

B.- BACTERIAS COLIFORMES:

Las muestras dieron positivo a prueba confirmatoria en el caldo Brilla, donde

Fig. 13: Tubo brilla con presencia de

10 ml (5tubos) 1 ml (5tubos) 0.1 ml (5tubos)

fueron positivos a la prueba de coliformes totales en el agar Verde

Fig. 14: Muestra de placa 10-3 con colonias de

Fig. 15: Muestra de placa 10-3 con colonias

Promedio del número de colonias x factor de dilución x factor de alícuota = UFC/ml

Promedio de colonias: 84.5

Entonces: 84.5 × 103 × 10 = 84.5 × 104 ≅ 85 × 104 𝑈𝐹𝐶/𝑔

Según la norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad

Las elevadas concentraciones de bacterias coliformes fecales implican una carga de

El 100% de las muestras mostró presencia de coliformes según los Estándares de

 Al hacer el recuento, cuando observamos que en una placa se encuentran

 Al realizar los cálculos, se aproximan los resultados al entero más inmediato

 Cuando queremos determinar el límite permisible de coliformes en el agua,

 ESTUDIO COMPARATIVO EN TÉCNICAS DE RECUENTO